部位特異的架橋法を用いた分泌細菌病原性因子の集合体のモニタリング

次の実験の全体的な目標は、生細胞内のタンパク質タンパク質相互作用のダイナミクスを調べることです。これは、まず目的のタンパク質を大腸菌に発現させ、アミノ酸類似体であるベンゾイルフェニルアラニンをタンパク質の特定の位置に組み込み、パルスチェイスラジオ標識を行うことで、同期的に合成されたタンパク質分子の小さな集団にタグを付けることで達成されます。第二のステップとして。

追跡中のさまざまな時点で収集された細胞のアリコートを照射して、目的のタンパク質とそれが相互作用している任意の因子との間に共有結合の形成を引き起こします。次に、タンパク質を特異的抗体で免疫沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して相互作用因子を同定し、架橋生成物の電気泳動移動度の変化に基づいて、目的のタンパク質と他の細胞内因子との間の相互作用の経時的な変化を示す結果が得られる。この手法が、共免疫沈降法や化学的架橋法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、目的のタンパク質の特定の残基と他の分子との間で発生する相互作用に関する時間情報を生成する能力です。

このようなデータは、多段階の集合経路を通るタンパク質の進行を研究し、集合中間体を同定する場合に特に価値があります。この方法は大腸菌での使用に最適化されていますが、他の細菌、酵母、哺乳動物細胞など、他のシステムでも使用できます。培養調製の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

簡単に0.2%グリセロールを含むM nine培地の5ミリリットルを準備し、メチオニンとシスチンと抗生物質を除くすべてのelアミノ酸は、琥珀色の突然変異を持つ目的のタンパク質をコードするプラスミドと琥珀色の抑制システムをコードするプラスミドを添加することにより、一晩培養を開始します37°Cでインキュベートします。実験当日は、50ミリリットルのMナイン培地と抗生物質を配合した250ミリリットルの三角フラスコに、一晩培養した細胞を適量加え、550ナノメートルの光学濃度0.03を得る。培養物を摂氏37度で振とうする水浴中でインキュベー

培養物が初期から中期の対数期に達したら、各培養物に50マイクロリットルの1モルベンゾイルフェニルアラニンまたはBPAを追加します。フラスコを渦巻かせながらBPAを1滴ずつ加えて、降水を避けます。次に、琥珀色の変異体の発現を促進するために必要なインデューサーを追加します。

30分間のインダクション期間中に、培養物を摂氏37度でさらに30分間インキュベートし続けます。6本の使い捨て15ミリリットル遠心分離チューブに、時点とプラスUVまたはマイナスUVのいずれかをラベル付けします。ラベルの付いたチューブを氷の上に置きます。

氷で満たされた2つ目の氷バケツの上に6ウェル組織培養プレートを置きます。UVをオンにしますlamp ラジオラベリングの5分前。次に、マイナスUVとラベル付けされた各チューブとマルチウェルプレートの2つのウェルに約2ミリリットルの氷を追加します。

各時点で細胞内反応を直ちに停止し、それによって生化学的経路の正確なスナップショットを取得するために、チューブやウェルに直接氷を空気で注入することが不可欠です 30分間の誘導期間の終わりに。25ミリリットルの培養物を予め温めた125ミリリットルの使い捨て三角フラスコに移します。フラスコを摂氏37度の揺れる水浴に入れます。

パルスチェイスラベリングとUV照射のステップは、タイムリーに実行する必要があり、かなりの組織化と高度な準備が必要です。S 35標識メチオニンとシステインを1ミリリットルあたり30マイクロキュリーを培養物に加え、すばやく渦巻いて時間ごとに混合します。1分0秒。

250マイクロリットルの非放射性100ミリモルメチオニンシステイン溶液を加え、すばやく渦巻きます。すぐにピペットで4ミリリットルの培養物をピペットで、氷ピペットを含む冷やしたマルチウェルプレートのウェルの1つにピペットで、2番目の4ミリリットルのアリコートを15ミリリットルのチューブにゼロ分マイナスUVとラベル付けします。2分0秒。

