Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

次の実験の全体的な目標は、標的ペアの空間的共局在を定量的に評価することであり、この場合は薬物誘発性受容体輸送を調べることです。これは、生きた培養細胞を薬物で処理して、変化した受容体輸送を誘導することによって達成されます。第2のステップとして、標的受容体および細胞内輸送コンパートメントの二重免疫標識により、マルチチャネル共焦点顕微鏡による標的ペアの空間的局在化が可能になります。

定量的共局在分析は、標的受容体とコンパートメントが同じ場所に見出される傾向を測定するために使用されます。その結果、薬物治療後の受容体輸送の変化は、受容体と細胞内輸送コンパートメントの共局在に基づいていることが示されています。この手法がオーバーレイ共局在のような既存の方法と比較した場合の主な利点は、共局在の定量的な測定が可能になることで、これによりはるかに強力な解析と複雑な実験デザインが可能になります。

この方法は、受容体の輸送に関する洞察を得ることができますが、培養細胞内の任意の2つのタンパク質の空間的共局在の変化にも適用できます。この手順を開始するには、元の増殖培地を取り出し、選択した濃度で目的の薬物を含む培地と交換します。次に、選択した処理期間、元の増殖条件で細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回、穏やかに洗浄します。細胞を300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで0.1モルPBSに37°Cで10分間固定します。その後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回再度洗浄します。

その後、細胞を300マイクロリットルのブロッキングバッファーで室温で2時間インキュベートします。その後、細胞を一次抗体と1次抗体と300μLの抗体希釈液中で4°Cで48時間インキュベートします。次に、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで毎回3回、穏やかに洗浄します。

次に、Fluorに結合した二次抗体と300μLの抗体希釈液で細胞をインキュベートし、室温で1時間、細胞を光から保護します。1時間後、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで3回ずつ穏やかに洗浄します。24ウェルプレートからカバースリップを取り外すには、プレートを45度保持します。

一対の細い鉗子の先端を、カバースリップの上端に井戸の床と接する場所に置きます。次に、洗浄バッファーのカバースリップを井戸の床からそっと傾けます。カバースリップはウェルウォールに寄りかかって固定され、鉗子で簡単に取り外すことができます。

次に、100倍高倍率対物レンズを使用して、細胞を下向きにして顕微鏡スライドにカバースリップをフェージング防止封入剤でマウントします。まず、落射蛍光を使用してイメージングする代表的な細胞を見つけます。次に、画像キャプチャ設定の [ラベル付けされた各チャネルの 8 ビット非圧縮 tiff 画像を記録する] を構成して、各チャネルを順番に画像化し、最終画像の平均スキャン数 4 から 6

次に、共焦点イメージングパスに切り替えて、細胞の中心を通るZ面に焦点を合わせます。各チャンネルのピンホールレーザー出力と光増倍管の電圧とオフセットを最適化します。これらの設定を記録し、同じ設定を使用して、任意のターゲットペアに標識されたすべての細胞をイメージングします。

同じReplicate next locator細胞を高倍率対物レンズでイメージングします。落射蛍光を使用して、共焦点イメージングパスに切り替え、可能な場合は細胞の中心を通るZ面に焦点を合わせます。ソフトウェアズームクロップ機能を使用して、スキャン領域を目的のセルに制限します。その後。

以前に設定した設定を使用して、ラベル付けされた各チャネルの画像をキャプチャし、この手順を繰り返して、反復ごとに条件ごとに15個以上の細胞を画像化します。十分なサンプル収集を確保するため。この手順では、画像 J のセルの画像のペアを開きます。「画像カラー結合チャネル」コマンドを使用して RGB 画像を生成します。

次に、目的のセルの周りを描きます。画像jプラグインを使用して、SC共局在化を行い、選択した細胞内のターゲットの共局在を定量化します。目的の共局在測定を記録し、各画像セルに対して手順を繰り返します。

次に、各ラベリング条件の各反復の共通制御条件の記録された共局在値の平均を計算します。平均にマイナス 1 を掛けると、各ラベリング条件の各レプリケートのオフセットが得られます。次に、各ラベル付け条件の各レプリケートのオフセットを、そのレプリケートの各共局在値に追加します。

これにより、各ラベリング条件の各反復で共通の制御条件の平均共局在測度がゼロになるようにデータが正規化されます。その後、各ラベリング条件のすべての反復からのすべてのデータにより、反復間の共局在の変化の分析が可能になります。ここに示されているのは、長期にわたる急性の薬物治療にさらされた後根神経節感覚ニューロンの主要な培養物です。次に、細胞をデルタオピオイド受容体および異なる一次二次抗体ペアを持つリサイクルエンドソームのマーカーについて免疫標識し、2チャネルシーケンシャル共焦点顕微鏡法でイメージングしました。

その後の定量的共局在化と分析に加えて、これらの代表的な画像を処理して、ここに示す偽色の共局在マップを生成しました。デルタオピオイド受容体と初期エンドソームのマーカーの平均共局在スコア、リサイクルエンドソーム、およびリソソーム受容体の各コンパートメントとの共局在は、異なる急性薬物治療を受けているグループ間で比較され、受容体輸送の薬物誘発性変化が観察されます。この手順を試行する際には、有効な定量分析を可能にするために、高品質で一貫性のある顕微鏡写真を取得することを忘れないでください。

このビデオを見れば、定量的なコローカリゼーション分析の実行方法について十分に理解できるはずです。