Name: 3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶ 3Dバイオプリンティングによる階層的血管ネットワークを持つ組織フラップの作製法。ラット大腿動脈への直接吻合が可能で、血管のin vivo挙動研究や大規模組織欠損治療への応用が期待されます。

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このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020 Research and Innovation Programme(助成金契約番号818808)に基づき、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けました。rhCollMAはCollPlant(イスラエル、Rehovot)から寛大に提供された。著者らは、動物ケアの支援についてテクニオンの前臨床研究機関、ならびにジャネット・ザビン、ガリア・ベン・デイビッド、アイダン・レデンスキーに感謝する。

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<li>Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering complex tissues.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 12(2012).</li>
<li>Duan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+review+of+3D+bioprinting+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).</li>
<li>Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+three-dimensional+engineered+tissues+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications.</a> Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).</li>
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<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).</li>
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<li>Catros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+bioprinting+for+creating+on-demand+patterns+of+human+osteoprogenitor+cells+and+nano-hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite.</a> Biofabrication. 3 (2), (2011).</li>
<li>Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+designed+poly%28d%2Cl-lactide%29%2Fnanosized+hydroxyapatite+composite+structures+by+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography.</a> Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).</li>
<li>Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+PPF%2FDEF+scaffolds+using+micro-stereolithography+and+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+in+the+granular+gel+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+engineered+tissue+flaps+with+hierarchical+vessel+networks+%28VesselNet%29+for+direct+host-to-implant+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion.</a> Advanced Materials. 33 (42), 2102661(2021).</li>
<li>Schleimer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Training+a+sophisticated+microsurgical+technique%3A+interposition+of+external+jugular+vein+graft+in+the+common+carotid+artery+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).</li>
<li>Sucher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+A+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).</li>
