単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

次の実験の全体的な目標は、生細胞の表面にある単一の受容体を視覚化し、それらの位置、運動、および超分子複合体への動的関連を分析することです。これは、snapタグ付き受容体を生細胞の表面に非常に低いレベルで発現させ、それらを明るい有機蛍光色素で標識して単一分子の検出を可能にすることによって達成されます。第2のステップとして、細胞は全反射蛍光顕微鏡によって視覚化され、細胞表面上を移動する個々の受容体粒子の高速画像配列を取得することができます。

次に、自動検出および追跡アルゴリズムを画像配列に適用して、各受容体粒子の位置と強度を経時的に取得します。この例における受容体複合体のサイズの精密な分析を示す結果が得られ、β 2つのアドレナリン受容体は、画像配列の先頭における粒子の強度分布の混合ガウス近似に基づいている。この方法は、細胞生物学分野の重要な疑問、例えば、私たちの受容体が生細胞表面のodドメインでどのように組織化しているかなど、答えるのに役立ちます。

それらはどのように相互作用して二量体とオリゴマーを形成し、受容体シグナル伝達に基づく動的なイベントが実際にどのように起こっているのか。この手法が標準的な生化学的および顕微鏡法と比較した場合の主な利点は、自然環境における単一の受容体の挙動を調査するため、通常はアンサンブル測定に隠されている重要な側面を研究できることです。サンプルのカバースリップは、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために広範囲に洗浄する必要があります イメージング中は、清潔なピンセットを使用して直径24ミリメートルを配置します。

ガラスカバーは、個々のカバースリップを分離するカバースリップホルダーに滑り込みます。カバースリップ付きのホルダーをビーカーに入れ、カバースリップがカバーになるまでクロロホルムを追加します。ビーカーをアルミホイルで覆って蒸発を減らし、浴中で超音波処理します。

室温で1時間超音波処理します。1時間後、カバースリップホルダーをビーカーから取り出し、カバースリップを乾かします。次に、カバーがスリップしたホルダーを別のビーカーに置き、カバースリップが覆われるまで5モルの水酸化ナトリウム溶液を追加します。

前と同じように、ビーカーをホイルで覆い、室温で1時間超音波処理し、カバースリップホルダーを新しいビーカーに移し、蒸留水で3回洗浄します。最後に、洗浄したカバースリップを100%エタノールを充填したガラス細胞培養皿に入れます。ここに示されているのは、全反射蛍光または芝顕微鏡法で画像化された、洗浄前と洗浄後のカバースリップです。

Calキャリブレーションサンプルは、芝生顕微鏡で単一の蛍光分子の強度を推定するために使用されます。サンプルを調製するには、蛍光色素を適切な溶媒に溶解します。1ピカモルから1アノモルまでの範囲の蛍光色素の1〜10段階希釈液を調製します。

フィルター滅菌水で。以前に洗浄したカバースリップを、フィルター滅菌水で満たされた細胞培養皿に移して洗浄します。その後、各カバースリップを6ウェル細胞培養プレートのウェルに置き、それらが乾燥するまで待つ 各蛍光色素希釈液の20マイクロリットルを別々の洗浄カバースリップ上にスポットスポットする。

カバーを滅菌フードの下で滑り込ませて乾かします。トランスフェクションを使用する前に、カバーが光やほこりから滑り落ちるのを防ぎます。6ウェル細胞培養プレートの準備 洗浄したカバースリップを滅菌PBSで洗浄し、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに1枚のカバースリップを入れます。

この研究のためにトランスフェクトされるCHO細胞は、1つの1対1のECCOs修飾イーグル培地栄養混合物F 12で5%CO2で5%CO2で培養され、トリプシンの後に10%胎児ウシ血清ペニシリンとストレプトマイシンを補給し、標準的な方法に従って細胞をカウントしますウェルあたり10〜5番目の細胞の密度で播種します。カバースリップを含む6番目のウェル細胞培養プレートで、細胞をインキュベーターで24時間増殖させ、最適な細胞密度である約80%coの流暢さを達成します。トランスフェクション用。

このプロトコルの最も難しい側面は、成功を確実にするために、細胞表面の膜受容体の発現レベルを極端に低くすることです。トランスフェクション条件。例えば、プラス培地NAの量とトランスフェクション後の時間は、トランスフェクション当日に最適化する必要があります。

それぞれのトランスフェクション試薬を調製し、目的の格子縞DNAの2マイクログラムを別のチューブ内の最適な培地500マイクロリットルで希釈します。各ウェルについて、500マイクロリットルのOptum培地で6マイクロリットルの脂肪切除術2000を希釈します。両方のチューブを室温で5分間インキュベートします。

5分後、両方の溶液を1つのチューブに混合し、混合してトランスフェクション混合物を得ます。トランスフェクション混合物を室温で20分間インキュベートします。その間に、CHO細胞を準備します。

事前に警告されたPBSで細胞を2回洗浄します 2回目の洗浄後、PBSを1ウェルあたり1ミリリットルのフェノールレッドフリーD-M-E-M-F 12培地に10%FBSを補充しますが、抗生物質は使用しません。トランスフェクション混合物1ミリリットルを各ウェルに滴下し、プレートを前後に静かに揺らして完全に混合します。摂氏37度で5%CO2中で2〜4時間インキュベートしてから、すぐにタンパク質の標識に進みます。

