Name: 操作された血管柄マッスルフラップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T09:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ、生分解性スカフォールドを用いた血管柄マッスルフラップの作製法。マウス大腿動脈周囲への移植と自己血管柄による腹部壁欠損再建の手法を解説。再生医療における組織血管化の新たなアプローチを示す。

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この研究は、FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASCの支援を受けました。

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<li>Menon, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revascularization+of+human+acellular+dermis+in+full-thickness+abdominal+wall+reconstruction+in+the+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model.</a> Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).</li>
<li>Buinewicz, B., Rosen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+cadaveric+dermis+%28AlloDerm%29%3A+a+new+alternative+for+abdominal+hernia+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair.</a> Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).</li>
<li>Bringman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hernia+repair%3A+the+search+for+ideal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Hernia%22%5BJournal%5D)">Hernia repair: the search for ideal meshes.</a> Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).</li>
<li>Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+and+composite+scaffolds+for+abdominal+wall+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+rev+of+med+dev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction.</a> Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).</li>
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<li>Shandalov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+muscle+flap+for+reconstruction+of+large+soft+tissue+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects.</a> PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).</li>
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<li>Bearzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlGF-MMP9-engineered+iPS+cells+supported+on+a+PEG-fibrinogen+hydrogel+scaffold+possess+an+enhanced+capacity+to+repair+damaged+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+%26+disease%22%5BJournal%5D)">PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium.</a> Cell death & disease. 5, e1053(2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1+expression+by+mesenchymal+stem+cells+results+in+trophic+support+of+cardiac+myocytes+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J+%3A+official+publication+of+the+.Fed+Am+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction.</a> FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).</li>
<li>Dvir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevascularization+of+cardiac+patch+on+the+omentum+improves+its+therapeutic+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome.</a> PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).</li>
<li>Marsano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+controlled+expression+of+VEGF+by+transduced+myoblasts+in+a+cardiac+patch+on+vascularization+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+infarct+stabilization+and+neovascularization+mediated+by+VEGF-loaded+PEGylated+fibrinogen+hydrogel+in+a+rodent+myocardial+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).</li>
<li>Nillesen, S. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+angiogenesis+in+acellular+scaffolds+by+combined+release+of+FGF2+and+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Contr+Release%22%5BJournal%5D)">Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.</a> J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat Commun. 4, 1399(2013).</li>
<li>Tee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).</li>
<li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

組織工学の進歩は、様々な組織タイプの再構築のための代替組織の需要を満たしています。 1,17,18合成および生物学的材料14-16ならびに製作方法の様々なこれらの要求に対処する能力について評価されています。しかし、臨床ケアにおけるおよび組織工学の進歩にもかかわらず、全層腹壁欠損の回復が課題です。そのような大規模な欠陥の再構成のための十分な組織が ​​厚いと、（2）血管新生（1）であって、時間かけて23（3）機械的完全性、および（4）生存能力を示さなければなりません。 ここでは、自家組織フラップの代替として機能することができ、厚い実行可能な、および血管組織のフラップを作成するためのステップバイステップの詳細なプロトコールを提示します。製造されたフラップは、2ステップで構築した：（1）PLLA / PLGA足場は、MOUのAV容器の周りに移植しましたSE後肢のみのAV船による血管新生を可能にするために、周囲の組織から分離します。 （2）作成した血管新生し、厚い組織のフラップはその後、全層腹壁欠損部に、その肉茎を務めたAV...

