Name: 多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶ多重化蛍光イムノアッセイ（MFIA）による実験動物の血清学的スクリーニング法。抗原コートビーズと蛍光検出を用いて複数の感染症抗体を同時検出し、検査効率とリソース削減を実現します。

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ここで紹介する研究はチャールズ川によってサポートされていました。

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

チャールズ川RADS、動物血清学検査サービスおよび試薬の主要なプロバイダのすべての著者が仕事。

MFIAのテストプロセスは、従来のsingleplexテストより少ない機器や小​​さいサンプルと試薬を正確な容量を必要とする、非常に効率的です。多重システムの機能は、実験用げっ歯類における共通エージェントの複数の株または血清（すなわち、コロナウイルス、パルボウイルスなど）を同時にスクリーニングするために、ユーザに柔軟性を提供します。これはまた、関心のある領域（すなわち、特定のウイルスの家族）に基づいてカスタマイズされたビーズのパネルを設計するために、私たちを可能にし、サイトカインおよび他のバイオマーカーを含む生体分子の他の種類のスクリーニングに適応可能です。また、それは私たちがサンプルおよびシステム適合性を確認することにより、結果の精度を保証するために、いくつかの内部統制アッセイを組み込むことができます。これらはサンプルの適合性を評価するための組織制御とIgG抗血清試験種の免疫グロブリン（αIg）でコーティングされたビーズセットが含まれています。組織制御ビードは血清免疫グロブリンの非特異的結合を検出し、αIgビードコントロールが確認その血清を添加し、十分な免疫グロブリン濃度が含まれているされています。血清種の免疫グロブリンでコーティングされた別のコントロールビーズは、標識された試薬及びアッセイリーダーが正常に機能していることを示しています。他の市販の多重フォーマット血清学的アッセイは、（つまり、マイクロアレイ、ImmunoComb）結果確認のこの同じレベルを提供しません。 前に再テストをアッセイ失敗の可能性のあるソースを絞り込むために能力は研究者が時間と材料を節約することができます。 MFIAの重要な側面は、失敗したサンプルを繰り返す前に確認すべきである。アッセイは、周囲温度で行われるので、それは℃±2℃、高温がコントロールとサンプルの予想より低いスコアにつながることができます約27実験室の温度であることを確認する必要があります。洗濯は、おそらく検定の中で最も重要なステップです。試験板を適切に洗浄されることを保証する、ブロットし、排除することができます再懸低ビーズカウント（集約ビーズのために）または不十分な試薬添加（試験板フィルター底から吸い上げによって失われた）のためにサンプリング誤差の大半。我々は日常的にアッセイ当たり25ビーズ（エージェント）を数え、また、プレートのための時間を読むために長くつながるビーズの高い数を数えることによって、結果に有意差は認められません。 我々は、既知の陽性及び陰性血清多数のサンプルをテストすることにより、診断精度、再現性、耐久性を実証するために一般的に使用される実験動物の数種（マウス、ラット、ハムスター、モルモット及びウサギ）でMFIAの包括的な検証試験を行い、き彼らのELISA、IFAおよびMFIA結果を比較する。 MFIAの検出限界（すなわち、標準的な免疫血清滴エンドポイント）が同程度であった、といくつかのケースでは、対応するELISA法を上回りました。 SPFの齧歯類の血清を用いて測定し診断特異性は、99％を超え、全体の対応betwee既知の陽性および既知の陰性血清で行わnのELISAとMFIAは95％以上であった。要約すると、これらの結果は、多重MFIAがsingleplex ELISAと良い代替であり、実験動物コロニーのルーチンserosurveillanceすなわち、その使用目的に適していることを証明した。

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

生物医学研究に使用される動物モデルの品質を確保するために、我々は動物が外来性感染性病原体（ウイルス、マイコプラズマ、および他の潔癖な微生物）にさらされているかどうかを判断するための診断テスト戦略と方法を開発しました。免疫担当動物の感染症は、一般的に一時的なもので、まだ感染に対する血清抗体応答は、しばしば数日から数週間以内に検出することができ、ホストの寿命を通じて存続する。血清学的検査は、実験動物を監視する主要な診断方法である。歴史的には間接的な酵素免疫測定法（ELISA）はserosurveillanceのための主要なスクリーニング方法であった。 ELISAは、1つの微生物抗原抗体反応をウェル当たり測定される、singleplexとして実行されます。比較でMFIAは多重化アッセイとして実行されます。ミクロス100個別の色セットになっているので、最大100の異なるアッセイがsimultanを行うことができますeouslyシングルマイクロプレートのウェル。この技術革新はよく単一の試験から得られた情報の量を増加させながら、ルーチン検査に必要な血清、試薬および消耗品の量を減少させる。加えて、我々は、サンプルおよびシステム適合性を確認することにより、結果の精度を保証するために、複数の内部統制ビーズを取り込むことが出来るのです。これらはサンプルの適合性を評価するための組織制御とIgG抗血清試験種の免疫グロブリン（αIg）でコーティングされたビーズセットが含まれています。 ELISAとIFAのように、組織のコントロールは、血清免疫グロブリンの非特異的結合を検出します。 αIg制御（血清コントロール）は、血清が追加されたことを確認し、血清種の免疫グロブリンでコーティングされたIgGコントロールビーズ（システム適合性制御）は、標識試薬およびLuminexの読​​者が正しく機能していることを示していながら、十分な免疫グロブリン濃度が含まれています。

