多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

本実験の全体的な目的は、実験動物における外来性感染剤に対する抗体を検出することです。これは、試験血清を抗原コーティングされた微小球と共にインキュベートすることで達成されます。次に、血清をビオチン標識された種特異的抗免疫グロブリンと共にインキュベートし、抗原抗体免疫複合体を検出します。

次に、ストレプトアビジン標識FICOeryn Fluor force溶液を添加します。これにより、マルチプレックス蛍光、イムノアッセイネットスコア、および蛍光サンプル値に基づいて、実験動物における一般的な病原体に対する抗体保有の陽性または陰性の判定結果を示す、ビオチン化免疫グロブリンを検出します。ELISAなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、MFIAがマルチプレックスアッセイであることです。これにより、研究者は1回の検査で最大100種類の異なるアッセイをスクリーニングすることが可能になります。

この手法を用いることで、既存の方法よりも血清量および使い捨て廃棄物の量を削減しつつ、1回の検査から得られる情報量を増やすことができます。もともと、多数の血清サンプルを用いて複数の病原体を検査する際、労力と検査時間を削減したいと考えたことで、この方法を利用するアイデアが生まれました。ここからは、当研究室のシニアテクノロジストであるDonna Cohenが手順を実演します。まず、マルチプレックス蛍光免疫測定法（MFIA）の手順に必要な2種類のバッファーを用意してください。

1つ目は一次希釈液で、Charles River社から入手可能です。これには、アッセイ洗浄バッファーにおける非特異的相互作用を減少させるための独自のブロッキング剤が含まれています。粒子を除去するために、1% BSA含有PBS（pH 7.4）溶液を調製します。アッセイ洗浄バッファーを用いて、このバッファーを0.2ミクロンのボトルトップフィルターでろ過し、ラベル付きの滅菌容器に入れます。

ビオチン化抗種抗体（IgGまたはIgA）およびストレプトアビジン結合フィコエリトリン（SPE）の2倍濃度溶液を調製します。これらは、テスト血清のインキュベーションステップで形成される抗原抗体複合体を標識するために使用されます。以下の材料および消耗品を準備してください：マルチチャンネルおよびシングルチャンネルマイクロピペットとチップ、およびタンパク質希釈用の96ウェル低タンパク質結合マイクロタイタープレート。血液サンプルを採取して血清を分離した後、サンプルの均一な分注を確実にするため、96ウェルマイクロタイタープレート内で一次希釈液を用いて希釈する前に、血清を短時間ボルテックスします。アッセイ洗浄バッファーを用いて、96ウェルテストプレートのすべてのウェルを事前に湿らせておき、アッセイ全体を通して溶液をゆっくりと吸引してください。

ビーズの凝集やフィルターメンブレンへのビーズの圧密を防ぐため、吸引は5〜10秒で行ってください。これらが起こると、アッセイ終了時の読み取り時間が遅くなる可能性があります。テストプレートの底面をペーパータオルで吸い取り、液の排出が停止したことを確認してください。インキュベーション中にウェルから液が吸い上げられる（ウィッキング）のを防ぐため、各洗浄ステップの後にテストプレートを吸い取ることが重要です。

ビーズを調製するには、まず結合済みビーズストック懸濁液をボルテックスします。次に、バスを用いて短時間ソニケーションします。ビーズの凝集クラスターを防ぐために適切に再懸濁させることが極めて重要であり、凝集が発生するとリード時間が長くなる可能性があります。

次に、20倍濃縮のストック懸濁液を、一次希釈液を用いて2倍濃縮のワーキングビーズ溶液に調製します。その後、2倍濃縮のビーズ懸濁液 50 µLを、あらかじめウェット処理したテストプレートの各アッセイウェルに分注します。あらかじめ定義されたプレートマップに基づき、2倍濃縮の各テスト血清およびコントロール血清 50 µLをテストプレートにピペッティングします。

