Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡
July 3rd, 2015
受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。
次の実験の全体的な目標は、標的ペアの空間的共局在を定量的に評価することであり、この場合は薬物誘発性受容体輸送を調べることです。これは、生きた培養細胞を薬物で処理して、変化した受容体輸送を誘導することによって達成されます。第2のステップとして、標的受容体および細胞内輸送コンパートメントの二重免疫標識により、マルチチャネル共焦点顕微鏡による標的ペアの空間的局在化が可能になります。
定量的共局在分析は、標的受容体とコンパートメントが同じ場所に見出される傾向を測定するために使用されます。その結果、薬物治療後の受容体輸送の変化は、受容体と細胞内輸送コンパートメントの共局在に基づいていることが示されています。この手法がオーバーレイ共局在のような既存の方法と比較した場合の主な利点は、共局在の定量的な測定が可能になることで、これによりはるかに強力な解析と複雑な実験デザインが可能になります。
この方法は、受容体の輸送に関する洞察を得ることができますが、培養細胞内の任意の2つのタンパク質の空間的共局在の変化にも適用できます。この手順を開始するには、元の増殖培地を取り出し、選択した濃度で目的の薬物を含む培地と交換します。次に、選択した処理期間、元の増殖条件で細胞をインキュベートします。
インキュベーション後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回、穏やかに洗浄します。細胞を300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで0.1モルPBSに37°Cで10分間固定します。その後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回再度洗浄します。
その後、細胞を300マイクロリットルのブロッキングバッファーで室温で2時間インキュベートします。その後、細胞を一次抗体と1次抗体と300μLの抗体希釈液中で4°Cで48時間インキュベートします。次に、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回、穏やかに洗浄します。
次に、Fluorに結合した二次抗体と300μLの抗体希釈液で細胞をインキュベートし、室温で1時間、細胞を光から保護します。1時間後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで3回ずつ穏やかに洗浄します。24ウェルプレートからカバースリップを取り外すには、プレートを45度保持します。
一対の細い鉗子の先端を、カバースリップの上端に井戸の床と接する場所に置きます。次に、洗浄バッファーのカバースリップを井戸の床からそっと傾けます。カバースリップはウェルウォールに寄りかかって固定され、鉗子で簡単に取り外すことができます。
次に、100倍高倍率対物レンズを使用して、細胞を下向きにして顕微鏡スライドにカバースリップをフェージング防止封入剤でマウントします。まず、落射蛍光を使用してイメージングする代表的な細胞を見つけます。次に、画像キャプチャ設定の [ラベル付けされた各チャネルの 8 ビット非圧縮 tiff 画像を記録する] を構成して、各チャネルを順番に画像化し、最終画像の平均スキャン数 4 から 6
回にします。次に、共焦点イメージングパスに切り替えて、細胞の中心を通るZ面に焦点を合わせます。各チャンネルのピンホールレーザー出力と光増倍管の電圧とオフセットを最適化します。これらの設定を記録し、同じ設定を使用して、任意のターゲットペアに標識されたすべての細胞をイメージングします。
同じReplicate next locator細胞を高倍率対物レンズでイメージングします。落射蛍光を使用して、共焦点イメージングパスに切り替え、可能な場合は細胞の中心を通るZ面に焦点を合わせます。ソフトウェアズームクロップ機能を使用して、スキャン領域を目的のセルに制限します。その後。
以前に設定した設定を使用して、ラベル付けされた各チャネルの画像をキャプチャし、この手順を繰り返して、反復ごとに条件ごとに15個以上の細胞を画像化します。十分なサンプル収集を確保するため。この手順では、画像 J のセルの画像のペアを開きます。「画像カラー結合チャネル」コマンドを使用して RGB 画像を生成します。
次に、目的のセルの周りを描きます。画像jプラグインを使用して、SC共局在化を行い、選択した細胞内のターゲットの共局在を定量化します。目的の共局在測定を記録し、各画像セルに対して手順を繰り返します。
次に、各ラベリング条件の各反復の共通制御条件の記録された共局在値の平均を計算します。平均にマイナス 1 を掛けると、各ラベリング条件の各レプリケートのオフセットが得られます。次に、各ラベル付け条件の各レプリケートのオフセットを、そのレプリケートの各共局在値に追加します。
これにより、各ラベリング条件の各反復で共通の制御条件の平均共局在測度がゼロになるようにデータが正規化されます。その後、各ラベリング条件のすべての反復からのすべてのデータにより、反復間の共局在の変化の分析が可能になります。ここに示されているのは、長期にわたる急性の薬物治療にさらされた後根神経節感覚ニューロンの主要な培養物です。次に、細胞をデルタオピオイド受容体および異なる一次二次抗体ペアを持つリサイクルエンドソームのマーカーについて免疫標識し、2チャネルシーケンシャル共焦点顕微鏡法でイメージングしました。
その後の定量的共局在化と分析に加えて、これらの代表的な画像を処理して、ここに示す偽色の共局在マップを生成しました。デルタオピオイド受容体と初期エンドソームのマーカーの平均共局在スコア、リサイクルエンドソーム、およびリソソーム受容体の各コンパートメントとの共局在は、異なる急性薬物治療を受けているグループ間で比較され、受容体輸送の薬物誘発性変化が観察されます。この手順を試行する際には、有効な定量分析を可能にするために、高品質で一貫性のある顕微鏡写真を取得することを忘れないでください。
このビデオを見れば、定量的なコローカリゼーション分析の実行方法について十分に理解できるはずです。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、免疫ラベリングとコロケーション分析を通じて薬物誘発性受容体トラフィッキングを定量的に評価する技術を提示します。薬物処理された生きた培養細胞を観察することで、多重チャンネル共焦点顕微鏡を用いて、標的受容体およびトラフィッキング区画の空間局在を分析します。
主要な研究要素
科学の領域
- 神経科学
- 細胞生物学
- 薬理学
背景
- 受容体トラフィッキングは、リガンドに対する細胞の反応性に影響を与えます。
- 細胞の状態は受容体トラフィッキングに影響を与える可能性があります。
- コロケーションの分析のための既存の方法は定量的尺度に欠ける可能性があります。
- 定量的コロケーション分析は実験設計を向上させることができます。
研究の目的
- 受容体とトラフィッキング区画の空間的コロケーションを評価すること。
- 薬物処理後の受容体トラフィッキングの変化を評価すること。
- 従来のオーバーレイコロケーションよりも強力な分析方法を提供すること。
使用した方法
- 受容体トラフィッキングの変化を誘発するために生きた培養細胞に薬物を処理すること。
- 標的受容体とトラフィッキング区画の二重免疫ラベリング。
- 空間局在のために多重チャンネル共焦点顕微鏡を使用すること。