<li>Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cuff+design+to+facilitate+anastomosis+of+small+vessels+during+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats.</a> Comparative Medicine. 64 (4), (2014).</li>
<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li>
<li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scaffold+system+for+studying+the+effect+of+local+geometry+and+topology+on+the+development+and+orientation+of+sprouting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels.</a> Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).</li>
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<li>Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+plotting+of+three-dimensional+hollow+fiber+scaffolds+based+on+concentrated+alginate+pastes+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).</li>
<li>Ying, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+emulsion+bioink-enabled+3D+bioprinting+of+porous+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels.</a> Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).</li>
<li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+angiogenesis+in+tissue+engineering%3A+beyond+creating+static+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li>
<li>Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+3D+cell+printing+for+next-generation+therapeutics+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics.</a> Biomaterials. 156, 88-106 (2018).</li>
<li>Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+support+materials+in+3D+bioprinting+-+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future.</a> International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+type+I+collagen+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human recombinant type I collagen produced in plants.</a> Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).</li>
<li>Stein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bioactive%2C+post-translationally+modified%2C+heterotrimeric%2C+human+recombinant+type-I+collagen+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco.</a> Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+precision+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , 120062(2020).</li>
<li>Karakurt, I., Lin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+technologies%3A+techniques%2C+materials%2C+and+post-processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

血管新生組織のエンジニアリングは、組織工学20の主な課題の1つです。人工血管組織を作成するための現在の方法は、自己組織化微小血管系21,22,23の作成またはメソスケール血管足場24,25の作製に焦点を当てており、移植時に即時かつ直接灌流され得る階層的血管系のシステムを再現することに焦点を合わせていない26.この研究では、2つの3D印刷モダリティを使用して、マイクロスケールとメソスケールの血管系で構成される階層的な血管ネットワークを構築するプロトコルについて説明します。このプロトコルは、3Dバイオプリントされた自己組織化マイクロ血管ネットワークとメソスケールの血管足場を組み合わせて、移植可能な血管化フラップを達成します。さらに、このフラップをラットの大腿動脈に直接吻合するためのプロトコルを提示する。