プレートの蓋をしっかりと閉めます。溶液の蒸発はアッセイの失敗につながるため、プレートをアルミホイルで覆い、室温のオービタルシェーカーで60分間インキュベートします。すべてのインキュベーション工程において、プレートは蓋をしたままの状態を維持してください。

さらに、ビーズを懸濁状態に保ち、血清抗体が結合抗原のすべての表面にアクセスできるようにするため、振盪速度は400 RPM超、700 RPM未満にする必要があります。BAGおよびSPEを用いたビーズの連続インキュベーションによるプレートの洗浄後、サンプルを再度洗浄します。その後、125 µLのアッセイ洗浄バッファーを加えてビーズを再懸濁し、2分間振盪してからプレートを読み取ります。

ビーズを再懸濁させてから10分以内にアッセイリーダーにセットします。ビーズは検出器を1つずつ通過し、2つのレーザーにさらされます。一方のレーザーは、ビーズの色セットを特定する内部染料を励起し、もう一方のレーザーはFICO erythingレポーター染料を励起します。あらかじめ設定された数のビーズにおけるFICO erything蛍光強度がFM FIとして報告されます。まず最初のウェルを読み取り、選択したビーズパネルがテストウェルのビーズプロファイルと一致しているかを確認してください。

プロトコル表示において、ビーズが指定されたビーズ領域外に脱落している場合は、プロファイル選択が間違っています。適切に再懸濁されたビーズは、アッセイリーダーソフトウェアに示される通り、指定された領域を満たします。ビーズが凝集している場合は、領域を満たす速度が遅くなります。

テストプレートをリーダーから取り出し、手動でウェルを再懸濁してビーズを分離させることができます。テストプレートをリーダーから取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルを3〜4回ピペッティングしてください。その後、テストプレートをリーダーに戻し、結果の確認を続けます。

ビーズ数の不足やIgG anti IgGビーズスコアの低下などのエラーを報告し、これらのサンプルのアッセイを繰り返してください。データをExcelにエクスポートしてネットMFIを算出した後、高範囲免疫血清を除くテストプレイアッセイコントロールに不合格がないか確認します。コントロールに不合格がある場合は不適格であり、アッセイを繰り返す必要があります。

この表は、標準的なアッセイプレートにおけるテスト血清およびアッセイコントロールのデータを示しています。すべてのIgGコントロールは合格しました。このプレートのテスト結果では、オレンジ色のウェルで示されているように、多数の組織反応性サンプルおよびIgGコントロールサンプルが不合格となったことを示しています。

A1C 1およびF1は、TC組織反応性の不合格を示しており、TCスコアは括弧内に表記されています。Wells B 1およびE 1は、それぞれBAGまたはSPEに起因する、テスト抗体またはテスト試薬の不足という2種類のIgG内部コントロール不合格例を示しています。テストプレートの結果は、システム適合性コントロールおよび血清コントロールが、ここに示す判定基準を満たしている場合にのみ解釈されます。種特異的な抗テスト血清免疫グロブリンでコーティングされたマイクロスフィアは、サンプル添加量の不足、過剰なサンプル希釈、種の誤り、または免疫不全個体由来のテスト血清の使用により、不合格スコアを示すことがあります。

テストプレイアッセイのコントロール結果が良好であれば、個々のアッセイスコアを以下に従って分類します。この手順の後、初期の予期せぬ結果または陽性結果を確認するために、ELISA、IFA、および/またはウェスタンブロットなどの追加手法を用いる必要があります。動物の管理に関する決定を下す前に、これらの結果を検証することが極めて重要です。

これは、同一のサンプルまたは同一コロニーからの追加サンプルに対して異なる手法を用いることで実施可能です。このビデオを視聴することで、マルチプレックス蛍光定量免疫測定法の実施方法と、自施設で得られた結果の解釈方法について十分に理解できるはずです。これにより、各テストサンプルのウェルからより多くの情報を収集しながら、手間を削減することが可能になります。