成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

異なる分化段階にあるニューロンの前駆細胞で構成される神経新生の部位である海馬歯状回からなるマウスの脳切片を取り上げます。

切片を透過処理遮断溶液に移します。溶液中の界面活性剤分子は細胞を透過処理し、タンパク質は非特異的結合部位をブロックします。

特定の神経新生マーカーを標的とする一次抗体カクテル、微小管関連タンパク質、および中間フィラメントタンパク質を追加します。

結合していない抗体を除去します。一次抗体に結合する異なる蛍光色素標識二次抗体を導入します。

一次抗体の1つとして同じ宿主からの血清タンパク質を追加し、二次抗体のパラトープを飽和させます。

血清タンパク質のエピトープを飽和させ、非特異的結合を防ぐ一価のFabフラグメントを導入します。

同じ宿主が産生した2番目の一次抗体を追加し、別の中間フィラメントタンパク質に結合します。

第2一次抗体を標的とする蛍光色素標識二次抗体を導入します。

蛍光顕微鏡を使用して、固有のマーカーの組み合わせを発現するニューロン前駆細胞サブタイプを特定します。

いブラシを使用して、不凍液から TBS にセクションを移すことから始めます。摂氏 4 度で一晩洗浄することから始めて、室温で 10 分間 5 回洗浄し、切片を徹底的にすすぎます。これらのインキュベーションはすべて、継続的に穏やかに攪拌して行う必要があります。

目的の抗原の1つがチミジン類似体である場合、この時点で塩酸変性ステップを実行し、続いてホウ酸緩衝液で中和ステップを実行する必要があります。TBS-plusの非特異的抗体結合部位の透過処理とブロッキングを進めます。このインキュベーションを室温で1時間放置します。

次に、TBS-plusで希釈した最初の一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBSで3回、TBS-Tで1回洗浄します。各お風呂を10分間放置します。次に、最初の蛍光色素結合二次抗体で室温で3時間インキュベートします。今後は、セクションを光にさらさないように保護してください。

別の洗浄シリーズの後、切片を2つの一次抗体を作製した10%宿主種血清溶液に移します。この溶液中で切片を3時間インキュベートして、最初の二次抗体の開いたパラトープを飽和させます。その後、TBSで3回、TBS-Tで1回すすぎ、血清を除去します。

次に、一次抗体の宿主種に向けられた非抱合一価Fabフラグメントを1ミリリットルあたり50マイクログラムのTBS-plus溶液調製します。これは、2番目の二次抗体によって認識される可能性のあるエピトープをカバーします。切片をこの溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、切片をTBSで少なくとも3回、TBS-Tで1回すすぎます。移送中は、ペーパータオルの切片を含むメッシュインサートを綿棒で拭き取り、Fabの残り物を取り除きます。次に、2番目の一次抗体の切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。

別の洗浄シリーズの後、2番目の二次抗体を室温で3時間適用します。最後に、切片をTBSで3回洗浄し、ゼラチンで切片を取り付けます。スライドを自然乾燥させ、色あせ防止封入剤を使用してカバースリップします。