3Dバイオプリンティングは、従来の組織工学技術に対する汎用性のために、近年関心を集めています。このプロトコールはrhCollMAバイオインクにおける微小血管ネットワークの生成を記載しているが、使用される方法は、研究された新規バイオインクおよび支持浴の茄多から他の多くのバイオインクにほとんど変更を加えずに適用することができる27、28。rhCollMAをバイオインクとして使用することを選んだのは、ヒトECMにI型コラーゲンが豊富に存在するため、細胞付着に適した環境が提供されていたためです。さらに、それは植物中で組換え的に生産され、メタクリレート基でさらに修飾され、光重合および安定な3Dヒドロゲル29,30の形成を可能にする。光架橋は、無毒であることが示されており、405nmの青色光への曝露によって活性化され、UV光の可能性のある光毒性を低減する光開始剤LAPの添加によって達成された。しかしながら、感光性バイオインクの使用は、バイオインクおよび担体材料の調製のためにフェノールレッド非含有培養培地の使用を必要とする。さらに、このプロトコルは、rhCollMAなどのバイオインクの高忠実度押出を可能にするゼラチン担体材料の使用を記載している。したがって、その準備およびプリンタベッドの冷却中に冷媒の使用を確実にすることが重要です。過度の加熱は、架橋に使用される光源または周囲温度の上昇によって発生する可能性があります。
押出ベースのバイオプリンタは、バイオプリントされた微小血管ネットワークを作成するためにここで使用されており、現在、同様の構築物を生成できる多くの市販のバイオプリンタがある。さらに、提案された方法は、異なる形状、サイズ、およびインフィルパターンを研究するために容易に修正および適用され得る。本研究では、直線状のインフィルパターンを選択して相互接続された細孔を作成し、これを比較的迅速に高い忠実度で印刷することができる。
気泡は、押出バイオプリンティング、特にサポート材料の内部に大きな課題をもたらします。したがって、担体材料の移送、バイオインク細胞懸濁液の調製、および印刷カートリッジへのそれらの移送のために正の変位ピペットを使用することによって、これらの気泡の存在および形成を最小限に抑えることが極めて重要である。
本研究では、ヒト脂肪由来内皮細胞や歯髄幹細胞は、患者からの単離が比較的容易であることから、支持細胞として用いた。さらに、この濃度が最も発達した血管網を確立することが示されているため、8 x 106細胞/ mLの総細胞濃度が選択された16。このプロトコルは、異なる細胞タイプおよび供給源、ならびに異なるバイオインクを使用して微小血管系を生成するために使用することができるが、微小血管網の発達のための最良の条件を確立するために細胞濃度の較正を行わなければならない。さらに、組織特異的細胞(すなわち、筋芽細胞または骨芽細胞)をバイオインク内に組み込んで、組織特異的血管化フラップを達成することができる。
多孔性血管足場用のモールドは、市販の押出3Dプリンタ上に水溶性材料を3D印刷して作製した。これにより、ラピッドプロトタイピングプラットフォームに基づく費用対効果の高い技術が得られ、その結果、血管足場の多くの異なる形状およびサイズを迅速に研究およびスクリーニングすることができる31。それにもかかわらず、この方法の制限は、ほとんどの3Dプリンタ32の解像度制限である。しかし、アディティブマニュファクチャリングを取り巻く急速に進化する業界により、これらの制限は時間の経過とともに改善されると予想されます。ほとんどの有機溶媒は細胞に有毒であり、バイオプリンティング手順を血管足場製造プロセスと組み合わせる能力を妨げるため、製造プロセスのための有機溶媒の使用は、プロトコルの別の制限である。
細胞懸濁液を押し出すのとは対照的に吸引を用いて足場の内腔に播種する記載された方法は、播種された細胞の局在化に大きな影響を与える。負圧を使用することで、足場の壁16上の穿孔を通る細胞懸濁液の流出を最小限に抑えながら、足場の内側内腔の内皮化を可能にする。
顕微手術吻合のための記載された「カフ」方法は、容易に修正され、異なる血管足場材料またはサイズ、ならびに広範囲の動物モデルにおける異なる動脈および静脈に適合させることができる。プロトコルへの適応には、異なるポリイミドチューブサイズおよび縫合糸サイズが含まれるであろう。この方法は足場壁の穿孔を必要とせず、欠陥の発生につながる可能性がある。この作業は、多くのアプリケーションに拡張できるプロトコルを提示します。メソスケールおよびマイクロスケールの血管系の作製およびそれらの組み立ておよび移植を含むこのプロトコルの重要な側面は、再建的用途ならびに血管および他の組織工学研究の両方のための工学的フラップの重要な側面を表す。

重篤な組織欠損は、外傷性傷害、先天性欠損、または疾患によって引き起こされ、これらの欠損を治療するための現在のゴールドスタンダードは、組織代替物として自家移植片、血管化組織フラップ、および微小血管フリーフラップを使用することである。しかしながら、これらの選択肢は、ドナー部位組織およびドナー部位罹患率1が限られているという欠点を有する。したがって、これらの欠陥2を矯正するために使用することができる代替組織代替物に対する需要が高まっている。操作された組織構築物の厚さは、細胞への栄養素およびガスの拡散によって制限され、したがって、適切な血管網は、大きく、厚く、適切に栄養を与えられた足場を生成するために不可欠である。
人工インプラント3の血管新生を促進するために、宿主からの血管支持体のin vivoリクルート、足場内の成長因子およびサイトカインの送達、インプラントの血管前化、マイクロパターニング技術4を用いた灌流可能な分岐微細血管床の生成、血管チャネル/ネットワーク形成のための犠牲材料の使用5を含むいくつかのアプローチが適用されている。、ならびに3Dバイオプリントされた構造内のチャネルの作成 5,6.厚い組織の血管化は、マクロスケールおよびミクロ毛細血管スケールの血管からなる階層的血管網の組み込みを必要とする。マクロスケールの血管は、構築物全体に効果的に血液を分配し、宿主血管との微小外科的吻合を可能にし、一方、微小毛細血管鱗の血管は栄養素の拡散を可能にする。
