Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

本実験の全体的な目的は、標的ペアの空間的な共局在を定量的に評価することであり、本例では薬剤誘発性の受容体トラフィッキングを検証します。これは、培養生細胞を薬剤で処理し、受容体トラフィッキングの変化を誘導することで達成されます。第2ステップとして、標的受容体と細胞内トラフィッキングコンパートメントの二重免疫染色を行い、その後、マルチチャンネル共焦点顕微鏡を用いて標的ペアの空間的局在を特定します。

定量的な共局在解析は、標的受容体とコンパートメントが同一箇所に存在する傾向を測定するために用いられます。その結果から、受容体と細胞内輸送コンパートメントの共局在に基づいた、薬剤投与後の受容体輸送の変化を明らかにできます。オーバーレイ共局在などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、共局在を定量的に測定できる点にあり、これにより、より強力な解析や複雑な実験デザインが可能になります。

この手法は受容体のトラフィキングに関する知見を得るために有効ですが、培養細胞内におけるほぼ任意の2つのタンパク質の空間的な共局在の変化にも適用可能です。本手順を開始するには、元の増殖培地を除去し、選択した濃度の目的薬を含む培地と交換します。次に、選択した処理時間の間、元の増殖条件下で細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、洗浄バッファーを1 mLずつ用いて、細胞を3回穏やかに洗浄します。0.1 M PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド 300 µLを用いて、37 °Cで10分間細胞を固定します。その後、再び洗浄バッファーを1 mLずつ用いて、細胞を3回洗浄します。

続いて、細胞を300 µLのブロッキングバッファー中で室温で2時間インキュベートします。その後、300 µLの抗体希釈液で調製した一次抗体とともに、細胞を4 °Cで48時間インキュベートします。次に、1 mLの洗浄バッファーを用いて、細胞を1回につき緩やかに3回洗浄します。

次に、Fluor結合二次抗体を300 µLの抗体希釈液で加え、室温で1時間、遮光して細胞をインキュベートします。1時間後、洗浄バッファー1 mLを用いて細胞を優しく3回洗浄します。24ウェルプレートからカバーガラスを取り出す際は、プレートを45度の角度に傾けて保持してください。

微細鑷子の先端を、カバーガラスの上端とウェルの底面が接する部分に置きます。次に、洗浄バッファー中でカバーガラスをウェルの底面から離れるようにゆっくりと傾けます。カバーガラスがウェルの壁面に寄りかかるので、そこで鑷子を用いて簡単に取り出すことができます。

次に、100倍の高倍率対物レンズを用いて、細胞を下に向けた状態で、抗退色封入剤を使用してカバーガラスを顕微鏡スライドに封入します。まず、エピ蛍光法を用いて、撮影対象となる代表的な細胞を探します。次に、画像キャプチャ設定を行い、各ラベル化チャネルを順次撮影し、最終的な画像として4〜6回のスキャンを平均化するように、各チャネルの8ビット非圧縮TIFF画像を記録します。

次に、共焦点イメージングパスに切り替え、細胞の中心を通るZ平面に焦点を合わせます。各チャネルについて、ピンホール、レーザー出力、およびフォトマルチプライヤーチューブ（PMT）の電圧とオフセットを最適化します。これらの設定を記録し、特定のターゲットペアで標識されたすべての細胞のイメージングに同じ設定を適用してください。

同一レプリケート内で、高倍率対物レンズで撮影するロケーター細胞を特定します。エピ蛍光を用い、共焦点イメージングパスに切り替えて、可能であれば細胞の中心を通るZ平面にフォーカスを合わせます。ソフトウェアのズームクロップ機能を使用して、スキャン領域を目的の細胞に制限します。その後。

以前に設定した条件を用いて、各ラベルチャネルの画像をキャプチャし、条件ごとおよびリプリケートごとに15個以上の細胞を撮影するまでこの手順を繰り返して、十分なサンプル数を確保します。この手順では、ImageJで1つの細胞のペア画像を開きます。「Image」→「Color」→「Merge Channels」コマンドを使用して、RGB画像を生成してください。

次に、目的の細胞を囲むように描画します。ImageJプラグインのSC colocalizationを用いて、選択した細胞内におけるターゲットの共局在を定量化します。必要な共局在指標を記録し、各画像の細胞に対してこの手順を繰り返します。

次に、各標識条件の各レプリケートにおける共通コントロール条件で記録された共局在値の平均値を算出します。その平均値に-1を掛け、各標識条件の各レプリケートにおけるオフセット値を求めます。その後、各標識条件の各レプリケートのすべての共局在値に、それぞれのレプリケートのオフセット値を加算します。

これにより、各標識条件の各リプリケートにおいて、共通対照群の共局在指標の平均値がゼロになるようにデータが標準化されます。その後、各標識条件のすべてのリプリケートからのすべてのデータを用いて、リプリケート間での共局在の変化を解析することが可能になります。ここに示しているのは、長時間および急性の薬剤処理を施した後根神経節感覚ニューロンの一次培養細胞です。その後、細胞をδオピオイド受容体およびリサイクリングエンドソームのマーカーに対して、それぞれ異なる一次・二次抗体ペアで免疫標識し、2チャンネル連続共焦点顕微鏡を用いて撮像しました。

その後の定量的な共局在解析に加えて、これらの代表的な画像は、ここに示す擬似カラー共局在マップを生成するために処理されました。δオピオイド受容体と、初期エンドソーム、リサイクリングエンドソーム、およびリソソームのマーカーとの各コンパートメントにおける受容体共局在の平均共局在スコアを、異なる急性薬剤投与を受けた群間で比較し、薬剤誘発性の受容体トラフィッキングの変化を観察します。この手順を行う際は、妥当な定量解析を可能にするため、高品質で一貫性のある顕微鏡写真を取得することが重要です。

このビデオを視聴することで、定量的な共局在解析の実施方法について十分に理解できるはずです。