Name: 単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 13 s
Description: 学ぶ単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析。生細胞表面の受容体可動性と複合体サイズを可視化し、膜ドメイン内の受容体組織化と動的相互作用を明らかにする手法です。

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このプロトコルの開発は、欧州研究会議(Advanced Grant TOPAS to M.J.L.)とDeutsche Forschungsgemeinschaft(Grants CA 1014/1-1 to D.C.およびSFB487 to M.J.L.)からの助成金によって支援されました。T.S.はAlexander von Humboldt Foundationによって支援されました。

1。サンプルの調製<ol><li>カバーガラス清掃 注：ヒュームフードの下で動作します。 <ol><li>個々のカバースリップを分離し、カバースリップホルダーにガラス製カバースリップ（直径24mm）を配置するためにきれいなピンセットを使用してください。 </li><li>ビーカーにカバースリップでホルダーを置き、カバーグラスがカバーされるまで、クロロホルムを追加します。室温で1時間にわたり浴超音波処理器中で蒸発し、超音波処理を減らすためにアルミホイルでビーカーをカバーしています。ビーカーからカバースリップホルダーを取り、カバーグラスを乾燥させます。 </li><li>代わりにクロロホルムを5M NaOH溶液でステップ1.1.2を繰り返します。 </li><li>新しいビーカーにカバースリップホルダーを取り、蒸留水で3回洗浄する。 100％エタノールを充填したガラス細胞培養プレート中で洗浄し、カバースリップを置く。 </li></ol></li><li>キャリブレーションサンプルの調製<ol><li>適切な溶媒に蛍光染料を溶解させる。 </li><li>までの蛍光色素の1:10連続希釈液を調製1時から1 nMのフィルタに（0.22μm）の水を滅菌した。 </li><li> 100％エタノールに保存掃除カバースリップを取り、フィルター滅菌水で洗う。スポット別々に洗浄カバースリップ上の各蛍光色素希釈液20μl。カバーグラスを滅菌フードの下で乾燥させます。使用するまで、光とホコリからカバースリップを保護します。単一の蛍光分子（ステップ3を参照）の強度を推定するために、これらのサンプルを使用しています。 </li></ol></li><li>トランスフェクション<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した1時01分ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12で培養CHO細胞（DMEM/F12）、100 U / mlペニシリンおよび37℃で100μg/ mlのストレプトマイシン、内5％のCO 2 注：自家蛍光を最小限にするために、実験を通じてフェノールレッドを含まない培地を使用してください。 </li><li> 、100％エタノール溶液から清浄カバースリップを取り、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれらを洗浄し、6ウェル細胞培養plの各ウェルに1カバースリップを置く食べた。 </li><li>トリプシン処理は、カウントし、3×10 5細胞/ウェルカバースリップを含有する6ウェル細胞培養プレート中の密度でシードCHO細胞。細胞が約達成するために、24時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）で成長しましょう。トランスフェクションのための最適な細胞密度は80％コンフルエント。 </li><li>各ウェルには、（ 例えば 、2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグ）所望のプラスミドDNAの2μgのを希釈し、500μlのOptiMEM培地を含む2別々のチューブ内の6μlのリポフェクトアミン2000。室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1チューブにステップ1.3.4からのソリューションを組み合わせて、トランスフェクション混合物を得るために混ぜる。室温で20分間トランスフェクション混合物をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション（1.3.5）の間に、CHO細胞を取得し、予め温めた（37℃）PBSで二回洗浄する。 