Name: Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶ薬物誘発性受容体トラフィッキングの定量共局在解析法。培養細胞を用いた免疫蛍光標識と共焦点顕微鏡で、受容体と細胞内小器官の空間的局在変化を評価し、神経科学・薬理学研究に応用可能な強力な定量的手法を示す。

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この作品はCMCEWOにCIHR（MOP394808）とカナダの研究の椅子からの助成金によってサポートされていましたNSERCから大学院奨学金の受取人でした。

注：このプロトコルは、様々な単層メッキ細胞/組織培養モデル、薬物治療計画、およびラベリングの対象と広く互換性があります。したがって、実際の使用では、多くの特定のパラメータは、実験計画に基づいて変化します。ここでは、これらのユーザ定義パラメータへの参照は、一般的なものです。代表的な結果を得るために使用される例示的条件は、イタリック体に含まれています。 1.ソリューション<ol><li> 0.1Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水および0.05％ポリソルベート20を混合することにより、洗浄用緩衝液を調製します。 RTでpHを7.4。 </li><li>ブロッキングバッファーを準備します。 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水、0.05％ポリソルベート20、3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1％冷魚皮ゼラチンを追加し、室温でpHを7.4に調整します。 </li><li> 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水に0.05％ポリソルベート20、1％BSA、0.1％冷魚皮ゼラチンを添加することにより、抗体希釈液を調製し、4 O℃でpHを7.4に調整 注：トリス緩衝液のpHは温度依存性です。つまり、温度変化は、溶液のpHが変化し、あります。一貫性を保つため、これらのバッファは常に、それらが使用される温度でpH調整すべきです。 </li></ol> 2.細胞培養注：適切な細胞培養プロトコルが使用される細胞型（単数または複数）に基づいて変化します。これらの手順は、個別に最適化する必要があります。詳細な細胞培養方法は、16を含め、容易に入手可能です。同様の手順は、顕著な違いで、代表的な結果を得るために使用しました。 <ol><li>成体動物由来の培養後根神経節ニューロン12を説明したように。細胞を培養するために、成体ニューロンの増殖培地を使用してください。むしろグルタミン酸よりも、プレプレーティングによってグリア細胞密度を減らします。これは、少なくとも30〜60プレートあたりのニューロンとapproximatに成長に伴うグリア細胞と12ラウンドのガラスカバースリップ上で増殖させた混合ニューロン - グリア培養をもたらしますエリー40％の密集度。これは、初代培養神経細胞は複製されないことに留意すべきであるとグリアを過剰増殖させる場合、共培養グリアによってプレートから離れてプッシュされます。ニューロンへの影響を回避するために、グリア数の物理的減少は、化学的/薬理学的方法に好適です。 注：このプロトコルの目的のために、私たちは目的の細胞は、それらの実験的に所望の状態と単層メッキに成長していることを前提としています。我々は、24ウェルプレートに12ラウンドのガラスカバースリップ上にプレーティングすることは最も便利であることがわかります。記載されているすべてのボリュームおよび手順は、24ウェルプレートの1つのウェル内の1つのカバーガラスに適しています。 </li></ol>培養細胞の3薬物治療注：複数の連続、または重複は、薬物治療が可能です。薬、用量/濃度、および使用される露光の持続時間は、特定の実験に依存することになります。 <ol><li>元の成長培地16を削除</SUP&gt;と選択された濃度（s）で、目的の薬剤（複数可）を含む培地に交換してください。この場合には、モルヒネの10μMの生理食塩水に可溶化またはコントロールとして生理食塩水を使用してください。 注：これは、それぞれ独立して複製（一般に、単一の24ウェルプレート培養）は、同じ共通の制御条件が含まれていることが重要です。これは、試行間の変動を補正する、反復間でのデータの正規化を可能にします。 </li><li> 48時間16元の成長条件で細胞をインキュベートします。 </li><li>その後の薬物治療のために、繰り返しがデルトルフィン1μM、SNC80 1μM、または車両と3.1と3.2のステップと60分12インキュベートします。水にデルトルフィンIIを可溶化し、40μMのHClおよび超音波処理中に10mMでSNC80を可溶化、水中で1 mMのに希​​釈しました。 注意：このプロトコルは、それらが選択された増殖培地中で所望の濃度（複数可）に溶解させてもよいことは、薬剤（単数または複数）は、可溶化されているのを前提としています。のための適切な手順このような可溶化は問題の薬物に依存して変化し、個別に最適化する必要があります。 </li><li> 1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、静かに3回細胞を洗浄します。 （洗浄緩衝液で、この場合には）必要に応じて、静かに、新鮮な溶液とよく補充、ウェルから液体を吸引し、その後速やかに、そして静かにして、各洗浄を行います。 </li></ol> 4.固定および免疫細胞化学注：特定の標識ターゲットは実験により異なります。説明したように私たちの使用時には、我々は、デルタオピオイド受容体（DOR）とRab5の、ラブ11、およびランプ1のラベル。使用される特定の抗体は特定の実験に依存することになります。最適な標識条件は、（IES）が使用される特定の抗体に依存しています。このトピックの多くのより完全な議論は以下の通りです。 <ol><li> 37ºCで10分間〜0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で300μlの4％パラホルムアルデヒドを浸漬することによって細胞を固定。 注：これは、4％のパラことが重要ですホルムアルデヒドを新たに起因以前に凍結パラホルムアルデヒドの使用によって引き起こされる自家蛍光に調製すること。