ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。

本研究は、メルト電気足場とヒトiPS細胞由来心細胞を用いた生体認証3次元心臓組織の開発を目指し、疾患モデリング、薬物試験、再生医療への応用を改善することを目的としています。幹細胞心筋細胞におけるヒトによる報告は未成熟のままであり、その機能には限界があります。さらに、心臓組織を3Dでモデル化するために必要な深刻な複雑さを再現することは困難です。

このモデルは、天然の心筋をよりよく模倣し、疾患モデリング、薬物試験、および患者固有のアプリケーションのための複雑な3D細胞外マトリックス相互作用を可能にします。これは、2Dカルチャーや動物モデルに代わる、より適切な選択肢を提供します。今後は、ブタなどの大型動物モデルにおける心筋梗塞治療のための心筋梗塞治療のための心筋モデル研究、3次元組織成熟プロトコルの強化、より大きなコンストラクトの開発に注力していきます。

まず、シリンジを加圧窒素供給パイプに接続し、加熱チャンバー内に導入します。メルトエレクトロスピニング筆記具の電源を入れ、温度調節器をチャンバーが摂氏80度、ノズルが摂氏65度に設定します。30分後、プリントヘッドがプレートの一方の端または任意の場所に配置されるまで、コレクタープレートを動かします。

加熱チャンバーとコレクタープレートの間の距離をz平面で10ミリメートルに手動で調整します。電界供給を自動的に接続する機器のドアを閉じます。電圧を7キロボルトの窒素圧力で2バールに設定し、23ゲージの先端から押し出します。

ソフトウェアに設計のGコードをロードして、正方形のパターン形状の足場を印刷します。コレクターの速度を毎分1080ミリメートルに調整します。次に、サイクル開始ボタンを押して印刷を開始します。

印刷が終了したら、コレクターから足場を慎重に取り外します。直径6mmのパンチを使用してプリントされたメッシュをカットし、組織作製用の最終的な足場を得ます。足場を酸素プラズマで5分間処理します。

メッシュを70%エタノールに30分間浸して滅菌します。滅菌蒸留水で30分間広範囲に洗浄し、乾燥させます。ヒトiPS細胞心筋細胞を剥離した後、細胞ペレットを組織生成培地に再懸濁し、ノイバウアーチャンバーを用いて細胞をカウントします。

同様に、ヒトiPS細胞心線維芽細胞を剥離した後、細胞ペレットを組織生成培地に再懸濁し、細胞をカウントします。必要な全細胞を新しいチューブで混合し、内容物をCell Mixと呼んでいます。そして、室温で300Gで5分間遠心分離します。

次に、細胞ミックスを必要量の組織生成培地に再懸濁します。ハイドロゲルミックスを生成するには、室温で必要な量のフィブリノーゲンをチューブに加え、慎重に混合します。ハイドロゲルミックスをポリテトラフルオロエチレン表面に播種して、プレートへのフィブリンの付着を防ぎます。

ティッシュの半分の体積をピペットで動かし、一滴として残します。各滴の上にポリカプロラクトン(PCL)の足場を置き、残りの容量を足場に加えます。次に、必要な量のトロンビンを追加し、泡を避けながらハイドロゲルをすばやく混合します。

組織を摂氏37度で1時間インキュベートして、フィブリン重合を完了します。滅菌ピンセットを使用して各組織の端を優しくつまみ、アプロチニンを添加した組織生成培地を含む12ウェルプレートに移します。組織を摂氏37度で24時間インキュベートします。

翌日、2ミリリットルのティッシュメンテナンス培地で培地をリフレッシュし、KSRとY-27の残留物を取り除きます。ヒトiPS細胞心筋細胞とヒトiPS細胞心筋芽細胞の8〜2混合物をフィブリンハイドロゲルに播種すると、重合後1時間以内に足場の細孔全体に均一な細胞分布が得られます。共焦点免疫蛍光画像は、PCL足場と相互作用する3D組織を介した細胞の混合細胞分布を示し、サルコメアアクチニンを染色したヒトiPS細胞筋細胞の大部分がビメンチン標識ヒトiPS細胞心線維芽細胞と間隔を空けて染色されました。

ヒトiPS細胞心筋細胞は、等間隔のサルコメアアクチニンタンパク質により、よく組織化されたサルコメア構造を示します。細胞は2日目までに自発的な拍動を開始し、7日目の平均拍動頻度は毎分30拍で、メッシュ全体で安定した収縮を示しました。時間の経過とともに緩やかな減少が観察され、14日目には17BPMに達しました。

それにもかかわらず、代謝活性は7日目から14日目まで安定しており、持続的な細胞生存能力が確認されました。最後に、拍動組織のトラックポイント分析では、収縮速度は毎秒38マイクロメートル、収縮振幅は29マイクロメートルであることが示されました。