1ミリリットル/ 10％FBSを添加したフェノールレッドを含まないDMEM/F12培地のよくなく、抗生物質なしで、PBSを交換してください。 </li><li>全体トランスフェクトを追加イオン混合物を穏やかに各ウェルに滴下して、ステップ1.3.5（1 ml）を加え、完全な混合を確実にするためにプレートを前後に揺する。 </li><li> CO 2 5％、37℃で2〜4時間インキュベートし、次のステップに直後に進むNOTE：これらのトランスフェクション条件は、受容体密度を達成するために最適化された&lt;単一のに適している0.45個/μm2で、分子イメージング。異なるセル、構築物または試薬を使用する際に調整が必要になることがあります。 </li></ol></li><li>タンパク質標識<ol><li> 1μMの最終濃度を得るために、10％FBSを補充した1ミリリットルDMEM/F12培地中のフルオロフォア-BGストック溶液1μlを希釈する。インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を取り、あらかじめ温めておいた（37℃）PBSで2回洗浄します。 1μMの蛍光団のBG溶液1mlを含むPBSを交換し、37℃、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、細胞を3を洗浄10％FBSを補充したDMEM/F12培地中、37℃で5分間インキュベートした各時間に回ピンセットで（標識された細胞との）カバースリップを取り、イメージング室に配置します。 </li><li> 300μlの撮像緩衝液で2回洗浄する。新鮮なイメージングバッファー300μlのを追加し、画像化（その2）にすぐに進んでください。 </li></ol></li></ol> 2画像の取得 注：全反射蛍光を使用してください（TIRF）顕微鏡、油浸高開口数の対物レンズ（ 例えば 、100X magnification/1.46開口数）を装備した、適切なレーザ（例えば405nm、488nmの、561 nmおよび645ナノメートルダイオードレーザ）、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ、インキュベーター、単一蛍光分子を可視化する温度制御。 <ol><li> すなわち 、所望の顕微鏡のパラメータを設定します。、レーザーライン、全反射角度が（このパラメータは、溶込みを制御エバネッセント場の深されたTiON）、露出時間、フレームレート、動画10あたりの画像数。温度ドリフトや結露を避けるために、常にオンヒーター/インキュベーターと温度制御を維持する。 </li><li>顕微鏡の100倍の対物レンズにイマージョンオイルの滴を入れてください。顕微鏡の試料ホルダーに標識した細胞を画像化室を配置し、明視野照明を使用して焦点の細胞をもたらす。 </li><li>全反射照明に切り替えます。しかし、同時に、所望の細胞を探索する光退色を最小にできるように、できるだけ低いレーザパワーを保つ。 </li><li>所望のセルを選択し、細かいピントを調整します。シングルフルオロフォアの可視化を可能にするレベルにレーザーパワーを設定します。画像シーケンスを取得し、。TIFFなどの生イメージシーケンスファイルを保存します。 </li></ol> 3。キャリブレーション（ガラス及び単量体/二量体受容体のコントロールにシングルフルオロフォア） <ol><li>各校正SAMPLを組み立てるイメージングチャンバーに1.2で説明したように、電子用意しました。顕微鏡で各サンプルを配置し、単一のステップで漂白十分に分離回折限界スポットを含むサンプルを選択します。 注：これらのスポットは、蛍光色素の単一分子を表す。 </li><li>工程2に記載されTIRF画像シーケンスを取得する重要 ：同じ撮像パラメータは、較正のためのものも含め全ての実験に使用されなければならない。 </li><li> 4.1から4.2に詳述され検出および追跡分析を行う。 4.2.6で説明したように各粒子の強度を抽出します。これらのデータから、平均値（μ）および単一蛍光体の強度の標準偏差（σ）を計算します。 </li><li> オプション：単量体細胞表面受容体（ 例えば CD86）をトランスフェクトした細胞上で同じ分析を行い、N-末端SNAP 10の1つまたは2つのいずれかのコピーで標識して蛍光団-BG誘導体で標識された。 Folloガラス上の単一のフルオロフォアのために上記の手順ワット。 Calebiro、D. らの説明に従って、標識効率を推定する。10 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>画像シーケンスの準備<ol><li>画像をトリミングする画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJは ） を使用します。 </li><li>独立した個々のフレームを保存します。TIFF画像を新規フォルダに、各画像フレーム番号に示す。 </li><li>細胞の輪郭に沿って関心領域（ROI）を描き、ImageJの内のメジャーツールまたは別のソフトウェアで同様のツールを使用して、細胞表面の面積を測定する。細胞表面面積でムービーの冒頭粒子の総数で割ることによって粒子密度を計算するためにこの値を使用します。 </li></ol></li><li>粒子検出および追跡 注：このようなU-トラック 13として使用する非商用のソフトウェアは、MATLABでの作業自動的に検出し、単一の受容体粒子を追跡するための環境を、。 注：U- トラックアルゴリズムは、複数の仮説の追跡手法に基づいています。このアプローチは、1フレーム内で指定された粒子は、次のフレームで所定の粒子に対応している表示され、消えたり/他の粒子から/で分割併合する個々の確率が割り当てられているコスト行列を、構築することにより、フレーム間の粒子をリンクします。世界的に、コストを最小化する解、 すなわち 、最も確率の高い1は、最終的に選択されています。また、これは一時的に消え、粒子、蛍光体の点滅によって引き起こされる典型的な現象を追跡することができます。 U-トラック （2.1.0）の最新バージョンは、これらの分析の実行を容易にするグラフィック·ユーザ·インタフェースがあります。 <ol><li>映画の選択インターフェイスを開くには、MATLABコマンドプロンプトで、「movieSelectorGUI」。作成するために指示に従ってください以前に保存した別々の画像から始まる新しいムービーデータベース（4.1.2を参照）。 </li><li>粒子検出および追跡するために必要な画素サイズ以下で、秒単位の時間間隔、開口数、カメラのビット深さ及びフルオロフォアの発光波長を提供する。映画のデータベースを保存します。 </li><li>映画の選択インタフェースから、オブジェクトの種類として、「単粒子 」 を選択、分析を実行します。粒子検出および追跡に使用されるパラメータを定義することができる場所に新しいウィンドウが表示されます。デフォルトのパラメータで始まります。 。検出および/ ​​またはトラッキングの品質はオプション （ 例えば 、いくつかの粒子が検出されたか、トラックが断片化されていない）満足のいくものであれば、後は、これらのパラメータを調整します。トラッキング設定の下で、保存するために「 マトリックス形式にエクスポート追跡結果 " をチェック「trackedFeaturedInfoと呼ばれる単一の行列（フィールド内のすべての粒子の座標と振幅」）。これらのパラメータの詳細については、U-トラックのマニュアルを参照してください。 </li><li>検出アルゴリズムを実行します。このアルゴリズムは、自動的に各回折限界スポット局所強度極大の周りの顕微鏡の点広がり関数に等しい標準偏差が2次元ガウス関数をフィッティングすることによって（ すなわち 、単一の受容体/受容体複合体）の背景の上の位置と強度を決定。その後、追跡アルゴリズムを実行します。 。マットファイルで分析結果を格納します。 </li><li>トラックを視覚化し、検出および追跡の品質をチェックするために、U-トラックパッケージに含まれる「movieViewer "ルーチン、または類似したカスタムのものを使用してください。 </li><li>各フレームで追跡粒子の位置と振幅（ すなわち 、強度）を表示します。matファイルを開きます。ステップ4.2.4で生成されたデータはtracksFinal ARのtracksCoordAmpCGフィールドに含まれています線、および/またはtrackedFeaturedInfo中。粒子の総数から4.1.3で測定された細胞表面面積でこの値を除算粒子密度を算出し検出した。 </li><li> オプション：受容体の粒子の動きを分析すること（4.2.6参照）を時間をかけて、粒子の座標を使用します。 Matlabのまたは類似のソフトウェアを使用して、平均二乗変位（MSD）と拡散係数（D）を計算します。各粒子と考えられるすべての時間間隔（Δt）は 、次の数式を使用して、平均二乗変位（MSD）を計算する。 <img align="middle" alt="式（1）" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg"> Δtはフレーム内の時間間隔であり、Nが分析ステップ数であり、xおよびyは、インデックスが示すフレームにおいて、粒子のx座標とy座標である。線形関係：指定された粒子の運動の種類を評価するために、時間のプロット上でMSDを使用監督の動きを示唆している自由拡散（ すなわち 、ブラウン運動）、正の曲率（ すなわち 、曲線は放物線のように見える）を示し、負の曲率は、限られた運動14の指標である。自由に拡散粒子の場合には、以下の式を用いて得られたMSDデータを当てはめることにより各粒子の拡散係数（D）を計算する。 <img align="middle" alt="式2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg"></li></ol></li><li>ガウシアンフィッティング法と粒子サイズの計算 NOTE：キャリブレーションサンプル（ガラスおよび/ ​​または蛍光標識された単量体の受容体上の単一のフルオロフォア）の強度分布がわかれば、受容体複合体のサイズを決定するために、画像シーケンスの開始時に、粒子強度の分布に混合ガウスフィットを実行する（ すなわち 、粒子当たりの受容体の数）10。 Matlabのか、Sを使用して、これらの分析を実行imilarソフトウェア。 <ol><li>強度の最初の変更が発生する前の（光退色に起因する減少がほとんどの場合）のフレームに最初のフレームからの粒子の強度を平均化することにより、各粒子の強度を計算します。 </li><li>次の式に従って混合ガウスフィッティングを行います。 <img align="middle" alt="式3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg"> φ（i）は 、粒子がiの強度を有する周波数であり、nは成分の数であり、αnの成分nの高さに寄与するパラメータであり、μ及びσは、平均値と基準単一のフルオロフォアの強度の標準偏差である（ステップ3で説明したように計算される） 注 ：Tの決定F検定により判断されるように、彼は徐々に成分を添加するまでのn maxが増加することによって、各画像シーケンスのためのコンポーネント（N 最大 ）の最大数は、もはや、統計学的に優れたフィッティングを生じないない。 </li><li> オプション：（。 例えば 、400フレームシーケンスの最後の60フレーム）ムービーの最後のフレームに得られた強度分布に混合ガウスフィットを実行します。これらのパラメータのための洗練された推定値を提供する。このフィッティングの後に得られた値とμとσを交換して、ステップ4.3.2を繰り返します。 </li><li>混合ガウスフィットの各成分の曲線下面積（AUC）を計算する。異なるサイズ分布全体のAUCで、各成分のAUC値を除算すること（すなわち、モノマー、ダイマー、トリマーなど）の受容体粒子の相対的な存在量を計算します。 </li><li>オプション：別の細胞と異なるサイズの粒子の分布は粒子密度10と相関してプロットを生成する（4.2.6で説明したように計算される）に対応する粒子密度から、使用データ。 </li></ol></li><li>ステップフィッティング法と粒子サイズの計算 注：受容体複合体10のサイズを決定するための別の方法として、ステップフィッティング分析を使用してください。 n個の蛍光団を含むこのように粒子徐々に漂白nステップで強度プロファイルを生成することが期待される-この分析のための基礎は、その瞬間の消失、単一のフルオロフォアの結果の光誘起破壊（退色）があることである。 <ol><li> U-トラックまたは同様の検出/追跡ソフトウェア（4.2.6を参照）によって生成される。matファイルから各粒子の強度プロファイルを抽出します。 </li><li>このような提示1工程として、フィッティングアルゴリズムを使用REF IN。 10、各粒子のための漂白ステップの数をカウントする。 </li><li> オプション ：（4.3参照）は、異なる大きさの受容体粒子の相対量を示す分布を生成し、予め混合ガウスフィッティングの結果を説明したように粒子密度とそれらを関連付けるために、結果を使用しています。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

記載されたプロトコルは、単一分子レベルでの細胞表面受容体複合体の空間的配置、移動度及びサイズの分析を可能にする。蛍光タンパク質の使用と比較して、より明るく光安定性である小さな有機フルオロフォアで標識化は、単一の受容体粒子の可視化を拡張できるという利点を有する。非常に低い発現レベルが達成されているので（&lt;0.45レセプター個/μm2）は 、受容体および他の膜タンパク質の特性は、生理的なものを超えない密度で分析することができる。また、アゴニスト10又は他の操作と受容体刺激の効果は、例えば、病理学的な状況を再現することを目的とし、分析することができる。また、原因SNAP / CLIPタグ11,12で標識戦略の柔軟性に、異なる蛍光体は、自分の特定のニーズに応じて使用することができます-注目すべきは、SNAPの組み合わせおよびCLIPタグは、例えば 、二色実験を行うために使用することができる、2つの相互作用タンパク質の間の共局在を観察する。最後に、このプロトコルは、異なる細胞、トランスフェクション法および標識戦略を用いて、例えば、いくつかの点で変更することが...