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li> RTで2時間ブロッキング緩衝液300μlの細胞をインキュベートします。 </li><li> 4ºCで48時間、抗体希釈液300μlの中で一次抗体で細胞をインキュベートします。私達の使用において、一次DORに対する抗体（ウサギ抗DOR）との1：Rab5の（マウス抗Rab5の）、ラブ11（マウス抗Rab11が）、およびLAMP1（ヤギ抗LAMP1）。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li>異なる蛍光体にコンジュゲート二次抗体を用いて細胞をインキュベートし、室温で1時間、抗体希釈液300μlの中（下の説明を参照）。この、およびその後のすべての段階では、光から細胞を保護します。代表的な結果を得るためには、緑色発光蛍光団結合抗ウサギとeithを使用ER赤色発光蛍光団結合抗マウスまたは赤色発光蛍光団結合抗ヤギ。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li> 〜45°でプレートを保持し、各ウェル中の洗浄バッファー〜1ミリリットルを残して24ウェルプレートから12ラウンドのカバーガラスを外し、細かい鉗子を使用して、井戸床から離れカバースリップをレバー。カバーガラスは、それが簡単に鉗子を使用して除去することができる場所から、ウェル壁に対して休むようになってきます。 </li><li>退色防止封入剤でスライドする顕微鏡に、カバーガラス、細胞側を下にしてマウントします。 </li></ol> 5.顕微鏡の設定<ol><li>高倍率の対物レンズ（100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化される代表的なセルを探します。 </li><li> 例えば使用した各蛍光体の検出、488 nmおよび59（ラベル付けされた各チャネルの8ビット非圧縮のTIFF画像を記録する画像キャプチャの設定を行います4 nm）は、各チャンネルを順次画像に（いずれかの行またはフレーム）によって、最終的な画像の平均4〜6スキャンします。最適な画像の解像度は、顕微鏡に固有になりますが、1024×1024は、一般的に良好な結果が得られます。 </li><li>共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。 </li><li>ピンホール（典型的には1エアリー単位）、レーザパワー、および光電子増倍管電圧（ゲイン）を最適化し、各チャンネルのオフセット。これらの設定を記録/保存します。同じ複製内の任意のターゲットのペアのために標識され、すべてのセルを画像化するために同じ顕微鏡の設定を使用します。 注：このプロセスは、通常、このセルは、解析のために画像化されるべきではないことに十分な光退色になります。 </li></ol> 6.イメージング<ol><li>高倍率の対物レンズ（ 例えば 、100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化されるべきセルを探します。 </li><li>共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。私利用可能なfは、目的の細胞にスキャン範囲を制限するために、ソフトウェアのズーム/トリミングを使用しています。 </li><li>以前に確立された設定を使用して、各標識されたチャネルのための画像をキャプチャします。繰り返し、十分なサンプルを確保するために、複製ごとの条件当たり6.1から6.3イメージへの15以上の細胞を繰り返します。 </li></ol> 7.共局在解析<ol><li>一対の画像を開きます（ たとえば 、「グリーン」と「赤」）ImageJの中の細胞の。 RGB画像を生成するには、コマンド...&gt;カラー&gt;チャンネルをマージ画像を使用してください。 </li><li>目的の細胞の周囲に選択範囲を描画します。選択したセル内のターゲットの共局在を定量化するために、（https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/から入手できる11）「PSC共局在を「プラグインのImageJを使用してください。 </li><li>目的の共局在尺度（典型的には、ピアソンのR 17）を記録します。繰り返しは、各画像形成されたセルのための7.1から7.3のステップ。 </li></ol&gt; 8.データの正規化<ol><li>各標識条件の各反復の共通の制御条件の記録共局在値の平均を計算します。 注：例えば、ニューロンの共局在値の平均「48時間の車、60分車「3標識条件（受容体と3区画のそれぞれ）のそれぞれに3つの独立した反復のそれぞれにおける薬物条件。 </li><li>それぞれのオフセットを得るために（-1）を乗算する手段は、各標識状態で複製します。その複製の各共局在値に各ラベリング状態で各反復のオフセットを追加します。 注：これは一般的な制御条件の平均共局在の尺度は、各標識条件の各反復で0になるようにデータを正規化します。 </li><li>各標識条件のすべての複製からのデータをプール。 注：共局在の変化は今複製渡って分析することができます。統計肛門ysisは実験計画に依存するが、一般的に、適切な事後検査（ 例えば 、テューキー）が続く（ANOVA）分散分析を伴います。統計的リソースについては、 例えば 、18を参照してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、成人の後根神経節ニューロンの初代培養物（一次感覚ニューロン）の分析のためにこのプロトコルを最適化しました。また、広く、単層メッキ培養細胞について、ほとんど、またはまったく変更することなく、使用することができます。 colocalizational分析しかし、薬物治療、および組織固定/製剤成分は適切ではない、組織切片および他のそのような調製物11も可能です。 興味深いのは、ここに提示ICC方法にかかわらず、その後の分析（ 例えば、19）の、組織切片中の二重標識免疫組織化学を実行するために、適切な固定および組織調製物も使用することができます。 このプロトコルは、異なる標識ターゲットと広く互換性があります。播種した細胞の各カバーガラスは、二重標識されます。通常、これは、目的の受容体および目的の区画のうちの一つのマーカーのためのものです。そこ通常、複数の異なる区画を有する受容体の共局在を調べるために、複数の標識条件となります。 <p class="jove_...

