異なる発生段階における小脳顆粒ニューロンのシナプス形成の可視化

マウスの生後初期および後期の段階から収集された事前に固定された脳組織スライスから始めます。

スライスには、蛍光タンパク質を発現する小脳顆粒ニューロン(CGN)が含まれています。

共焦点顕微鏡を使用して、単一の蛍光CGNに焦点を合わせます。

さまざまな深さで Z スタック画像をキャプチャして、ニューロンの 3 次元ビューを作成します。

イメージングソフトウェアを使用して、ニューロンの神経突起または樹状突起や軸索などの長い突起を追跡します。

細胞体から先端までの樹状突起の長さを測定します。

樹状突起の爪の形成、他のニューロンからの信号が受信される樹状突起先端の特殊な構造を分析します。

また、ニューロンの表面積と体積を評価します。

出生後初期には、ニューロンは樹状突起の数が増加し、爪の形成はありません。

一方、出生後後期には樹状突起の数は少なくなりますが、その長さと爪の数は増加します。

したがって、年齢とともに、CGNはシナプス形成を受け、シグナル伝達のために他の細胞との接続を形成します。

実験用子犬の矢状脳切片からの単一のエレクトロポレーションCGNの形態を研究するには、共焦点顕微鏡でスタックあたり0.5マイクロメートルのzスタック画像を撮影します。画像ウィンドウごとに1つのセルを画像化して、画像解析と3D再構成を容易にします。単純な神経突起トレーサーを使用して、神経突起の長さと樹状突起の爪の形成を盲検法で分析します。

エレクトロポレーションされたCGNのシングルチャネルスタック画像をフィジーにアップロードし、プラグイン、セグメンテーション、およびシンプルニューライトトレーサーをクリックします。ドロップダウンメニューから[新しい3Dビューアの作成]を選択します。細胞体細胞に接続する樹状突起の基部までスクロールし、接合部をクリックしてお風呂を開始します。セル塗りつぶし信号が最も明るいセクションをクリックし、Y を押してトレースを保持して、パスを手動でトレースします。

樹状突起の端までトレースし、Fを押して経路を確認します。または、爪の付け根までトレースします。次に、構造の基部から最も長い神経突起の端まで爪をたどります。2 次および 3 次ブランチをトレースするには、Windows では Control、Mac OS では Alt キーを押しながらパスをクリックします。Fを押してパスを確認します。トレースの測定値が別のウィンドウに表示されることを確認します。爪の枝のすべてのサイズを合計して、各爪の全長を求めます。