生理活性、PCLベースの「セルフフィット」形状記憶ポリマー足場の作製

本実験の全体的な目的は、骨統合（osteointegration）および治癒を促進するために、不規則な形状の頭蓋顎顔面欠損部に自己適合可能な形状記憶ポリマー（SMP）スキャフォールドを作製することです。これは、まず溶媒キャスト法とポリカプロラクトンジアクリレートの光化学的硬化を用いて、融合塩テンプレートを形成することで達成されます。この塩テンプレート上に、骨伝導性に必要な高度に相互連結した多孔性を備えたスキャフォールドを形成します。

第二のステップとして、生物活性を付与するために、スキャフォールドをポリドーパミンでコーティングします。次に、スキャフォールドを温 saline で処理し、不規則な形状のモデルにプレスフィット（圧入）できるようにします。プレスフィットの結果、走査型電子顕微鏡（SEM）画像、およびin vitroでのヒドロキシアパタイト形成に基づき、自己適合性、低い相互接続性、および生物活性を示す欠損結果が得られます。

自家移植などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、適合性の高いフィッティングが実現されることで、骨統合と骨治癒が決定的にサポートされることです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程学生であるLindsey Nailです。スキャフォールドの調製を開始するために、まず塩化ナトリウムを425 micronのふるいで漉し、その1.8 gramsを3リットルのガラスバイアルに移します。そこに脱イオン水を146 milligrams、金属製スパチュラで混ぜながらゆっくりと4回に分けて加えます。

各試薬を添加した後、バイアルに蓋をし、ティッシュで包んで遠心チューブに垂直に配置します。チューブを15分間遠心分離し、その後、蓋を開けて溶液を一晩自然乾燥させます。本文のプロトコルに従ってP-C-L-D-Aを合成した後、ガラスバイアルにクロロメタン1 mLあたり150 mgのP-C-L-D-Aを含むマサー溶液を調製し、バイアルに蓋をしてアルミホイルで包み、1分間ボルテックスミキサーで撹拌します。

次に、1 mLの1-ビニル-2-ピロール中に115 mgのDMPを含む光開始剤溶液をガラスバイアルで調製します。再びバイアルに蓋をし、アルミホイルで包み、1分間ボルテックスします。光開始剤溶液をマセレーション溶液にピペッティングして容量比15%の混合液とし、バイアルを1分間ボルテックスします。

次に、塩 scaffoldを含むバイアルをアルミホイルで包み、塩が完全に浸るまで光開始剤マセレーション混合液を加えます。バイアルにキャップをし、ティッシュで包んで遠心管に垂直に配置します。このチューブを10分間遠心分離します。

次に、フォイルを取り除き、バイアルのキャップを開けて、溶液に3分間紫外線を照射します。その後、溶液を一晩自然乾燥させ、ピンセットを用いてガラスにスコアを入れて破断し、バイアルの上部を取り除きます。足場を水とエタノールの1:1溶液に移し、溶液を毎日交換しながら4日間保持します。

最後に、SMPスキャフォールドを取り出し、一晩風乾させます。ポリドーパミンコートを塗布するには、まず20ゲージの針をSMPスキャフォールドの半分まで挿入し、次に針のハブにワイヤーを巻き付けます。スキャフォールドを200 millilitersの攪拌中のドーパミン溶液に浸し、ワイヤーをビーカーの縁に固定して、針のハブが溶液より上の位置に保持されるようにします。

次に、シリンジをニードルハブに装着し、プランジャーを引いてスキャホールドから空気を除去します。完全に脱気された後、スキャホールドを16時間浸漬させたままにします。その後、溶液からスキャホールドを取り出し、ニードルを抜きます。

その後、脱イオン水でスキャフォールドを洗浄し、真空乾燥機を用いて室温で24時間乾燥させます。スキャフォールドを乾燥機に入れ、85 °Cで1時間加熱します。最後に、スキャフォールドを取り出し、室温まで冷却させます。

まず、厚さ5 mmの硬質プラスチック板に、平均直径約6 mmの不規則な空隙をドリルで開け、欠損モデルを作製します。次に、SMPスキャフォールドを約60 °Cの脱イオン水が入ったビーカーに2分間浸します。ピンセットを用いて形状を操作し、スキャフォールドが明らかに軟化したことを確認してください。

ピンセットで軟化したスキャフォールドを水から取り出し、欠損モデルに手で押し付けます。スキャフォールドが室温まで冷却されるまで待ち、その後、欠損モデルから取り出します。新しく固定された一時的な形状を観察し、ポア、相互接続性、およびサイズを確認します。

まず、ピンセットを用いてSMPスキャフォールドを液体窒素に1分間浸します。次に、清潔なカミソリでスキャフォールドの中央を破断させます。続いて、破断面を上にして、スキャフォールドの半分をサンプルステージ上に固定します。

カーボンテープを用い、金および白金合金でスキャフォールドを約4 nmの厚さにスパッタコーティングします。試料をSEMに装填し、加速電圧10〜15 kVで画像を撮影します。これは、in vitroでの生物活性を評価するためです。

まず、清潔なブレードを使用して、円筒形のSMPスキャフォールドを円形の縁に沿って半分に切断します。スキャフォールドの半分を30 millilitersの擬似体液を含むチューブに入れ、14日後にそのチューブを37 degrees Celsiusの定温水槽に置きます。スキャフォールドをチューブから取り出し、24時間自然乾燥させます。

次に、カーボンテープを用いて、切断面を上にしてスキャフォールドを電子顕微鏡の試料ステージに固定します。その後、スキャフォールドの表面に金白金合金を厚さ約4 nmになるようにスパッタコーティングします。前述と同様に、試料をSEMに装填し、加速電圧10～15 kVで画像を撮影します。

SMPスキャフォールドは60°Cで加熱すると可塑性が増し、欠損モデルに適合させることができます。室温まで冷却した後、SMPスキャフォールドを取り出すと、新しく固定された一時的な形状が保持されます。コーティング前のSMPスキャフォールドの走査電子顕微鏡写真には、孔構造と高度に相互連結した形態が示されています。

走査電子顕微鏡写真に示されているように、孔内にヒドロキシアパタイトが形成されたことで、ポリドーパミンコーティングを施したSMPスキャフォールドの生物活性が実証されています。このビデオを視聴することで、溶媒キャスト法、塩テンプレートを用いた粒子浸出法、およびポリドーパミンコーティングの適用を含むプロセスを用いて、生物活性を持つ自己適合性形状記憶ポリマースキャフォールドを作製する方法について十分に理解できるはずです。