受容体、特にGタンパク質共役受容体（GPCR）は、日常的に、細胞表面1から、細胞内トラフィッキングされます。これらの複雑に画策し、厳密に制御プロセスは、細胞の利用可能な受容体の相補体を決定し、受容体の時間的活動、脱感作、および再感作2調節- 4。重要なことに、これらの方法は、薬物誘発性受容体活性または非アクティブを含む細胞環境に応答します。つまり、受容体におけるリガンドのアクションは、それによって細胞の応答性を変化させること、これらの受容体の細胞内輸送を変更することができます。このように、外部のリガンドも、古典的なメッセンジャーツーエフェクターカスケード5,6超え、細胞機能にさらにより効果を発揮します。 誘導された受容体の輸送におけるこのような変化を調べることは困難です。すべての利用可能な技術には制限が伴います。ビオチン保護アッセイは、MONIするために使用されていますTOR表面受容体集団。これらの受容体は、ビオチン化され、免疫沈降の時間経過は、時間をかけて、ビオチン化受容体の減少を定量化するために行われます。この技術は、本質的に受容体7の初期、標識された、人口の緩やかな低下を監視し、このプロセスの時間のコースを構築する上で非常に有用です。残念ながら、このアッセイは、内在、リサイクル、または新規の受容体などの受容体のオリジナルプールの劣化以外のプロセスを監視することができません。また、50kDaの範囲の受容体への150kDaの範囲内の抗体の添加は、受容体のトラフィッキング8,9を変更することができ、この技術は、低発現レベルの受容体で使用することは困難です。 他の手順は、細胞内輸送区画（ 例えば、エンドソームなど）を特定し、目的の受容体との共局在を評価するために様々な方法を使用します。これは、私たちを含みます受容体および区画マーカーの蛍光タンパク質タグ付きキメラ構築物（ 例えば、ラブファミリーGTPアーゼ）を発現する異種系の電子。これは、潜在的に固定および透過処理に関連する問題を除去する、生細胞イメージングの使用を可能にします。複数の生理学的に代表的な細胞型と人身売買の動作と互換性がない上のタグおよび発現レベル効果：強力な一方で、このような戦略は、一般的には、異種システムの同じ制限を受けます。もっと一般に、染料が容易に細胞内区画を標識するために使用される（ 例えば、リソソーム、表向きは）10。染料は、しかし、（リソソームのための染料の場合には、すべての酸性オルガネラ）の特異性を欠くことができ、他の区画を通じて人身売買を評価しません。さらに、これらの技術は、システムおよび実験条件にわたってかなりの制御を可能にし、以下、本明細書に提示共局在分析方法から利益を得ることができます。 w法ここで本eは共局在によって受容体輸送の追跡を洗練します。適切なマーカーを標識するために免疫細胞化学（ICC）を使用して、複数の異なる細胞内区画を同定することが可能です。これはまた、異種システムの代わりに、生理的に関連の初代細胞培養物を使用することができます。このICCプロトコルは、標識の前に目的の細胞を固定することを含みます。これは、薬物治療（単数または複数）は、以下の特定の時点での標識を可能にします。これは、その時点でグローバル受容コンパートメントアソシエーションの「スナップショット」を作成します。複数の時点では、トラフィッキングの変化の時間経過をも構成することができます。 簡単に述べると、細胞を、受容体および興味のある細胞内区画のために標識された薬剤処理し、共焦点画像化され、そして顕微鏡写真は、数学的に、受容体コンパートメント11の共局在化を定量するために分析されています。私達の使用では、Raが、受容体の共局在を調べましたB5、Rab11が、リソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）。これらのマーカーは、それぞれ、初期エンドソーム、リサイクルエンドソーム、およびリソソームを識別します。これらの共局在化対策は内在、リサイクル、分解12の包括的なプロセスのためのプロキシとして機能します。 すべての技術と同様に、いくつかの制限が考慮されるべきです。によるすべての個々のニューロンが解析された画像へのニーズに、この技術は、関連する条件および時点の数に応じて、非常に労働集約的になることができます。すべての免疫標識はまた、固定および透過性13によって引き起こされる細胞の超微細構造、タンパク質の局在化、およびエピトープのアクセシビリティへの影響に対応しなければなりません。 もともと一次感覚ニューロンの初代培養物での使用に最適化しますが、この方法は、他の単層メッキ培養モデルと広く互換性があります。 数学的に定量化さmeasurの使用共局在のeは特に、はるかに方法論的に、多くの場合、視覚的に検査し、マルチチャネルのオーバーレイ14のような漠然とした、主観的な措置に依存してきた受容体輸送の変化を評価するために使用される従来の技術よりも厳格です。 この技術は、（前の初代培養の世代に）in vivoでの介入（培養増殖中）、in vitroでの介入との幅広い互換性のために特に有用であり、種々の標識は15を対象としています。このように、多くの異なった研究課題に適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>牛血清からのアルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>冷水魚からのゼラチンスキン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G7041-100G</td><td></td></tr><tr><td>コーニング コスター 細胞培養プレート: 24 ウェル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>720084</td><td></td></tr><tr><td>12 サークル 顕微鏡カバー ガラス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>1254580</td><td></td></tr><tr><td>アクア/ポリマウント</td><td>ポリサイエンス</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム モノベーシック</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸塩二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763-500G</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Polysciences</td><td>00380-1</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子 - スタンダード/デュモクセル</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 DOR 抗体</td><td>MyBioSource</td><td>MBS316175</td><td>1:1,500 マウス</td></tr><tr><td>抗 Rab5 抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7904</td><td>1:750 で使用</td></tr><tr><td>マウス抗Rab11抗体</td><td>ミリポア</td><td>05-853</td><td>1:500で使用</td></tr><tr><td>ヤギ 抗LAMP1抗体</td><td>サンタクルス</td><td>SC8098</td><td>1:750で使用</td></tr><tr><td>ロバ 抗ウサギ アレクサ488 標識抗体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-21206</td><td>1:200〜1:2,000で使用</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス アレクサ594標識抗体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11005</td><td>1:200〜1:2,000で使用</td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ アレクサ594 標識抗体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11058</td><td>1:200〜1:2,000で使用</td></tr></tbody></table>

colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

受容体の細胞内輸送は、複雑で高度に制御されたプロセスの集合体です。受容体輸送は、シグナル伝達とリガンドに対する細胞全体の応答性を調節し、それ自体が、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞内および細胞外の条件の影響を受けます。このプロトコルは、単層めっき培養細胞での使用に最適化されていますが、浮遊組織スライスに拡張可能で、免疫標識および共局在分析を使用して、外因性薬物治療を含む慢性/長期および急性の介入後の細胞内受容体輸送の変化を追跡します。薬物治療後、細胞は受容体と目的の細胞内コンパートメントのマーカーに対して二重免疫標識されます。次に、シーケンシャル共焦点顕微鏡法を使用して、個々の細胞の2チャンネル顕微鏡写真をキャプチャし、コンピューター化された共局在分析を受けて定量的な共局在スコアを算出します。これらのスコアは、統計解析の前に独立した反復をプールできるように正規化されています。代表的な顕微鏡写真は、例示的な図を生成するために処理されることもあります。ここでは、誘導された受容体輸送を定量的に評価するための強力で柔軟な手法について説明します。

この技術を使用して、長時間/慢性および急性の薬物治療の両方を、次の受容体内在化後の輸送の変化を定量化することが可能です。薬物治療、固定、および標識した後に、高解像度の2チャンネルの顕微鏡写真は、興味のある各セルの捕捉されます。代表的な画像は、説明の図（ 図1）を生成する偽色の共局在と組み合わせることができます。その後のcolocalizational分析、説明したように、ターゲット·ターゲット共局在化（ 例えば、受容体コンパートメントマーカー）の定量的なスコアが得られます。これらのデータは、薬物治療（S）（ 図2）により誘導される受容体のトラフィッキング、この場合には、変化を比較するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52824/52824fig1.jpg" /> FALと受容体との区画マーカー標識の図1.代表的な顕微鏡写真<...

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

本実験の全体的な目的は、標的ペアの空間的な共局在を定量的に評価することであり、本例では薬剤誘発性の受容体トラフィッキングを検証します。これは、培養生細胞を薬剤で処理し、受容体トラフィッキングの変化を誘導することで達成されます。第2ステップとして、標的受容体と細胞内トラフィッキングコンパートメントの二重免疫染色を行い、その後、マルチチャンネル共焦点顕微鏡を用いて標的ペアの空間的局在を特定します。定量的な共局在解析は、標的受容体とコンパートメントが同一箇所に存在する傾向を測定するために用いられます。その結果から、受容体と細胞内輸送コンパートメントの共局在に基づいた、薬剤投与後の受容体輸送の変化を明らかにできます。オーバーレイ共局在などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、共局在を定量的に測定できる点にあり、これにより、より強力な解析や複雑な実験デザインが可能になります。この手法は受容体のトラフィキングに関する知見を得るために有効ですが、培養細胞内におけるほぼ任意の2つのタンパク質の空間的な共局在の変化にも適用可能です。本手順を開始するには、元の増殖培地を除去し、選択した濃度の目的薬を含む培地と交換します。次に、選択した処理時間の間、元の増殖条件下で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、洗浄バッファーを1 mLずつ用いて、細胞を3回穏やかに洗浄します。0.1 M PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド 300 µLを用いて、37 °Cで10分間細胞を固定します。その後、再び洗浄バッファーを1 mLずつ用いて、細胞を3回洗浄します。続いて、細胞を300 µLのブロッキングバッファー中で室温で2時間インキュベートします。