マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

ミジン類似体であるEdUで標識された増殖神経幹細胞を含む、神経細胞を含む固定マウス脳切片を採取します。

溶液の広がりを防ぐために、疎水性マーキングでセクションの輪郭を描きます。

洗剤を加えて組織を透過させます。余分な洗剤を取り除くために洗います。

光色素を追加して、EdUを標識します。余分な蛍光色素を取り除きます。

蛍光顕微鏡を使用して、EdU標識細胞の適切な染色を確認します。

タンパク質を含むブロッキングバッファーを塗布して、非特異的抗体の結合を防ぎます。余分なタンパク質を取り除きます。

神経幹細胞の特定のタンパク質に結合する一次抗体とインキュベートします。結合していない抗体を除去します。

蛍光色素結合二次抗体を添加して、一次抗体に結合します。結合していない抗体を洗い流します。

核を染料で染色し、余分な染料を取り除きます。

疎水性マーキングを取り外し、封入剤を塗布し、カバーガラスを置きます。

共焦点顕微鏡を使用して、切片を観察して標識された神経幹細胞を視覚化します。

組織切片をチミジン類似体で染色するには、クエン酸緩衝液から組織切片を取り除きます。疎水性ペンで境界線を描く前に、組織切片を乾燥させてスライドに完全に接着させます。次に、透過処理バッファーで切片を20〜30分間透過処理します。TBS Tritonを使用して、毎回5分間切片を2回洗浄します。次に、EdU反応溶液を調製します。

切片をEdU反応溶液中で30分から1時間インキュベートします。その後、TBS Tritonで毎回5分間3回洗浄します。この段階で、蛍光顕微鏡を使用してEdU反応が機能するかどうかを確認します。反応が機能するかどうかは、EdU標識細胞を観察する必要があります。次に、二次抗体と同じ動物で増菌したブロッキングバッファーを使用して、マウントされた組織切片を30分から1時間ブロックします。その後、TBSトリトンで毎回5分間2回洗います。

ブロッキングステップでは、一次抗体をブロッキングバッファーに混合して一次抗体溶液を調製します。その後、スライドごとに250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えて、組織切片が完全に水没することを確認し、室温で一晩インキュベートします。翌日、組織切片をTBS Tritonで5分間3回洗浄し、余分な一次抗体を除去します。

次に、ブロッキング緩衝液中で調製した蛍光色素結合二次抗体で組織切片を室温で2時間インキュベートします。組織切片をTBS Tritonで5分間3回洗浄し、余分な二次抗体を除去します。次に、300マイクロモルのDAPI溶液をPBS中で1〜100で室温で15分間塗布します。その後、組織切片をPBSで5分間3回洗浄して余分なDAPIを除去し、綿棒を使用して組織の周りのPAPペンサークルを取り除きます。封入媒体を塗布し、カバーガラスで覆う前に、セクションを乾燥させてください。