この手順を開始するには、10%FBSを添加したD-M-E-M-F 12培地1ミリリットルで、フルオロ4結合ベンゾギネ誘導体またはフルオロ4BGストック溶液1マイクロリットルを希釈して、最終濃度1マイクロモルを得る。インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を取り出し、予温PBSで2回洗浄します。PBSを1ミリリットルの1マイクロモルフルオロ4BG溶液に交換し、摂氏37度で5%CO2に20分間インキュベートします。

次に、毎回10%FBSを添加したD-M-E-M-F 12培地で細胞を3回洗浄し、その後、摂氏37度で5分間インキュベートします。ピンセットを使用して、標識された細胞のカバースリップをイメージングチャンバーに移しました。300マイクロリットルのイメージングバッファーで2回洗浄します。

300マイクロリットルの新鮮なイメージングバッファーを追加し、すぐにイメージング画像の取得に進みます。油浸、高開口対物レンズ、適切なレーザー、電子増倍電荷結合装置、カメラ、インキュベーター、温度制御を備えた芝生顕微鏡を使用します。レーザーライン、芝生の角度、露光時間、フレームレート、およびムービーあたりの画像数など、目的の顕微鏡パラメータを設定します。

顕微鏡の100倍対物レンズに液浸油を一滴垂らします。標識された細胞を載せたイメージングチャンバーを顕微鏡の標本ホルダーに置き、細胞に焦点を合わせます。明視野照明を使用する。

芝生のイルミネーションに切り替えます。レーザー出力をできるだけ低く保ち、目的のセルを検索できるようにすると同時に、光の漂白を最小限に抑えます。目的のセルを選択して微調整します。

ピントを調整します。レーザー出力を、単一の植物相の4つを視覚化できるレベルまで上げます。画像シーケンスを取得し、未加工の画像シーケンスをキャリブレーション用のtiffファイルとして保存します。

各キャリブレーションサンプルをイメージングチャンバーに組み立て、顕微鏡に置きます。十分に分離された回折を含むサンプルを選択してください。ワンステップで漂白する限定スポット。

その後、ターフ画像配列は、標識細胞について示されたのと同じ方法で取得されます。画像シーケンスを準備するには、Image Jなどの画像処理ソフトウェアを使用して画像をトリミングします。個々のフレームを個別の TIFF 画像として、各画像のフレーム番号を示す新しいフォルダーに保存します。

粒子の検出と追跡は、MATLAB 環境で U Track などの非商用ソフトウェアを使用して実行されます。MATLAB コマンド プロンプトから、「movie selector, GUI」と入力します。ムービー選択インターフェイスを開くには、指示に従って、以前に保存した個別の画像から新しいムービーデータベースを作成します。

ナノメートル単位のピクセルサイズ、秒単位の時間間隔、開口数、カメラのビット深度、および粒子の検出と追跡に必要な蛍光色素の発光波長を提供します。ムービー選択インターフェイスからムービーデータベースを保存します。オブジェクトのタイプとして単一の粒子を選択して解析を実行します。

検出アルゴリズムを実行し、次に追跡アルゴリズムを実行します。URACパッケージに含まれているムービービューアルーチンを使用して、トラックを視覚化し、検出と追跡の品質を確認します。ドット MAT ファイルを開いて、各フレームでトラッキングされたパーティクルの位置と振幅を確認します。

粒子のサイズは、取得したデータからも計算できます。ここに示されているのは、スナップタグ付きβ 2アドレナリン受容体でトランスフェクションされ、フルオロ4標識ベンジルギネ誘導体で標識された細胞の典型的な芝画像配列の最初のフレームです。スポットは、単一の受容体または受容体複合体を表します。

検出アルゴリズムは同じ画像シーケンスに適用され、検出された各粒子は追跡アルゴリズムの青い円の適用によって示されます。同じ画像シーケンスに対して、青色で示された個々の粒子の軌跡が得られます。緑のセグメントはマージ イベントを表し、赤いセグメントは分割イベントを表します。

このメソッドは、動的イベントもキャプチャします。この例では、2 つのパーティクルが一時的な相互作用を受け、数フレーム一緒に移動した後、再び分裂します。個々の粒子の軌跡は、拡散係数を計算するために使用されます。

この代表的な結果は、β2アドレナリン受容体が高い移動性を持っていることを示しています。Gaba B受容体の移動性は限られていますが、混合ガウスモデルで粒子強度の分布を適合させることで、受容体複合体のサイズを正確に推定できます。この分析により、モノマーとダイマーの共存も明らかになります。

ここに示されているのは、単量体の受容体粒子が1ステップで漂白し、直径が2ステップで漂白する例です。これらの手順は、他の細胞表面タンパク質、レベリング方法、細胞モデルと連携するように拡張および適応させることができます。このビデオを見れば、クリーンなカバースリープを実現する方法、低発現レベルと明るい有機フルオロによる効率的な標識を得る方法、そして1分子を成功させるためのすべての重要なステップである芝画像の取得と分析方法についてよく理解できるはずです。