腹壁の欠陥は、多くの場合、重篤な外傷、癌治療、火傷、感染したメッシュを除去した後に発生します。これらの欠陥は、多くの場合、複雑な外科的処置を必要とし、プラスチック再建外科医1-4のための主要な課題を提示し、重大な組織損失を伴います。人工組織のための新しいソースを求めている組織工学の研究者は、異なる材料、細胞源と成長因子が検討されています。設計組織の移植によるこのような気管5,6、膀胱7、角膜8、骨9と皮膚10などの様々な組織の成功した修復は、以前に報告されました。しかし、太い血管が新生組織工学の製造は、特に大きな欠陥の再構築のために、組織工学における重要な課題です。 生存可能な組織構築物の厚さを制限する主な要因の一つは、その短所への酸素供給の制御でありますtituent細胞。拡散に依存する場合には、厚みが非常に薄い層に限定されている構築物。 生体内で酸素や栄養供給の毛細血管の間の最大距離は約200μmで、酸素11,12の拡散限界と相関するです。不十分な血管新生は、組織虚血が生じ、組織の再吸収または壊死13にエスカレートすることができます。 また、組織の再構築に使用する理想的な材料は、生体適合性および非免疫原性である必要があります。また、生体材料による宿主細胞のさらなる統合を促進し、構造的完全性を維持することができなければなりません。様々な生物学的14-16および合成1,17,18行列は、以前に組織の再構築のために検討されている、しかし、彼らの使用は、効果的な血液供給、感染または不十分な組織強度の不足に限定されたまま。 本研究では、生体適合性、細胞EMB食品医薬品局（FDA）承認のポリL-乳酸（PLLA）/乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）、ポリで構成edded足場はヌードマウスの大腿動脈と静脈（AV）船の周りに移植したと唯一のAV血管から血管新生を確保し、周囲の組織から分離します。一週間移植後、移植片は、実行可能な厚さであり、十分に血管新生しました。 AV船でこの太い血管組織は、その後、同じマウスに腹部全層欠損に有茎フラップとして移しました。一週間後の転送、フラップは、実行可能な血管新生し、よく腹部内臓をサポートするために十分な強度をもつ、周囲の組織に統合されました。このように、自己の椎弓根ベアリング設計厚く、血管組織のフラップは、全層腹壁欠損を修復するための新規な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>小さな細いまっすぐなはさみ</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>細い先端のストレート鉗子</td>ファイン<td>サイエンスツール(FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>鋸歯状鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>小型血管焼灼器&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>5686</td><td></td></tr><tr><td>Sedaxylan</td><td>Euravet</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>Clorketam 1000</td><td>Vetoquinol</td><td>4A0726B</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>4-0 silk</td><td>sutures Assut sutures</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>6-0ポリプロピレン縫合糸</td><td>Assut縫合糸</td><td>9351F</td><td></td></tr><tr><td>8-0シルク縫合糸Assut</td>縫<td>合糸</td><td>684568</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器(6mm針)</td><td>BD</td><td>324911</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100高解像度超音波システム</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 非線形トランスデューサ</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマーカー非標的造影剤</td><td>VisualSonics株式会社</td><td>VS-11694</td><td></td></tr><tr><td>尾静脈カテーテル</td><td>VisualSonics inc.</td><td>VS-11912</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100ソフトウェア</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン</td><td>Sigma</td><td>FD500S</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>antigen unmasking solution</td><td>Vector laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギ(二次)抗体</td><td>ベクター研究所</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ</td><td>ジャクソン&nbsp;</td><td>016-030-084</td><td></td></tr><tr><td>メイヤーのハマトキシリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS-16</td><td></td></tr><tr><td>アミノエチルカルバゾール (AEC) 基質キット</td><td>Life technologies, Invitrogen&nbsp;</td><td>00-2007</td><td></td></tr><tr><td>Vectamount</td><td>Vector laboratories</td><td>H-5501</td><td></td></tr></tbody></table>

操作された血管柄マッスルフラップ

Engineered Vascularized Muscle Flap

組織構築物の厚さとその結果としての生存率と生体内での適用性を制限する主な要因の一つは、細胞微小環境への酸素供給の制御です。これは、受動的な拡散が非常に薄い層に限定されているためです。腹壁の全層欠損の完全性を回復するためにさまざまな材料が説明されていますが、グラフト血管新生、組織拒絶反応、感染、または不十分な機械的特性のために、最適であることが証明された材料はまだありません。このプロトコルは、筋肉組織の再建に関連する厚さで、完全に血管新生されたフラップを設計する手段を説明しています。細胞に包埋されたポリL-乳酸/ポリ乳酸-co-グリコール酸コンストラクトは、マウスの大腿動脈と静脈の周囲に移植され、in vivoで1〜2週間維持されます。その後、血管新生された移植片は、腹部に作られた全層欠損に向かってフラップとして移植されます。この技術は、自家組織犠牲の必要性を置き換え、多くの外科的用途でin vitroで設計された血管新生フラップの使用を可能にする可能性があります。

in vivoでの移植片血管新生及び灌流移植片は、従来の軸方向のフラップとしての転送に1〜2週間移植しました。 1と2週間後、移植では、移植領域の総観察は、生存および血管組織移植片を明らかにしました。これらの移植片は、FITCデキストランの尾静脈注射及び超音波測定によって証明されるように、免疫染色陽性のCD31（ 図1A）によって決定されるように、高度に血管新生であることが証明され、そして高度に灌流しました。多くの船はすでに1週間移植後、AV血管の近くに追加の週後に有意に上昇した数で観察されました。機能性血管密度（FVD）（ 図1B）のFITCデキストランベースの決意は、移植片は非常に1週間移植後で、かつ有意な変化は、 生体内で追加の週に行われたことがない血管新生されたことを示しました。血管開通および灌流が実証されました図1Cは、グラフト移植後ホスト大腿血管開通と整合性を確認した超音波イメージングによって（それぞれ1、1〜2</sup...