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。 MFIA試験法だけでな​​く、様々なトラブルシューティングのトピックが扱われています。

生物医学研究に使用される動物モデルの品質を担保するため、我々は、...かどうかを判定するための多くの診断テスト戦略および手法を開発しました。

本実験の全体的な目的は、実験動物における外来性感染剤に対する抗体を検出することです。これは、被験血清を抗原コーティングされたマイクロスフィアとともにインキュベートすることで達成されます。次に、血清をビオチン化された種特異的抗免疫グロブリンとともにインキュベートし、抗原抗体免疫複合体を検出します。その後、ストレプトアビジン標識FICO eryn Fluor force溶液を添加し、ビオチン化免疫グロブリンを検出します。これにより、マルチプレックス蛍光、イムノアッセイネットスコア、蛍光サンプル値に基づいた、実験動物（齧歯類）における一般的病原体の抗体陽性または陰性の判定結果が得られます。ELISAなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、MFIAがマルチプレックスアッセイであることです。これにより、研究者は1回の検査で最大100種類の異なるアッセイをスクリーニングすることが可能になります。この手法は、従来の方法で必要とされていた血清領域の量や使い捨て廃棄物の量を削減しつつ、1回の手試験から得られる情報量を増加させることができます。私たちは、多数の血清検体を用いて複数の抗原を検査していた際、労力と検査時間の両方を削減したいと考え、この方法を使用することを思いつきました。ここからは、当研究室のシニアテクノロジストであるDonna Cohenが手順を実演します。まず、マルチプレックス蛍光免疫測定法（MFIA）の手順に必要な2種類のバッファーを用意してください。1つ目は一次希釈液であり、Charles River社から入手可能で、アッセイ洗浄バッファーの非特異的な相互作用を減少させるための独自のブロッキング剤が含まれています。粒子を除去するため、1%BSAを含むpH 7.4のPBS溶液を調製します。アッセイ洗浄バッファーを用いて、このバッファーを0.2 micronのボトルトップフィルターでろ過し、ラベルを貼った滅菌容器に回収します。テスト血清のインキュベーションステップで形成される抗原抗体複合体を標識するために使用する、ビオチン化抗種抗体（IgGまたはIgA）、ストレプトアビジン、およびフィコエリトリン（PE）の2倍濃度溶液を調製します。あわせて、マルチチャンネルおよびシングルチャンネルマイクロピペットとチップ、およびタンパク質希釈用の96ウェル低タンパク吸着マイクロタイタープレートなどの材料および消耗品を準備してください。血液サンプルを採取し血清を分離した後、血清を短時間ボルテックスし、96ウェルマイクロタイタープレート内で一次希釈液を用いてサンプルを希釈します。これにより、ウェルへの適切な均一な分注を確実に行います。アッセイ洗浄バッファーを用いて96ウェルテストプレートのすべてのウェルを事前に濡らし、アッセイ全体を通して溶液をゆっくりと吸引してください。ビーズの凝集やフィルターメンブレンへのビーズの圧密を防ぐため、吸引は5〜10秒で行ってください。これらが起こると、アッセイ終了時の読み取り時間が遅くなる可能性があります。テストプレートの裏側をペーパータオルで吸い取り、液の排出が停止したことを確認してください。インキュベーション中にウェルから液が吸い上げられるのを防ぐため、洗浄ステップごとにテストプレートを吸い取ることが重要です。ビーズを調製するには、まず結合済みビーズストック懸濁液をボルテックスします。次に、バスを用いて短時間超音波処理を行います。ビーズの凝集クラスターを防ぐために適切に再懸濁させることが極めて重要です。凝集が起こると、読み取り時間が長くなる可能性があります。次に、20倍ストック懸濁液を一次希釈液で2倍ワーキングビーズ溶液に調製します。その後、2倍ビーズ懸濁液 50 µL を、あらかじめ濡らしておいたテストプレートの各アッセイウェルに分注します。あらかじめ定義したプレートマップに基づき、各2倍テスト血清およびコントロール血清 50 µL をテストプレートにピペッティングします。プレートの蓋をしっかりと閉めます。溶液の蒸発はアッセイの失敗につながるため、アルミホイルで覆い、室温のオービタルシェーカーで60分間インキュベートします。すべてのインキュベーション工程において、テストプレートは蓋をしたまま保持してください。さらに、ビーズが懸濁状態に保たれ、血清抗体が結合抗原の全表面にアクセスできるように、振盪速度は400 RPM超、700 RPM未満に設定してください。BAGおよびSPEを用いてビーズを順次インキュベートしてプレートを洗浄した後、サンプルを再度洗浄します。次に、125 µLのアッセイ洗浄バッファーを加えてビーズを再懸濁し、2分間振盪してからプレートを読み取ります。ビーズを再懸濁させてから10分以内にアッセイリーダーにセットします。ビーズは検出器を1つずつ通過し、そこで2本のレーザーに照射されます。一方のレーザーはビーズの色セットを識別するための内部染料を励起し、もう一方はFICO erythingレポーター染料を励起します。あらかじめ設定された数のビーズにおけるFICO erything蛍光強度がFM FIとして報告されます。まず最初のウェルを読み取り、選択したビーズパネルがテストウェルのビーズプロファイルと一致していることを確認してください。プロトコルディスプレイ上の指定されたビーズ領域外にビーズが落下している場合は、プロファイルの選択が間違っています。適切に再懸濁されたビーズは、アッセイリーダーソフトウェアで示される指定領域を満たします。ビーズが凝集している場合は、領域を充填する速度が遅くなります。テストプレートをリーダーから取り出し、手動でウェルを再懸濁してビーズを分散させることができます。テストプレートをリーダーから取り出し、マルチチャンネルピペッターを用いて各ウェルを3〜4回トリチュレートします。その後、テストプレートをリーダーに戻し、結果の確認を継続します。ビーズ数の不足や、IgG anti IgGビーズスコアの低下などのエラーを報告し、これらのサンプルのアッセイを繰り返してください。データをExcelにエクスポートして正味のMFIを算出した後、高レンジ免疫血清を除くテストプレイアッセイコントロールに不合格がないかを確認します。コントロールに不合格がある場合は不適格となり、アッセイを繰り返す必要があります。この表は、典型的なアッセイプレートにおけるテスト血清およびアッセイコントロールのデータを示しています。すべてのIgGコントロールは合格しました。このプレートのテスト結果では、オレンジ色のウェルで示されているように、多数の組織反応性サンプルおよびIgGコントロールサンプルが不合格となったことがわかります。A1C 1およびF1はTC組織反応性の不合格を示しており、かっこ内にTCスコアが表示されています。Wells B 1およびE 1は、それぞれBAGまたはSPEといった、テスト抗体またはテスト試薬の不足による2種類のIgG内部コントロール不合格の例を示しています。テストプレートの結果は、システム適合性コントロールおよび血清コントロールがここに示す判定基準を満たした場合にのみ解釈されます。種特異的な抗テスト血清免疫グロブリンでコーティングされたマイクロスフェアは、サンプル量の不足、過剰なサンプル希釈、不適切な種の使用、または免疫不全のホストからのテスト血清の添加により、不合格スコアを示すことがあります。テストプレイアッセイのコントロール結果が良好であれば、個々のアッセイスコアを以下に従って分類します。この手順の後、初期の予期しない結果または陽性結果を確認するために、ELISA、IFA、および/またはウェスタンブロットなどの追加手法を用いる必要があります。動物の管理に関する決定を下す前に、これらの結果を検証することが極めて重要です。これは、同一のサンプル、または同一のコロニーから得られた追加のサンプルに対して異なる手法を用いることで実施可能です。このビデオを視聴することで、マルチプレックス蛍光定量免疫測定法の実施方法と、貴施設で得られた結果の解釈方法について十分に理解できるはずです。これにより、各テストサンプルウェルからより多くの情報を収集しつつ、労力を削減することが可能になります。

