操作された血管柄マッスルフラップ
January 11th, 2016
今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。
この手順の全体的な目標は、全層の腹壁欠損の再建に利用できる、血管新生された組織フラップを作成することです。これは、最初に生分解性ポリ乳酸ポリ乳酸-co-グリコール酸足場を調製することによって達成されます。次に、内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞を播種し、移植片をin vitroで培養して細胞が自己組織化できるようにします。
次に、操作された組織はマウスの大腿動脈と静脈の周りに移植され、そこで宿主血管によるアナスティメーシスを受け、高度に血管新生されます。最後に、組織は椎弓根フラップとして全層腹壁欠損に移されます。最終的に、移植片の血管新生は、超音波、Tデキストラン注射、およびCD31の免疫染色によって証明され、フラップの硬さはバイオダイナミック法試験装置を使用して検査されます。
既存の方法と比較した場合の主な利点は、ドナー部位の移動性が低く、全層軟組織の構築に使用できる人工フラップの高い生存率です。この方法は、腹壁の全層欠損を持つ患者に役立ちます。手順のデモンストレーションは、形成外科医のダナ・エゴジ博士が私の研究室と協力して行い、アニナ・フライマンが彼女を支援します。
テキストプロトコルに従って足場と細胞の埋め込みを準備した後、次の手術ツールをオートクレーブします:小さな細いまっすぐなハサミ、スプリングハサミ、まっすぐな細い先端の鉗子、鋸歯状の鉗子、ハドソン鉗子、ニードルホルダー、および15番のブレードメス。425マイクロリットルのケタミンと75マイクロリットルのシロジンの混合物を微量遠心チューブに調製し、注射器に移します。次に、ブプレノルフィン1ミリリットルあたり0.3ミリグラムを滅菌生理食塩水で1〜20に希釈します。.
テキストプロトコルに従ってマウスに麻酔をかけた後、ステージに置き、摂氏37度に加熱して正常な体温を維持し、絆創膏を使用してステージに固定します。綿チップを使用して、ヨウ素を使用し、続いて70%エタノールを使用して切開部位を洗浄し、無菌作業場を確立します。鎮静レベルを確認した後、メスを使用して、膝から大腿骨血管と平行な鼠径靭帯までの皮膚を切開し、大腿動脈と静脈血管が露出するまで行います。
クリップや針を使って肌を押さえます。次に、スプリングハサミと鉗子を使用して、大腿骨房から深部の下、分岐部から脛骨房と腓骨房まで、大腿動脈と静脈血管を周囲の組織から慎重に分離します。脚への血流を維持し、その後の虚血を防ぐために、深部はそのままにしておきます。
次に、前に準備したグラフトを露出した大腿骨AVの周りに、深部の下と分岐部の上で脛骨と腹部のAVに折り畳み、8-0を使用します。その端を結合するために絹の縫合糸。大腿部AV血管からのみ発芽する毛細血管によるインプラントの血管新生を確実にするために、滅菌したラテックスの一部を移植片の下に置き、6-0シルクを使用して移植片と縫合糸に巻き付けます。次に、4-0シルク縫合糸を使用して、上にある皮膚を閉じます。
ブプレオルフィンを1日2回、2〜3日間皮下注射します。麻酔から回復するまで、その後は移植片がフラップとして移植されるまで毎日、マウスを注意深く観察してください。移植後1〜2週間後、マウスに麻酔をかけた後、動物を加熱されたステージに置き、固定します。
このビデオで前述したように切開部位を洗浄した後、はさみと鉗子を使用して皮膚の縫合糸を慎重に開き、メスで鼠径靭帯に垂直な皮膚を切開し、腹側の皮膚を通って続けます。メスを使用して、腹側腹壁を切開します。ラテックス片を慎重に取り外し、血管新生したフラップを露出させます。
次に、はさみと鉗子を使用して、周囲の組織から組織フラップを解剖します。8-0で絹の縫合糸は、大腿骨AVの遠位端を結紮して、AVからの出血を防ぎます。次に、折りたたまれた移植組織と8-0の遠位にある膝でAVを焼灼します。縫合。移植片に包まれた大腿骨AVを腹側腹壁に向かって静かに移し、動脈の損傷を避けて、全層欠損をどの距離で行うべきかを決定します。
スプリングハサミで腹直筋を切開し、その上にある皮膚で筋肉の約1センチ×0.8センチの部分を取り除きます。8-0 を使用して、血管新生移植片に軸方向フラップとして包まれた大腿骨房を腹側腹壁の全層欠損に移します。ヘルニアを予防するためのシルク縫合糸。フラップを周囲の筋肉組織に縫合します。
次に、4-0シルクで脚の皮膚を縫合します。腹側の皮膚を露出させたままにして、完全な腹壁の欠損の影響を模倣します。ヨウ素化ガーゼと滅菌包帯で、露出領域の汚染を防ぐために皮膚の傷を覆います。
このビデオで前述したように、ブプレノルフィンを投与します。.麻酔から回復するまで動物を注意深く監視し、その後は毎日、テキストプロトコルで概説されている研究のためにフラップが回復するまで観察してください。移植後1週間および2週間で、移植片領域の肉眼的観察により、陽性のCD31免疫染色によって決定された生存可能で高度に血管新生された組織移植片が明らかになりました。
組織移植片も、FITC-デキストラン尾静脈注射と超音波測定で見られるように、高度に灌流されていました。このグラフは、移植後1週間ですでに多くの血管が観察されており、AV血管の近くでさらに1週間後にその数が大幅に増加したことを示しています。ここで見られるように、移植片移植後の大腿骨後の開存性と完全性は、カラードップラーモードでの超音波画像によって確認されました。
青と赤は移植片の血流を表しています。さらに、超音波グラフィック検査では、移植片領域内の灌流が明らかになり、移植後は1週間と比較してわずかに高かった。移載後1週間のフラップの全眼検査では、フラップが周囲にしっかりと付着していることが明らかになりました。
血管新生前の細胞包埋フラップを比較すると、対照の無細胞非血管新生移植片は、剛性や強度などの優れた機械的特性を示し、裂開やヘルニアも少なくなりました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約30分で完了します。その開発後、この技術は、形成外科医が全層腹壁欠損やその他の複雑で重大な軟部組織欠損に苦しむ患者を治療する道を開きます。
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概要
このプロトコルは、自家茎を用いた血管化組織フラップの工学的構築の新しい方法を提示し、腹壁の全層欠損の再建を目指しています。このアプローチは、細胞の集合と血管新生を支えるために生分解性スキャフォールドを使用します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 組織工学
- 再生医療
- 血管生物学
背景
- 従来の再建方法では自家組織フラップが使用されています。
- 工学的組織は複雑な組織欠損の潜在的な代替案を提供します。
- 血管新生は工学的組織の生存性にとって重要です。
- この研究は組織フラップにおける血管新生を促進する方法を探っています。
研究目的
- 腹壁再建のための血管化組織フラップを開発すること。
- 移植片の統合を改善するために自家茎を使用すること。
- 前臨床モデルで工学的組織の有効性を評価すること。
使用された方法
- 生分解性ポリ乳酸スキャフォールドの調製。
- スキャフォールドへの内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞の播種。
- 細胞自己集合を促進するためのインビトロ培養。
- マウスモデルにおける大腿動脈と静脈周囲への工学的組織の移植。
主な結果
- 工学的組織は宿主血管との吻合に成功しました。