バイオプリンティングは、従来の組織工学的方法よりも利点があるため、近年大きな注目を集めています。組織と臓器は、特定のアーキテクチャを持つ複雑で複雑な3Dオブジェクトです。3Dバイオプリンティングは、生体材料の層を高解像度で堆積させる能力を備えており、複雑な組織や臓器の代替品(腎臓、肺、肝臓など)を作成する能力を可能にします7。押出ベース、インクジェット8、レーザー支援蒸着9,10、および光造形ベースの11,12バイオプリンティングを含む、いくつかの印刷技術がバイオプリンティングに適応されている。押出ベースの技術は、ノズルとは反対側の材料バルク表面に圧力を加えることによって、ノズルを通して材料を押し出すことに依存している。
懸濁ヒドロゲルの自由体可逆的包埋(FRESH)は、押し出された材料が支持浴によって所定の位置に堆積および固定される粒状支持材料を使用するバイオプリンティング技術13、14 である。支持浴は、押し出された、予め架橋されたバイオインクを、その架橋まで機械的に支持する。この技術の主な利点は、支持浴が、押出後および架橋前15の形状を維持できない低粘度材料を押し出すことを可能にすることである。これにより、バイオインクとして使用できる利用可能な材料のプールが拡大します。
この論文は、マイクロスケールとメソスケールの血管系を組み合わせた血管化フラップの生成のためのプロトコルを提示する。これを達成するために、組換えヒトコラーゲンメタクリレート(rhCollMA)ヒドロゲル中で、バイオプリントされた、自己集合性の微小血管ネットワークが生成され、次いで、これは、より大きな、移植可能な、血管足場の内部に接続され、完全に操作された組織フラップ16をもたらす。操作された組織の迅速かつ直接的な灌流を確立するには、宿主血管への直接顕微手術吻合が必要である。血管足場は、従来の顕微手術血管壁縫合を用いて吻合されるのに十分な縫合糸保持強度を有していない。したがって、我々は、ラットの共通大腿動脈で吻合を達成するための「カフ」17、18、19方法を記述する。この方法では、血管端部は、血管壁を穿孔することなく、円周縫合糸で固定される。
提案されたプロトコルは、rhCollMA環境における階層血管系を研究するために準備されているが、このアプローチは拡張され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。このプロトコルは、異なるバイオインク中の様々な組織特異的細胞のバイオプリンティングに適用することができる。さらに、構築物の幾何学的およびサイズは、大規模組織再構成または生物学的研究などの特定の要件に合うように容易に変更することができる。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジオキサン</td><td>バイオソルブケミカル</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5 "鈍い先端ディスペンシングニードル</td><td>CML供給</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc琥珀色のシリンジバレル&ピストンセット</td><td>ノードソンEFD</td><td>7012085</td><td>光を遮断し、早期架橋を防止するために使用される琥珀色のシリンジ</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA吸収性縫合糸</td><td>Assut縫合糸</td><td></td><td>皮膚創傷閉鎖に使用される吸収性縫合糸</td></tr><tr><td>6-0 ポリプロペレン縫合</td>糸 <td>Assut 縫合糸</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Acland クランプ</td><td>S&T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>アドベンティシアハサミ</td><td>S&T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>角度付き No.3 宝石商用鉗子</td><td>S&T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>6軸 3Dバイオプリンター</td></tr><tr><td>ウシアルブミン血清 プロブミン</td><td>ミリポア</td><td>&nbsp;82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>BVOHフィラメント</td><td>逐語</td>的<td>55903</td><td>水溶性1.75 mm直径フィラメント</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>S&を適用するクランプT</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>歯髄幹細胞</td><td>ロンザ</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>ディートリッヒ ブルドッグ クランプ</td><td>ファイン サイエンス ツール (FST)</td> <td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>カルロ エルバ</td><td>480141</td><td></td>解</tr><tr><td>剖はさみ</td><td>S&T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 高グルコース, フェノール無 レッド</td><td>ザルトリウス</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM media + bullet