その後、300 µLの抗体希釈液で調製した一次抗体とともに、細胞を4 °Cで48時間インキュベートします。次に、1 mLの洗浄バッファーを用いて、細胞を1回につき緩やかに3回洗浄します。次に、Fluor結合二次抗体を300 µLの抗体希釈液で加え、室温で1時間、遮光して細胞をインキュベートします。1時間後、洗浄バッファー1 mLを用いて細胞を優しく3回洗浄します。24ウェルプレートからカバーガラスを取り出す際は、プレートを45度の角度に傾けて保持してください。微細鑷子の先端を、カバーガラスの上端とウェルの底面が接する部分に置きます。次に、洗浄バッファー中でカバーガラスをウェルの底面から離れるようにゆっくりと傾けます。カバーガラスがウェルの壁面に寄りかかるので、そこで鑷子を用いて簡単に取り出すことができます。次に、100倍の高倍率対物レンズを用いて、細胞を下に向けた状態で、抗退色封入剤を使用してカバーガラスを顕微鏡スライドに封入します。まず、エピ蛍光法を用いて、撮影対象となる代表的な細胞を探します。次に、画像キャプチャ設定を行い、各ラベル化チャネルを順次撮影し、最終的な画像として4〜6回のスキャンを平均化するように、各チャネルの8ビット非圧縮TIFF画像を記録します。次に、共焦点イメージングパスに切り替え、細胞の中心を通るZ平面に焦点を合わせます。各チャネルについて、ピンホール、レーザー出力、およびフォトマルチプライヤーチューブ（PMT）の電圧とオフセットを最適化します。これらの設定を記録し、特定のターゲットペアで標識されたすべての細胞のイメージングに同じ設定を適用してください。同一レプリケート内で、高倍率対物レンズで撮影するロケーター細胞を特定します。エピ蛍光を用い、共焦点イメージングパスに切り替えて、可能であれば細胞の中心を通るZ平面にフォーカスを合わせます。ソフトウェアのズームクロップ機能を使用して、スキャン領域を目的の細胞に制限します。その後。以前に設定した条件を用いて、各ラベルチャネルの画像をキャプチャし、条件ごとおよびリプリケートごとに15個以上の細胞を撮影するまでこの手順を繰り返して、十分なサンプル数を確保します。この手順では、ImageJで1つの細胞のペア画像を開きます。「Image」→「Color」→「Merge Channels」コマンドを使用して、RGB画像を生成してください。次に、目的の細胞を囲むように描画します。ImageJプラグインのSC colocalizationを用いて、選択した細胞内におけるターゲットの共局在を定量化します。必要な共局在指標を記録し、各画像の細胞に対してこの手順を繰り返します。次に、各標識条件の各レプリケートにおける共通コントロール条件で記録された共局在値の平均値を算出します。その平均値に-1を掛け、各標識条件の各レプリケートにおけるオフセット値を求めます。その後、各標識条件の各レプリケートのすべての共局在値に、それぞれのレプリケートのオフセット値を加算します。これにより、各標識条件の各リプリケートにおいて、共通対照群の共局在指標の平均値がゼロになるようにデータが標準化されます。その後、各標識条件のすべてのリプリケートからのすべてのデータを用いて、リプリケート間での共局在の変化を解析することが可能になります。ここに示しているのは、長時間および急性の薬剤処理を施した後根神経節感覚ニューロンの一次培養細胞です。その後、細胞をδオピオイド受容体およびリサイクリングエンドソームのマーカーに対して、それぞれ異なる一次・二次抗体ペアで免疫標識し、2チャンネル連続共焦点顕微鏡を用いて撮像しました。その後の定量的な共局在解析に加えて、これらの代表的な画像は、ここに示す擬似カラー共局在マップを生成するために処理されました。δオピオイド受容体と、初期エンドソーム、リサイクリングエンドソーム、およびリソソームのマーカーとの各コンパートメントにおける受容体共局在の平均共局在スコアを、異なる急性薬剤投与を受けた群間で比較し、薬剤誘発性の受容体トラフィッキングの変化を観察します。この手順を行う際は、妥当な定量解析を可能にするため、高品質で一貫性のある顕微鏡写真を取得することが重要です。このビデオを視聴することで、定量的な共局在解析の実施方法について十分に理解できるはずです。