受容体は、細胞表面感覚細胞外環境に位置しており、このような臭気物質、イオン、小神経伝達物質および大きいタンパク質ホルモンのような様々な刺激に応答する。細胞膜の流動性は、受容体及び他の膜タンパク質の移動を可能にする。これは、タンパク質複合体およびそのような機能単位にアセンブルし、細胞内部にシグナルを伝達する受容体によって使用されるような一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用の発生の形成に必須である。例えば、細胞表面受容体1の最も大きなファミリーを構成するG-タンパク質共役受容体（GPCR）は、シグナル伝達の微調整調節に関与することが表示され、di-/oligomersを形成することが示唆されている重要な生理的および薬理学的結果2-5があるかもしれません。 単一分子顕微鏡で直接高spatiotempで可視化する大きな可能性を秘めている経口解像度の関連付けを含む生きている細胞の表面上に位置する個々の受容体の動的挙動は、二量体およびより高次の分子複合体6-10を形成する。これは通常、分子の数千から数百万の平均的挙動を報告し、標準的な生化学的および顕微鏡の方法に比べていくつかの利点を提供しています。 十分に明るく、光安定性、フルオロフォアとタンパク質標識は、単一分子顕微鏡検査のために不可欠です。このプロトコルは、共有結合し、細胞表面の受容体に小さな、明るい有機蛍光団を接続するために最近導入され、SNAPタグ11を利用しています。 SNAPは、不可逆的に蛍光団結合ベンジルグアニン（BG-フルオロフォア）誘導体で標識することができるヒトDNA修復酵素のO 6 -アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼに由来する20 kDのタンパク質タグである。 CLIP、SNAPに由来し、さら​​に設計タグは、代わりに蛍光団-Cで標識することができるonjugatedベンジルシトシン誘導体12。 本稿で報告されたプロトコルは、トランスフェクトし、ラベルの小さい有機蛍光団との11の受容体をSNAP-タグおよび生細胞10の表面上の単一の受容体または受容体複合体を視覚化するために全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を使用する方法について説明します。細胞外SNAP-タグ化細胞表面タンパク質10の&gt; 90％の標識効率の報告されたプロトコールをもたらす。受容体複合体のサイズおよび移動度を分析するために、ならびに一過性受容体 - 受容体相互作用を捕捉するために単一分子データを使用する方法に関するさらなる情報は、提供される。プロトコル全体の概略的なワークフローは、 図1に示されている。一例として、SNAP-タグ化Gタンパク質共役受容体（GPCR）を有するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のトランスフェクションは、フルオロフォア-BG誘導体で標識し、続いてよくquantifへの応用として、yおよびモニタ受容体di-/oligomerizationが記載されている。このプロトコルは、他の細胞表面タンパク質と蛍光タグ（ 例えば 、CLIP）、ならびに他のトランスフェクションおよび標識方法にまで拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1585</td><td>注意:有毒で刺激性のある物質だけでなく、発がん性物質の可能性がある</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>注意:強塩基で腐食性の高い試薬</td></tr><tr><td>無臭エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ&nbsp;</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111640</td><td>直径 24 mm、厚さ 0.13-0.16 mm</td></tr><tr><td>0.2 mm 滅菌フィルター</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>CHO 細胞</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC CCL-61</td><td>チャイニーズハムスター卵巣細胞株</td></tr><tr><td>6 ウェル細胞培養プレート</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培地</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>フェノールレッドフリー培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P06-07 100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P10-23100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-conjugated benzylguanine&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S9136S</td><td>SNAP表面アレクサフロー647。DMSOで1 mMのストック溶液を作製します。