- 超音波検査とCD31に対する免疫染色で血管新生が確認されました。
- フラップの剛性は生体力学的テスト機器を使用して評価されました。
- この方法は自家フラップの代替物としての可能性を示しました。
結論
- この研究は従来の組織再建方法に代わる実行可能な代替案を提示しています。
- 記述された工学的アプローチを通じて血管新生を促進することは可能です。
- この技術は再建手術の結果を改善する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Engineering vascularized muscle flaps addresses a critical barrier in tissue construct viability by enabling oxygen and nutrient delivery at clinically relevant thicknesses. This capability supports translational advancement in reconstructive and regenerative medicine, particularly for full-thickness soft tissue defects. The approach enhances predictive confidence for tissue integration and functional restoration in preclinical models, informing portfolio decisions for next-generation biomaterials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascularization mechanisms in engineered tissues for functional validation.
- Supports biological de-risking by demonstrating in vivo integration and perfusion of constructs.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and mechanical properties in preclinical settings.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for evaluating scaffold-cell combinations under physiological vascularization.
- Standardizes quantitative assessment of graft perfusion and mechanical strength using imaging and biodynamic testing.
- Enables screening of biomaterial formulations for optimal integration and reduced rejection risk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered constructs with disease-relevant models for abdominal wall and soft tissue reconstruction.
- Supports continuity from in vitro assembly to in vivo functional validation and integration.
- Informs risk-adjusted advancement of tissue engineering candidates toward clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This engineered vascularized flap method bridges early discovery, preclinical validation, and translational research for reconstructive tissue engineering.
- Discovery Biology: Demonstrates hypothesis testing for vascular integration and tissue viability in vivo.
- Screening: Delivers quantitative outputs on perfusion, vascularization, and mechanical properties for candidate comparison.
- Analytics: Utilizes ultrasound, immunostaining, and biodynamic testing to generate reproducible readouts.
- Translational Research: Provides a preclinical model for evaluating engineered tissue performance in clinically relevant defects.
- Enterprise Reuse: Establishes a workflow adaptable to various tissue types and biomaterial platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue viability and integration for regenerative applications.
- Operational Value: Standardizes vascularization and mechanical testing protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for biomaterial and tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates with demonstrated in vivo performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in scaffold fabrication, cell culture, and microsurgical implantation.
- Demands access to imaging modalities (ultrasound, immunostaining) and mechanical testing instruments.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible construct preparation and analysis.
- Adaptable to different cell types and defect models with protocol optimization.
- Limited by the need for in vivo validation and specialized surgical skills.
