多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング
December 12th, 2011
ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。 MFIA試験法だけでなく、様々なトラブルシューティングのトピックが扱われています。
次の実験の全体的な目標は、実験動物における外来性感染性病原体に対する抗体を検出することです。これは、試験血清を抗原コーティングされたマイクロスフェアとインキュベートすることによって達成されます。次に、血清をビオチン化タグ付き種特異的抗免疫グロブリンとインキュベートし、抗原抗体免疫複合体を検出します。
次に、ビオチン化免疫グロブリンを検出するために、ストレプトアビジン標識FICO eryn Fluor force溶液を添加し、マルチプレックス蛍光、免疫測定ネットスコア、蛍光サンプル値に基づいて、実験室のげっ歯類の一般的な薬剤に対する陽性または陰性の抗体状態を示す結果が得られます。Elizaのような既存の方法よりもこの手法を使用する主な利点は、MFIAがマルチプレックスアッセイであることです。これにより、研究者は1回のテストで最大100種類のアッセイをスクリーニングできます。
この手法は、既存の方法で使用される血清領域と廃棄使い捨ての量を減らしながら、1回の検査から生成される情報量を増やします。この方法を使用することを最初に考えたのは、複数の薬剤に対して多数のSeraサンプルをテストしていて、テスト時間だけでなく労力も削減したいと考えていたときでした。手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の上級技術者であるDonna Cohenです まず、マルチプレックス、蛍光、イムノアッセイ、またはMFIA手順に必要な2つのバッファーを用意しています。
1つ目は一次希釈剤で、Charles Riverから入手可能で、アッセイ洗浄バッファーの非特異的相互作用を減少させる独自のブロッキング剤が含まれています。微粒子を除去するために、1%BSA pH 7.4のPBS溶液を調製します。アッセイ洗浄バッファーを使用して、0.2ミクロンのボトルトップユニットでバッファーをろ過し、滅菌ラベル容器に入れます。
2 x 濃度のビオチン化抗抗体種、IGG または BAG および連鎖球菌 AVID および FICO erything または SPE を調製し、試験血清インキュベーション ステップ中に形成された抗原抗体複合体を標識するために使用されます。これは、マルチチャネルおよびシングルチャネルのマイクロピペットとチップを組み立てた次の材料と使い捨てのサンプルを調製し、タンパク質希釈用の 96 ウェル低タンパク質結合マイクロタイタープレートを調製します。血液サンプルを採取し、血清を分離した後、血清を短時間ボルテックスしてから、サンプルを96ウェルマイクロタイタープレートの一次希釈液で希釈し、適切で均一なウェル排出を事前に行います。アッセイ洗浄バッファーを備えた96ウェルテストプレートのすべてのウェルは、アッセイ全体を通して溶液をゆっくりと吸引します。
ビーズの凝集やフィルターメンブレンへのビーズの圧縮を防ぐために、吸引には5〜10秒かかる必要がありますが、どちらもアッセイ終了時の読み取り時間が遅くなる可能性があります。液体の排出が止まったことを確認するために、テストプレートの下側をペーパータオルで吸い取ります。インキュベーション中にウェルから吸い出されるのを防ぐために、洗浄ステップごとにテストプレートをブロットすることが重要です。
ビーズを調製するには、ストック結合ビーズ懸濁液をボルテックスすることから始めます。次に、お風呂でそれらを簡単に超音波処理します。ビーズクラスターが凝集して読み取り時間が長くなるのを防ぐために、ビーズを適切に再懸濁することが重要です。
次に、20 x ストック懸濁液を一次希釈液中の 2 x ワーキングビーズ溶液に分注します。次に、2 x ビーズ懸濁液の 50 マイクロリットルを、予め接液した試験プレートの各アッセイウェルに分注します。各2×テストおよびコントロール血清の50マイクロリットルを、事前定義されたプレートマップに基づいてテストプレートにピペットで移します。
蓋をプレートに固定します。それをアルミホイルで覆い、アッセイの成功を妨げる可能性のある溶液の蒸発を避けるために、室温でオービタルシェーカーでテストプレートを60分間インキュベートします。すべてのインキュベーションステップでは、テストプレートをプレートの蓋で覆ったままにしてください。
さらに、速度の振れは400RPMより大きく、700RPM未満で、ビーズが懸濁状態のままで、血清抗体が共役抗原のすべての表面にアクセスできるようにする必要があります。BADおよびSPEによるビーズの逐次インキュベーションでプレートを洗浄した後、サンプルを再度洗浄します。次に、125マイクロリットルのアッセイを加えてビーズを再懸濁し、洗浄し、緩衝液を洗浄し、2分間振とうしてプレートを読み取ります。
ビーズを懸濁させてから10分以内にアッセイリーダーに入れると、ビーズは一度に1つずつ検出器を通過し、2つのレーザーにさらされます。1つのレーザーはビーズの色セットを識別する内部色素を励起し、もう1つのレーザーはFICOレポーター色素を励起します。所定の数のビーズに対するFICOの蛍光の強度は、FM FIが最初のウェルを読み取って、選択したビーズパネルがテストウェルのビーズプロファイルと一致することを確認するときに報告されます。
プロトコルディスプレイ上の指定されたビーズ領域外にビーズがある場合は、誤ったプロファイル選択が行われました。適切に再懸濁されたビーズは、アッセイリーダーソフトウェアに示されているように、指定された領域に充填されます。ビーズが凝集すると、ビーズの領域はゆっくりと埋められます。
テストプレートをリーダーから取り外し、手動でウェルを再懸濁してビーズを分離できます。テストプレートをリーダーから取り外し、マルチチャンネルピペッタートライレートを使用して各ウェルを3〜4回行います。次に、テストプレートをリーダーに戻し、結果の確認を続けます。
ビーズカウントが不十分であったり、IgG抗IgGビーズスコアが低下しているなどのエラーを報告し、これらのサンプルに対してアッセイを繰り返します。データをExcelにエクスポートし、正味MFIを計算した後、高範囲の免疫血清を除外したテストプレイアッセイコントロールのいずれかかどうかを判断します。失敗したコントロールは許容できず、アッセイを繰り返す必要があります。
この表は、一般的なアッセイプレートからの試験血清およびアッセイコントロールのデータを示しています。すべてのIgGコントロールに合格しましたか。このプレイの試験結果は、オレンジウェルに見られるように、多数の組織反応性およびIgGコントロールサンプルが失敗したことを示しています。
A1C 1 と F1 は TC 組織反応性障害を示し、TC スコアは括弧内で表されます。Wells B と E 1 は、それぞれ 2 種類の IgG 内部制御障害、不十分な試験抗体または試験試薬、BAG または SPE を示しています。テストプレートの結果は、システム適合性コントロールと血清コントロールがここに示す許容基準を満たしている場合にのみ解釈されます。種特異的抗試験血清免疫グロブリンでコーティングされたマイクロスフェアは、不十分なサンプルの添加が高すぎる、サンプルの希釈、誤った種、または免疫不全宿主からの血清の検査により、スコアが低下する可能性があります。
テストプレイアッセイコントロールの結果が満足のいくものである場合、個々のアッセイスコアを以下のように分類します。この手順に続いて、Eliza、IFA、またはウェスタンブロットなどの追加の方法を使用して、最初の予期しない所見または陽性の結果を確認する必要があります。動物管理の決定を下す前に、これらの結果を確認することが重要です。
これは、同じサンプルまたは同じコロニーからの追加サンプルで異なる分析法を使用することで実行できます。このビデオを見れば、マルチプレックスフルオロ、メトリックイムノアッセイの実施方法、および施設で得られる結果の解釈方法について十分に理解できるはずです。これにより、各テストサンプルウェルからより多くの情報を収集しながら、労力を削減できます。
概要
この研究は、ラボ動物における血清疫学調査のためのLuminex CorporationのxMAP技術を使用したMultiplexed Fluorometric ImmunoAssay（MFIA）の開発を提示します。MFIAは複数の感染性因子に対する抗体の同時検出を可能にし、効率を向上させ、検査における資源使用を削減します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 血清学的検査
- 実験動物の健康
背景
- ELISAのような従来の血清学的方法は時間と資源を多く必要とします。
- MFIAは多重化を可能にし、多数のアッセイを同時にスクリーニングすることができます。
