免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

マウスの脳から海馬スライスをバッファーを含むウェルに入れます。スライスには、シナプスを介して通信するニューロンのネットワークが含まれています。

シナプス前ニューロン末端には、特徴的な膜貫通トランスポーターを持つ神経伝達物質で満たされた小胞が含まれていますが、シナプス後終末には、神経伝達物質受容体を調節する特徴的な足場タンパク質が特徴的です。どちらもシナプス構造の重要なマーカーとして機能します。

バッファーを透過処理遮断溶液に置き換え、撹拌しながらインキュベートして細胞膜を透過処理し、非特異的結合部位をブロックします。

シナプス前およびシナプス後マーカーを標的とする一次抗体を加え、結合を可能にするために撹拌しながらインキュベートします。

スライスを洗浄し、一次抗体に特異的な蛍光色素結合二次抗体を加え、暗所で撹拌しながらインキュベートします。

スライスを洗ってから、スライドにマウントします。

共焦点顕微鏡を使用して、関心領域を特定し、拡大してシナプスを視覚化します。

画像をキャプチャして、蛍光標識されたシナプス前およびシナプス後マーカーを特定し、シナプスでの共局在を評価します。

免疫蛍光染色を開始するには、スライスウェル内のPBSをブロッキングおよび透過処理バッファーに置き換え、シェーカー上で室温で4〜6時間インキュベートします。ブロッキングステップの終わりに向かって、VGLUT1 1に対する抗体をブロッキングおよび透過処理バッファーで2000に希釈します。この希釈量は、使用する抗体の会社やロットによって異なる場合がありますのでご注意ください。スライスを一次抗体溶液中で摂氏4度で一晩インキュベートします。激しい動きで振るプラットフォームを使用してください。

最適な染色には、一次抗体と二次抗体の均一な分布が重要です。私たちの経験では、激しい振とうが最高の抗体浸透を可能にします。

一次抗体でインキュベートした後、スライスをPBSで3回、毎回10分間洗浄します。最後の洗浄中に、適切な二次抗体をブロッキングバッファーで1〜500に希釈します。次に、スライスをこの溶液中で室温で2〜3時間インキュベートします。二次抗体は光に敏感であるため、スライスが光から保護されていることを確認してください。

以前と同じようにスライスを洗浄した後、ブラシを使用して24ウェルプレートからスライスを慎重に取り除き、事前にラベルを付けたスライドガラスに均等に置きます。各スライスの上に封入剤を一滴加えます。そして、気泡の発生に注意しながら、スライスの上にガラスカバーガラスをそっと置きます。

光から保護し、スライドを室温で最低3〜4日間乾燥させます。スライドは短期的に摂氏4度で保管してください。ただし、長期保管の場合は、摂氏マイナス20度に保管してください。まず、10倍または20倍の対物レンズを使用して、画像化する海馬の領域(この場合は、CA1錐体ニューロンとシェーファー側副軸索の間のシナプス)を特定します。

40倍または63倍の油浸対物レンズに変更し、連続した神経突起と組織化された構造を特定することで、スライスの解剖学的構造が損なわれていないことを確認します。MAP2などのニューロンマーカーを基準として使用します。各チャンネルの設定を調整して、最適な信号と 1024 x 1024 ピクセルの解像度のコントラストを取得します。各レーザーの強度を設定して、ピクセルの飽和を回避します。

染色が均一な深さを評価し、少なくとも8つの等距離の250ナノメートル平面の画像スタックを取得するようにソフトウェアを設定します。次に、スライスごとに同じ関心領域から 3 つの隣接する代表的な画像スタックを取得します。条件ごとに少なくとも3つのスライスで、治療グループごとに6〜8匹の動物で取得を繰り返します。