-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>イメージングバッファー:</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl、5.4 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.3、滅菌ろ過&</td></tr><tr><td>nbsp;&nbsp;&nbsp;NaCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1371</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;KCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;CaCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;MgCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;HEPES</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>イメージングチャンバー</td><td>分子プローブ、Life Technologies</td><td>A-7816</td><td>Attofluor Cell Chamber、顕微鏡用</td></tr><tr><td>TIRF-M</td><td>ライカ</td><td></td><td>モデル: DMI6000B</td></tr><tr><td>TIRF 対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>11 506 249&nbsp;</td><td>HCX PL Apo 100x/1.46 オイルコア&nbsp;</td></tr><tr><td>EM-CCDカメラ&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>Photometrics Cascade 512B</td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>Pecon</td><td></td><td>Tempcontrol 37-2 digital</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH, USA</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>u-track software</td><td>Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td><td></td><td>http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td></tr><tr><td>Matlabソフトウェア</td><td>The MathWorks、米国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

単一分子顕微鏡は、これらの側面（ 例えば 、動力学、異なる状態や集団、一時的な相互作用の共存）は、一般的にアンサンブル測定で隠されている、などに関して、特に、シグナル伝達分子の挙動を解析するための強力なアプローチとして浮上している標準的な生化学的または顕微鏡の方法で得られたもの。従って、このような受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントは、高時空間解像度で生細胞におけるリアルタイムで追跡することができる。このプロトコルは、小さくて明るい有機蛍光団と直接生きた細胞の表面上の単一の受容体を可視化する全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた標識に基づく方法について説明します。このアプローチは、いずれかが正確に、受容体を局在化受容体複合体のサイズを測定し、そのような一過性受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントをキャプチャすることを可能にする。プロトコルは、PE方法の詳細な説明を提供しています試料調製、画像取得および画像解析を含む単一分子実験を、rform。一例として、2つのG-タンパク質共役受容体を分析するこの方法の適用、 すなわち 、β2 -アドレナリン及びγ-アミノ酪酸タイプB（GABA B）は受容体が報告されている。プロトコルは、他の膜タンパク質および異なる細胞モデル、トランスフェクション法および標識戦略に適合させることができる。

記載されたプロトコルは、異なる膜タンパク質の種々に適用することができる。例として、β2 -アドレナリン作動性およびGABA B受容体を用いて得られた代表的な結果を10で報告されている。単一分子からの蛍光シグナルが弱いので、バックグラウンド蛍光の最小化が成功した結果の最初の重要なステップである。これにより、広範囲にカバースリップを洗浄（ 図2A）を使用すること、ならびに試料の自己蛍光（ 例えば 、フェノールレッドを含まない培地を使用することによって）を最小化することが重要である。次のステップは、単一のフルオロフォア分子の蛍光強度を決定することである。これは、清浄なカバーガラス（ 図2B）上にスポットし、単一のフルオロフォアを撮像することによって行うことができる。典型的には、フルオロフォアの連続希釈は、分析のための最良の条件を選択するために使用される、すなわち 、十分に分離され、均一に分布し、単一のフルオロフォアを生じる濃度。追加CONTROLSが単量体制御タンパク質を撮像...