multiplexed-fluorometric-immunoassay-testing-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、蛍光磁気ビーズまたはマイクロスフェアを異なる抗原と組み合わせて使用し、血清サンプル中のさまざまな抗体アイソタイプを同時に検出するイムノアッセイ技術について説明しています。このアッセイは、感染中またはワクチン接種後のセロコンバージョンを理解するのに役立ちます。...

Multianalyte Immunobead Assay:ヒト血清サンプル中の複数の抗体サブタイプを同時に検出するためのフローベースのイムノアッセイ技術

このビデオは、異なるセットに染色されたカルボキシル化磁性ポリスチレン微小球を使用した多重化された定量的細菌検出を示しています。この手順には、ビーズ-バクテリア複合体の形成、磁気分離、およびフローベースの分析が含まれ、同じ反応ウェル内の複数のバクテリアの正確かつ同時定量が可能になります。...

色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。...

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。...

手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

多重免疫体化学とマルチスペクトルイメージングの進歩にもかかわらず、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスタリングを同時に特徴付けるのは依然として課題です。本論文では、子宮内膜における4種類の免疫細胞の同時局在化のための詳細な多重染色プロトコルとイメージングについて述べている。...

再発流産における4種類の子宮内膜免疫細胞型の多重化蛍光免疫物質化学的染色

3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア...

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ...

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶ多重化蛍光イムノアッセイ（MFIA）による実験動物の血清学的スクリーニング法。抗原コートビーズと蛍光検出を用いて複数の感染症抗体を同時検出し、検査効率とリソース削減を実現します。

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

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