- この方法はラボ動物における抗体の検出を改善することを目指しています。
- 血清サンプルと使い捨て品の効率的な使用はMFIAの主要な利点です。
研究の目的
- ラボ動物における感染性因子に対する抗体を検出するためのより効率的な方法を開発すること。
- 従来の方法に関連する労働と検査時間を減少させること。
- 単一の検査で抗体状態の包括的な評価を提供すること。
使用された方法
- テスト血清と抗原被覆マイクロ球とのインキュベーション。
- 抗原-抗体複合体を検出するためのビオチン化抗免疫グロブリンを使用。
- 蛍光測定のためのストレプタビジン標識検出溶液の適用。
- 96ウェルマイクロタイタープレート形式を使用したマルチプレックスアッセイのセットアップ。
主な結果
- ラボ動物における様々な感染性因子に対する抗体の検出に成功。
- 従来のアッセイと比較して血清量と使い捨て品の使用が減少したことを示しました。
- マルチプレックス蛍光分析を通じて定量的な結果を提供しました。
- アッセイ性能に影響を与えるビーズ凝集の潜在的な問題を特定しました。
結論
- MFIAは従来の血清学的方法の有効な代替手段です。
- この技術はラボ設定における血清疫学調査の効率を向上させます。
- 技術的課題に対処するためにさらなる最適化が必要かもしれません。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) addresses the need for high-throughput serosurveillance in preclinical research by enabling simultaneous detection of antibodies against multiple infectious agents. This capability reduces sample consumption, reagent use, and assay time while increasing data density per test well. For biopharma R&D, MFIA supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative immune status data from limited preclinical sample volumes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through broad pathogen exposure profiling in animal models.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying confounding variables from adventitious infections.
- Predictive Confidence: Enhances portfolio triage by identifying models with compromised immunological integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through rigorous health status verification.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal control beads (tissue, IgG, and system suitability controls).
- Scalability: Enables screening readiness for up to 100 assays per well, improving platform reuse in antibody screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by ensuring animal models are free from confounding infectious agents that could skew phenotypic readouts.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by maintaining model integrity across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on serological health status before compound administration.
Pipeline & Workflow Integration
MFIA fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, serving as a gatekeeping step for model suitability before compound screening or efficacy testing.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by verifying that observed phenotypes are not driven by subclinical infections.
- Screening: Describes assay readiness through quantitative net MFI outputs and built-in controls that ensure data reliability.
- Analytics: Highlights multiplex fluorescence measurements and net score calculations that enable comparison across test conditions and antigen panels.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by ensuring that disease-relevant systems remain immunologically naive or appropriately characterized.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for ongoing colony health monitoring across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity from infectious confounders.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via multiplexed bead-based detection and internal controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk from undetected pathogen exposure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on verified animal model health.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunoassay principles, Luminex technology, and multiplex data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including a Luminex reader, plate shaker, and fluorescence detection system.
- Cross-team standardization requirements for reagent preparation, bead handling, and wash protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, including species-specific antigen selection and control bead validation.
- Practical limitations supported by source material: bead aggregation affecting read times and the necessity of proper resuspension to avoid false negatives or elevated background.