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

次の実験の全体的な目標は、生細胞の表面にある単一の受容体を視覚化し、それらの位置、運動、および超分子複合体への動的関連を分析することです。これは、snapタグ付き受容体を生細胞の表面に非常に低いレベルで発現させ、それらを明るい有機蛍光色素で標識して単一分子の検出を可能にすることによって達成されます。第2のステップとして、細胞は全反射蛍光顕微鏡によって視覚化され、細胞表面上を移動する個々の受容体粒子の高速画像配列を取得することができます。次に、自動検出および追跡アルゴリズムを画像配列に適用して、各受容体粒子の位置と強度を経時的に取得します。この例における受容体複合体のサイズの精密な分析を示す結果が得られ、β 2つのアドレナリン受容体は、画像配列の先頭における粒子の強度分布の混合ガウス近似に基づいている。この方法は、細胞生物学分野の重要な疑問、例えば、私たちの受容体が生細胞表面のodドメインでどのように組織化しているかなど、答えるのに役立ちます。それらはどのように相互作用して二量体とオリゴマーを形成し、受容体シグナル伝達に基づく動的なイベントが実際にどのように起こっているのか。この手法が標準的な生化学的および顕微鏡法と比較した場合の主な利点は、自然環境における単一の受容体の挙動を調査するため、通常はアンサンブル測定に隠されている重要な側面を研究できることです。サンプルのカバースリップは、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために広範囲に洗浄する必要があります イメージング中は、清潔なピンセットを使用して直径24ミリメートルを配置します。ガラスカバーは、個々のカバースリップを分離するカバースリップホルダーに滑り込みます。カバースリップ付きのホルダーをビーカーに入れ、カバースリップがカバーになるまでクロロホルムを追加します。ビーカーをアルミホイルで覆って蒸発を減らし、浴中で超音波処理します。室温で1時間超音波処理します。1時間後、カバースリップホルダーをビーカーから取り出し、カバースリップを乾かします。次に、カバーがスリップしたホルダーを別のビーカーに置き、カバースリップが覆われるまで5モルの水酸化ナトリウム溶液を追加します。前と同じように、ビーカーをホイルで覆い、室温で1時間超音波処理し、カバースリップホルダーを新しいビーカーに移し、蒸留水で3回洗浄します。最後に、洗浄したカバースリップを100%エタノールを充填したガラス細胞培養皿に入れます。ここに示されているのは、全反射蛍光または芝顕微鏡法で画像化された、洗浄前と洗浄後のカバースリップです。Calキャリブレーションサンプルは、芝生顕微鏡で単一の蛍光分子の強度を推定するために使用されます。サンプルを調製するには、蛍光色素を適切な溶媒に溶解します。1ピカモルから1アノモルまでの範囲の蛍光色素の1〜10段階希釈液を調製します。フィルター滅菌水で。以前に洗浄したカバースリップを、フィルター滅菌水で満たされた細胞培養皿に移して洗浄します。その後、各カバースリップを6ウェル細胞培養プレートのウェルに置き、それらが乾燥するまで待つ 各蛍光色素希釈液の20マイクロリットルを別々の洗浄カバースリップ上にスポットスポットする。カバーを滅菌フードの下で滑り込ませて乾かします。トランスフェクションを使用する前に、カバーが光やほこりから滑り落ちるのを防ぎます。6ウェル細胞培養プレートの準備 洗浄したカバースリップを滅菌PBSで洗浄し、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに1枚のカバースリップを入れます。この研究のためにトランスフェクトされるCHO細胞は、1つの1対1のECCOs修飾イーグル培地栄養混合物F 12で5%CO2で5%CO2で培養され、トリプシンの後に10%胎児ウシ血清ペニシリンとストレプトマイシンを補給し、標準的な方法に従って細胞をカウントしますウェルあたり10〜5番目の細胞の密度で播種します。カバースリップを含む6番目のウェル細胞培養プレートで、細胞をインキュベーターで24時間増殖させ、最適な細胞密度である約80%coの流暢さを達成します。トランスフェクション用。このプロトコルの最も難しい側面は、成功を確実にするために、細胞表面の膜受容体の発現レベルを極端に低くすることです。トランスフェクション条件。例えば、プラス培地NAの量とトランスフェクション後の時間は、トランスフェクション当日に最適化する必要があります。それぞれのトランスフェクション試薬を調製し、目的の格子縞DNAの2マイクログラムを別のチューブ内の最適な培地500マイクロリットルで希釈します。各ウェルについて、500マイクロリットルのOptum培地で6マイクロリットルの脂肪切除術2000を希釈します。両方のチューブを室温で5分間インキュベートします。5分後、両方の溶液を1つのチューブに混合し、混合してトランスフェクション混合物を得ます。トランスフェクション混合物を室温で20分間インキュベートします。その間に、CHO細胞を準備します。事前に警告されたPBSで細胞を2回洗浄します 2回目の洗浄後、PBSを1ウェルあたり1ミリリットルのフェノールレッドフリーD-M-E-M-F 12培地に10%FBSを補充しますが、抗生物質は使用しません。