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。...

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

ここでは、アンジオテンシンII治療によって開始エンドサイトーシスの間に緑色蛍光タンパク質タグ付きアンジオテンシン1a型受容体を発現画像セルにプロトコルを提示します。この技術は、第二の蛍光マーカーで標識リソソームを含み、その後時間をかけて立体的に受容体とリソソームの共局在を分析するためのソフトウェアを利用します。...

共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

このプロトコルは、哺乳動物細胞におけるGタンパク質共役受容体（GPCR）内在化の共焦点顕微鏡検出を記載します。これは、基本的な細胞培養、トランスフェクション、および共焦点顕微鏡手順を含み、融合発現GPCRの細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。...

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

神経細胞の興奮は、遠藤の動的過程と興奮性イオン型グルタミン酸受容体の開口放出を変調することができます。表面と内部の受容体人口プールを定量化するためのアクセス可能な高アッセイは、ここで説明しました。...

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。...

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。...

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

GPCRは、魅力的な薬剤の標的であることを考えると、GPCRリガンドスクリーニングは、リード化合物の同定や脱孤児化研究に不可欠です。これらの取り組みに向けて、TEVベースのレポーターアッセイを用いて約300...

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

学ぶ薬物誘発性受容体トラフィッキングの定量共局在解析法。培養細胞を用いた免疫蛍光標識と共焦点顕微鏡で、受容体と細胞内小器官の空間的局在変化を評価し、神経科学・薬理学研究に応用可能な強力な定量的手法を示す。

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

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