4ミリリットルの培養物を、氷を含む冷やしたマルチウェルプレートの2番目のウェルにピペットで移します。次に、さらに4ミリリットルのアリコートを、5分からUVを引いたラベルの15ミリリットルチューブにピペットで入れ、5分からUVを差し引いた約2ミリリットルの氷でマルチウェルプレートの3番目のウェルに6分0秒でピペットで入れます。4ミリリットルの培養物を、アイスパイプを含む冷却マルチウェルプレートの3番目のウェルにピペットで入れます。

5分マイナスUVとラベル付けされた15ミリリットルのチューブに別の4ミリリットルのアリコートがありました。マルチウェルプレートを装着したアイスバケツを予熱したUVランプの下に置き、各サンプルを個別に4分間照射します。細胞を、0分とUVと、1分とUVとラベル付けされた冷却した15ミリリットルのチューブに移します。

次に、細胞を2,500倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。各サンプルを300マイクロリットルのMナインミディアムまたはPBSと33マイクロリットルの100%冷たいトリクロロ酢酸またはTCAに再懸濁してタンパク質を沈殿させ、TCAを遠心分離機にかけ、最高速度で10分間マイクロフュージで沈殿させます。セートを除去する前に、各サンプルに50マイクロリットルの可溶化緩衝液を加え、摂氏95度で5分間攪拌して沈殿したタンパク質を可溶化します。

1ミリリットルのラジオ免疫沈降アッセイバッファーを添加した後、各サンプルの5分の1〜2分の1を用いて標準的な免疫沈降を行う。免疫沈降タンパク質を、ESAL硫酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはSDSページにより分解します。最後に、染色および乾燥したゲルをリン酸化スクリーニングに一晩さらし、リン酸化イメージャーで架橋製品を含む放射性タンパク質を検出するために、部位特異的なフォトクロスリンキングを使用して、外膜への移動中にESPPと相互作用するタンパク質を同定しました。

この実験では、ESPPベータドメインの残基1113および1214のpHアラニンコドンをアンバーコドンに置換しました。ESPPベータドメインの結晶構造は、2つの残基が両方ともベータバレルのペリプラスミック側にあり、約120度離れていることを示しています。2つの異なるポリペプチドを、C末端抗ESPPおよび血清により照射した細胞および対照細胞の両方から免疫沈降させた。

当初、共有結合した乗客ドメインとベータドメインを含むタンパク質の約135キロダルトンの前駆体型が、後の時点で優勢でした。PRO ESPPのレベルは低下し、乗客ドメインが外膜を横切ってトランス位置し、タンパク質分解性切断によってベータドメインから分離されたため、遊離ベータドメインが優勢になり始めました。しかし、UV Iを放射したサンプルは、対照サンプルには存在しなかった高分子量のバンドを明らかに持っていました。

これらのバンドは、これらのポリペプチドの移動性に基づいて、PRO ESPPと相互作用タンパク質への架橋から生じ、相互作用タンパク質のサイズを推定して、それらが既知の外膜タンパク質集合因子に対応するかどうかをテストしました。推定相互作用パートナーに対して生成された抗セラを用いた追加の免疫沈降を行った。BPAが両方の残基1113および1214に組み込まれたときに観察された約150キロダルトンのポリペプチドは、17キロダルトンのペリプラズマシャペロンスキップに対する抗血清により免疫沈降させることができた。

さらに、BPAが2つの位置のうちの1つだけに組み込まれたときに観察されたより大きなポリペプチドは、BAM複合体サブユニットであるBAM BおよびBAM Dに対して抗セラで免疫沈降できることがわかりました。この手順を実行した後、架橋生成物を精製し、質量分析などの他の方法を実行して、目的のタンパク質と相互作用する因子を同定することができます。ビデオで視聴した後は、パルスチェイスラベリングと部位特異的な写真クロスリンクをうまく組み合わせて、目的のタンパク質と生細胞内の他の分子との相互作用のダイナミクスを研究する方法を十分に理解しているはずです。