トランスフェクション混合物1ミリリットルを各ウェルに滴下し、プレートを前後に静かに揺らして完全に混合します。摂氏37度で5%CO2中で2〜4時間インキュベートしてから、すぐにタンパク質の標識に進みます。この手順を開始するには、10%FBSを添加したD-M-E-M-F 12培地1ミリリットルで、フルオロ4結合ベンゾギネ誘導体またはフルオロ4BGストック溶液1マイクロリットルを希釈して、最終濃度1マイクロモルを得る。インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を取り出し、予温PBSで2回洗浄します。PBSを1ミリリットルの1マイクロモルフルオロ4BG溶液に交換し、摂氏37度で5%CO2に20分間インキュベートします。次に、毎回10%FBSを添加したD-M-E-M-F 12培地で細胞を3回洗浄し、その後、摂氏37度で5分間インキュベートします。ピンセットを使用して、標識された細胞のカバースリップをイメージングチャンバーに移しました。300マイクロリットルのイメージングバッファーで2回洗浄します。300マイクロリットルの新鮮なイメージングバッファーを追加し、すぐにイメージング画像の取得に進みます。油浸、高開口対物レンズ、適切なレーザー、電子増倍電荷結合装置、カメラ、インキュベーター、温度制御を備えた芝生顕微鏡を使用します。レーザーライン、芝生の角度、露光時間、フレームレート、およびムービーあたりの画像数など、目的の顕微鏡パラメータを設定します。顕微鏡の100倍対物レンズに液浸油を一滴垂らします。標識された細胞を載せたイメージングチャンバーを顕微鏡の標本ホルダーに置き、細胞に焦点を合わせます。明視野照明を使用する。芝生のイルミネーションに切り替えます。レーザー出力をできるだけ低く保ち、目的のセルを検索できるようにすると同時に、光の漂白を最小限に抑えます。目的のセルを選択して微調整します。ピントを調整します。レーザー出力を、単一の植物相の4つを視覚化できるレベルまで上げます。画像シーケンスを取得し、未加工の画像シーケンスをキャリブレーション用のtiffファイルとして保存します。各キャリブレーションサンプルをイメージングチャンバーに組み立て、顕微鏡に置きます。十分に分離された回折を含むサンプルを選択してください。ワンステップで漂白する限定スポット。その後、ターフ画像配列は、標識細胞について示されたのと同じ方法で取得されます。画像シーケンスを準備するには、Image Jなどの画像処理ソフトウェアを使用して画像をトリミングします。個々のフレームを個別の TIFF 画像として、各画像のフレーム番号を示す新しいフォルダーに保存します。粒子の検出と追跡は、MATLAB 環境で U Track などの非商用ソフトウェアを使用して実行されます。MATLAB コマンド プロンプトから、「movie selector, GUI」と入力します。ムービー選択インターフェイスを開くには、指示に従って、以前に保存した個別の画像から新しいムービーデータベースを作成します。ナノメートル単位のピクセルサイズ、秒単位の時間間隔、開口数、カメラのビット深度、および粒子の検出と追跡に必要な蛍光色素の発光波長を提供します。ムービー選択インターフェイスからムービーデータベースを保存します。オブジェクトのタイプとして単一の粒子を選択して解析を実行します。検出アルゴリズムを実行し、次に追跡アルゴリズムを実行します。URACパッケージに含まれているムービービューアルーチンを使用して、トラックを視覚化し、検出と追跡の品質を確認します。ドット MAT ファイルを開いて、各フレームでトラッキングされたパーティクルの位置と振幅を確認します。粒子のサイズは、取得したデータからも計算できます。ここに示されているのは、スナップタグ付きβ 2アドレナリン受容体でトランスフェクションされ、フルオロ4標識ベンジルギネ誘導体で標識された細胞の典型的な芝画像配列の最初のフレームです。スポットは、単一の受容体または受容体複合体を表します。検出アルゴリズムは同じ画像シーケンスに適用され、検出された各粒子は追跡アルゴリズムの青い円の適用によって示されます。同じ画像シーケンスに対して、青色で示された個々の粒子の軌跡が得られます。緑のセグメントはマージ イベントを表し、赤いセグメントは分割イベントを表します。このメソッドは、動的イベントもキャプチャします。この例では、2 つのパーティクルが一時的な相互作用を受け、数フレーム一緒に移動した後、再び分裂します。個々の粒子の軌跡は、拡散係数を計算するために使用されます。この代表的な結果は、β2アドレナリン受容体が高い移動性を持っていることを示しています。Gaba B受容体の移動性は限られていますが、混合ガウスモデルで粒子強度の分布を適合させることで、受容体複合体のサイズを正確に推定できます。この分析により、モノマーとダイマーの共存も明らかになります。ここに示されているのは、単量体の受容体粒子が1ステップで漂白し、直径が2ステップで漂白する例です。これらの手順は、他の細胞表面タンパク質、レベリング方法、細胞モデルと連携するように拡張および適応させることができます。このビデオを見れば、クリーンなカバースリープを実現する方法、低発現レベルと明るい有機フルオロによる効率的な標識を得る方法、そして1分子を成功させるためのすべての重要なステップである芝画像の取得と分析方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

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