kit</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>グルタミン代替品</td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウスCy3</td>抗体 <td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium&nbsp; 5,000 I.U./mL</td><td>Panpharma-Human</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>adipose microvascular cells</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>A stock concentration of 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>FRESH 3Dバイオプリンティング用ゼラチンサポートスラリー</td></tr><tr><td>リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸(LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>低グルコースDMEM</td><td>生物産業</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1,000 & micro;L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SMA antibody</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 4% in PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp;SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ナイスタチン溶液</td><td>生物産業</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレンオキシド), M.W. 250,000 to 400,000</td><td>Acros Organics</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-乳酸), IV 5.0 dl/g (PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>ポリイミドチューブ、ID:0.0249インチ、OD:0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>マイクロサージェクシャル吻合用カフの製造に使用される薄肉チューブ</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 3Dプリンター</td><td>Prusa Research</td><td></td> <td>http://www.prusa3d.com/ 人気のある商用3D</td></tr><tr><td>プリンターResomer&nbsp;RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>寛大にCollPlant社(イスラエル、レホボト)の</td></tr><tr><td>丸型ハンドルニードル</td><td>ホルダーS&T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>メスのハンドル - #3</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>小さな細かいストレートはさみ</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>バイオソルブ化学</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム(NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>ダッソー・システムズ</td><td></td><td>CADソフト</td></tr><tr><td>Straight No.3 宝石商用鉗子</td><td>S&T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>ストレート鋸歯状鉗子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>外科用メスブレード No.15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab Ltd</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>BioAssembly Bot</td></tr><tr><td>Vessel dilator</td><td>S&T</td><td>D-5A.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 手術用顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

移植可能で機能的で厚い組織を設計するには、階層的な血管ネットワークを設計する必要があります。3Dバイオプリンティングは、バイオインクと呼ばれる印刷可能な生体材料と細胞を秩序正しく自動的に層ごとに追加することによって組織を作成するために使用される技術であり、従来の組織工学技術では達成できない非常に複雑な構造を作成することができます。したがって、3Dバイオプリンティングは、ミリ波血管から微小血管ネットワークまで、天然の血管系複合体構造を模倣するための魅力的な in vitro アプローチです。 