今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

この手順の全体的な目的は、全層腹壁欠損の再建に利用するための、血管が十分に発達した組織フラップを作製することです。これは、まず生分解性ポリ乳酸・ポリ乳酸-共-グリコール酸スキャフォールドを調製することで達成されます。次に、内皮細胞、筋細胞、および線維芽細胞を播種し、細胞が自己組織化するようにグラフトをin vitroで培養します。次に、作製した組織をマウスの大腿動脈および静脈の周囲に移植し、宿主血管との吻合を行い、高度に血管化させます。最終的に、この組織を有茎皮弁として全層腹壁欠損部へ転移させます。最終的に、移植片の血管化を超音波検査、T dextran注入、およびCD31の免疫染色により証明し、皮弁の剛性をバイオダイナミック試験装置を用いて評価します。既存の手法と比較した本手法の主な利点は、ドナー部位の可動性が低いこと、および全層軟組織の構築に使用可能な作製フラップの高い生存率にあります。本手法は、全層腹壁欠損を有する患者の治療に有用です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室と共同研究を行っている形成外科医のDana Egozi博士により行われ、Anina Freimann氏がそれを補助します。テキストのプロトコルに従ってスキャフォールドを調製し、細胞を埋め込んだ後、以下の手術器具をオートクレーブで滅菌します：小型の精密直剪刀、スプリング鋏、精密直鑷子、セレーション鑷子、ハドソン鑷子、持針器、および15番メス刃。マイクロ遠心チューブにケタミン 425 µLとシロドシン 75 µLの混合液を調製し、シリンジに移します。次に、0.3 mg/mLのブプレノルフィンを滅菌生理食塩水で20倍に希釈します。テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、ステージ上に配置し、正常な体温を維持するために37 °Cに加熱し、粘着テープでマウスをステージに固定します。綿棒を使用し、ヨウ素の後に70% ethanolで切開部位を洗浄し、無菌的な作業領域を確保します。鎮静レベルを確認した後、メスを用いて、膝から鼠径靭帯にかけて大腿血管と平行に皮膚を切開し、大腿動脈および大腿静脈を露出させます。クリップまたは針を用いて皮膚を固定します。次に、スプリングシザーとピンセットを使用し、深大腿血管（profunda）の下方かつ脛骨および腓骨血管への分岐点の上方の大腿動静脈から開始し、周囲の組織から大腿動脈および静脈を慎重に分離します。脚への血流を維持し、その後の虚血を防ぐため、深大腿血管には触れないようにしてください。次に、事前に準備したグラフトを、profundaの下方かつ脛骨および腓骨動静脈への分枝の上方にある、露出した大腿動静脈（AV）の周囲に折り畳み、8-0シルク縫合糸を用いてその末端を接合します。大腿動静脈からのみ発芽する毛細血管によるインプラントの血管新生を確実にするため、

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、二重播種部分的人工多能性幹細胞がマウスにグラフトするための機能的な組織工学血管移植片を生成するためのプロトコルを提示する（PiPSC）は - 脱細胞化血管足場バイオリアクターに由来内皮細胞 - 平滑筋細胞およびPiPSC由来。...

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

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中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

この論文は、ラットの筋膜上皮の遊離皮弁を持ち上げ、それを首に移すために必要な手順を説明しています。...

無料組織転送のモデル：ラット心窩部無料フラップ

頭頸部血管再建の学習モジュールとして豚上腹壁動脈 perforator...

頭頸部血管再建のトレーニング ・ モジュールとしてブタ

本プロトコルは、ブタ筋膜皮膚皮弁モデルおよび血管新生複合組織研究におけるその潜在的な使用について説明しています。...

血管化複合同種移植片バイオエンジニアリング研究のための信頼性の高いブタ筋膜皮膚フラップモデル

操作されたフラップは、組み込まれた機能的な血管網を必要とする。このプロトコルでは、ラット大腿動脈への階層的血管網およびその直接顕微手術吻合を含む3D印刷組織フラップを作製する方法を提示する。...

3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。...

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

このプロトコルは、実験研究を目的とした、深部下腹上動脈脚に基づくヒト穿孔皮弁モデルの外科的収穫技術を説明しています。...

血管化複合同種移植および遊離フラップの保存戦略を調査するための実験的ヒトDIEPフラップモデル

ポリマーバルブの開発に関心がリニューアルしました。ここでは、目的は、三尖形状を収容するために、近同一の条件下で収集されたネイティブおよび人工弁データと比較して、ポリマー弁流体力学的データを提示するためのプロトコルを定義するために商業的なパルスデュプリケータを変更することの実現可能性を実証することである。...

トライリーフレットポリマーバルブの相対的な流体力学的評価のためのプロトコル

私たちは、腓骨神経の刺激とラットの後肢の前腓コンパートメントの収縮に続く足の背屈を測定するためのin...

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

学ぶ、生分解性スカフォールドを用いた血管柄マッスルフラップの作製法。マウス大腿動脈周囲への移植と自己血管柄による腹部壁欠損再建の手法を解説。再生医療における組織血管化の新たなアプローチを示す。

操作された血管柄マッスルフラップ

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