- 受容体と区画の近接性を測定するために定量的コロケーション分析を適用すること。
主要な結果
- 薬物処理後の受容体トラフィッキングの変化を実証しました。
- コロケーションの定量的尺度を取得しました。
- 受容体とトラフィッキング区画は有意な空間的コロケーションを示しました。
- この技術は複雑な実験設計と分析を可能にします。
結論
- この技術は受容体トラフィッキングを研究するための堅牢な方法を提供します。
- 定量分析は薬物に対する受容体の挙動の理解を向上させます。
- このアプローチは神経科学と薬理学の様々な実験的文脈に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative colocalizational analysis of drug-induced receptor trafficking provides biopharma R&D teams with a robust, reproducible approach to interrogate receptor dynamics at the cellular level. This method enhances predictive confidence in target validation by enabling precise measurement of receptor localization changes in response to pharmacological interventions. Integrating these quantitative insights supports risk-adjusted decision-making at key discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of receptor trafficking mechanisms following drug exposure.
- Supports functional target validation by measuring spatial colocalization with intracellular compartments.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization and quantification of receptor-compartment interactions.
- Provides normalized, statistically analyzable data for robust hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible colocalization metrics for assay development.
- Enables high-content, quantitative readouts suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports scalability and platform reuse by applying the protocol to diverse receptor-compartment pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns receptor trafficking data with disease-relevant cellular models when applicable.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing quantitative endpoints.
- Reduces translational risk by linking drug-induced trafficking changes to functional cellular outcomes.
- Supports biomarker strategy development through spatial quantification of receptor localization.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative colocalizational analysis method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with downstream translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of drug effects on receptor trafficking and compartmentalization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative colocalization outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized colocalization scores for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of cellular trafficking data with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, broadly applicable workflow for diverse receptor and protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable quantitative outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to high-quality imaging instrumentation and analytical software (e.g., ImageJ with colocalization plugins).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging and analysis parameters.
- Adaptable to various cell types and receptor-compartment pairs with protocol optimization.
- Dependent on acquisition of high-quality, consistent micrographs for valid quantitative analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Drug Treatment of Cultured Cells and Immunocytochemistry
3:26
Microscope Settings and Imaging
4:57
Colocalization Analysis and Data Normalization
6:17
Results: Representative Photomicrographs of Receptor and Compartment-marker Labeling with False-color Colocalization Maps
7:18
Conclusion