粒状ヒドロゲルにおける3Dバイオプリンティングの進歩により、低粘度の細胞外マトリックスベースのバイオインクの高解像度押出が可能になりました。この研究は、工学的血管新生組織フラップを製造するための3Dバイオプリンティングと犠牲型ベースの3Dプリンティングアプローチを組み合わせたものを提示する。ゼラチン支持浴内の組換えコラーゲン - メタクリレートバイオインクを用いた内皮および支持細胞の3Dバイオプリンティングは、自己組織化毛細管ネットワークの作製に利用される。この印刷された微小血管系は、メソスケールの容器状の多孔質足場の周りに組み立てられ、犠牲的な3D印刷された型を用いて作製され、内皮細胞を播種される。 
このアセンブリは、メソスケール血管の内皮を周囲の毛細血管網と共に吻合するように誘導し、操作された組織フラップ内に階層的な血管網を確立する。操作されたフラップは、その後、袖口技術を用いてラット大腿動脈に外科的吻合によって直接移植される。記載された方法は、再建手術および血管新生研究において使用するための様々な血管新生組織フラップの作製のために拡張することができる。

このプロトコルは、血管足場(図1Ai)とバイオプリントされた微小血管系(図1Aii)からなる工学的フラップの製造を記述しており、これらはメソスケールおよびマイクロスケールの血管系を達成するために組み立てられた(図1Aiii)。プロトコールに従って、血管足場のBVOH型を設計し、3Dプリントした(図1B、C)。得られた印刷構造を目視で検査し、金型の空の空間に見られる可能性のあるBVOHの小さなストランドについて調べました(図1D)。これらのストランドは、通常、誤った材料設定またはBVOHが水分を吸収したことを示します。これらのストランドは、鋳型の不完全な充填および結果として生じる血管足場の構造的欠陥につながる可能性があるため、除去されるべきである。次に、金型にPLLA:PLGA溶液を充填し、続いてプロトコルに記載されているように凍結乾燥プロセスと洗浄ステップを行った。得られたPLLA:PLGA血管足場を目視検査し、血管壁の完全性および内腔開存性を検証した(図1E)。
10mg/mLの濃度で中和されたrhCollMAバイオインクを調製し、PEO:LAP溶液と1:1の比率で組み合わせた。Zs-Green1で標識したヒト脂肪微小血管内皮細胞および歯髄幹細胞をrhCollMAバイオインクで再懸濁し、溶液を印刷カートリッジおよびプリンタにロードした。直進パターンを有する中央チャネルを有する箱形状(図1D)を、ゼラチン支持浴の内部でバイオプリントした。印刷後、構築物を架橋し、支持浴を溶解して洗浄した。培養の4日後、構築物をライブ画像化し、微小血管網自己組織化について確認した。 図1D は、バイオプリント構築物における高度に発達したHAMEC−ZsGreen1微小血管ネットワークの例を示す。
次に、フィブロネクチン被覆血管足場を、印刷された構築物の中央チャネルに挿入した(図2A)。組み立てられた構築物を2日間培養し、その間に細胞はゲルを収縮させ、血管足場にしっかりと付着させた。次いで、血管足場を、プロトコールに従って、tdTomatoを発現するHAMECsで裏打ちした。培養の7日後、構築物を固定し、画像化した。図 2B は、バイオプリントされた微小血管系における内皮細胞が緑色で描かれ、一方、血管足場の内皮内皮ライニングが赤色で描かれている組み立てられた構築物の側面図を示す。画像は、バイオプリントゲル中の緑色の微小血管自己集合体を示し、血管足場は赤色の内皮細胞で裏打ちされている。より高い倍率では、赤色の内皮内層に由来する芽が、バイオプリントされた微小血管網と共に発芽および吻合が見られる(図2C)。次に、構築物を、歯髄幹細胞のマーカーとしてα平滑筋アクチン(SMA)について染色した。免疫染色に続いて、構築物をレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像化した(図2D)。
最後に、培養の7日後、操作されたフラップを、プロトコルに記載されているように、ラットの大腿動脈に微小外科的に吻合した。代表的な手順のビデオは、 補足ビデオS1で見ることができます。 図2E は、クランプ除去前の完了した吻合部位の代表画像を示し、 図2F は、クランプ除去および止血後の吻合部位の代表画像を示す。創傷閉鎖前に目に見える出血があってはならない。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> 図1:作製されたメソスケールおよびマイクロスケール容器の代表的な画像。 (A) プロトコルのステップの概略概要。許可を得て転載16.(b)血管足場材の犠牲型に対するCAD設計。(C)代表的な3Dプリントされた犠牲金型の側面図(スケールバー=0.5mm)。(D)犠牲型の上面図(スケールバー=0.5mm)(E)記載プロトコールを用いて作製された代表的な血管足場(スケールバー=5mm)。(F)3DバイオプリントされたrhCollMA微小血管ネットワークのためのCAD設計。(G)緑色でHAMEC−ZsGreen1を示す高度に発達したバイオプリント血管網の代表画像。スケールバー = 200 μm。略語: CAD = コンピュータ支援設計;rhCollMA = 組換えヒトコラーゲンメタクリレート;HAMEC = ヒト脂肪微小血管内皮細胞;PLLA = ポリ-L-乳酸;PLGA = ポリ乳酸 - コグリコール酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg"> 図2:組み立てられた血管化フラップの代表的な画像 (A)バイオプリントされた微小血管系および血管足場の代表的な集合体の写真。(B)血管足場の内皮内皮ライニングの4日後に画像化された代表的な操作されたフラップの側面図。バイオプリントされた微小血管系は緑色(HAMEC-ZsGreen1)で示され、内皮内層は赤色(HAMEC-tdTomato)で示されている。(C)緑色でバイオプリントされた血管系と赤色の内皮内層との間の吻合の代表的な画像。(D)インキュベーションの7日後の平滑筋アクチン(赤)、核(青)、および内皮細胞(緑)についての免疫染色の代表的な画像。(E)クランプ除去前のラットの大腿動脈を有する操作されたフラップの完了した吻合の代表的な画像、および(F)クランプ除去後の。略語:HAMEC = ヒト脂肪微小血管内皮細胞;SMA = 平滑筋アクチン;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオS1:ラットの大腿動脈に血管足場を吻合するための代表的な顕微手術手順。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

操作されたフラップは、組み込まれた機能的な血管網を必要とする。このプロトコルでは、ラット大腿動脈への階層的血管網およびその直接顕微手術吻合を含む3D印刷組織フラップを作製する方法を提示する。

3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

私たちのプロトコルにより、研究者は完全に設計された埋め込み型フラップ内に階層的な血管ネットワークを生成することができ、インビボでの統合下での血管挙動に関する新しい研究への道が開かれました。この技術は、2つの3D印刷技術の汎用性を組み合わせて、マイクロサージャリーを使用して宿主血管と直接吻合することができるマイクロおよびメソスケール上の血管を作成および組み立てる。完全に設計された血管新生フラップは、大きな組織欠損を治療し、組織の発展と統合を研究するためのプラットフォームを提供するために使用できます。提案された方法は、組織特異的細胞の取り込みを研究し、ならびに異なるバイオインクおよびサポート材料の使用を評価するために拡張することができる。まず、BVOHモールドに30マイクロリットルのポリマー溶液を充填します。金型を100倍gで2分間遠心分離し、さらに20マイクロリットルのポリマー溶液で金型を補充して、完全な充填を確実にします。充填された金型をマイナス80°Cで少なくとも30分間凍結し、すべてのポリマー溶液が凍結することを確認します。金型から溶媒を一晩凍結乾燥することによって除去する。犠牲型材料を除去するために、凍結乾燥処理後の型を穏やかに攪拌しながら5リットルの脱イオン水浴に移す。お風呂の水が曇ったら交換してください。すべてのBVOHが溶解したら、足場を風乾し、使用時まで真空チャンバーに保管してください。調製し、圧縮した担体材料の約4ミリリットルを、正の変位ピペットを用いて12ウェルプレートの各ウェルに移す。硬い表面のウェルプレートをタップして、サポート材料がウェル内に均等に広がるように強制します。10ミリリットルの内皮細胞培地に200万個のHAMEC−ZsGreenおよび600万個の歯髄幹細胞を含む懸濁液を調製する。細胞懸濁液を200倍gで4分間遠心分離して細胞ペレットを得、次いで上清培地を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルのrhCollMAバイオインクに再懸濁して、バイオインク1ミリリットル当たり総細胞濃度800万細胞のバイオインクを得た。内径 0.22 mm の針を 3 ミリリットルのオレンジ色の印刷カートリッジに合わせ、カートリッジを 50 ミリリットルの円錐形のチューブに入れます。気泡を低減するために、正の変位ピペットを使用して上から充填することによって、細胞 - バイオインク混合物の1ミリリットルを印刷カートリッジに移す。印刷カートリッジをバイオプリンターの適切なツールに取り付けます。中央に直径 2 ミリメートルの円形のチャンネルを含む 4 mm 四角の 2D パターンをスケッチします。スケッチを 4 mm 押し出して、中央のチャンネルがある 4 mm の立方体を取得します。このオブジェクトを STL ファイルとしてエクスポートします。12ウェルプレートSTLテンプレートをバイオプリンタースライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートし、仮想プリントベッドの指定された領域に配置します。立方体形状のSTLファイルをバイオプリンタスライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートします。[外部スライサーを使用する] チェックボックスをオンにしてから、[オブジェクト] プロパティ セクションの下にある [スライサーの構成] をクリックします。ポップアップウィンドウで、塗りつぶしパターンの直線パターンを選択し、塗りつぶし密度に「30%」と入力して、[承諾] をクリックします。立方体をクリックし、マウスを使用して移動し、立方体形状のコピーを目的の各仮想井戸に配置します。バイオプリンタースライスソフトウェアの材料タブにある材料の追加ボタンをクリックして、rhCollMAバイオインクの新しい材料設定を作成します。印刷する材料設定を選択します。圧力の場合は 2 psi と入力し、速度の場合は対応するボックスに 20 mm/秒と入力します。線幅と線の高さの値を 0.24 ミリメートルに割り当て、加速度の値を 400 ミリメートル/平方秒に割り当てます。ソリッドモデリングタブで、立方体オブジェクトをクリックし、材料セクションからrhCollMA材料をクリックして立方体形状に割り当てます。バイオアセンブリタブで、[印刷ジョブの送信]ボタンをクリックして、印刷ジョブをバイオプリンタに送信します。セルラーバイオインクを装填した印刷カートリッジを、3D押出ベースのバイオプリンタの3ミリリットルの周囲空気圧ディスペンスツールにロードします。バイオプリンターのインターフェース画面の[加熱または冷却の制御]タブの下にある[冷却]ボタンをクリックして、プリントベッドの温度を摂氏4度に設定します。サポートバスの入ったプレートをプリンタベッドに積み込みます。バイオプリンターインターフェース画面の「印刷」タブで、印刷ジョブをクリックし、「開始」をクリックし、続いて「GO」をクリックして印刷ジョブを開始します。印刷後、ウェルプレートを405ナノメートルの光源に30秒間1平方センチメートルあたり3ミリワットの強度で露光し、rhCollMAバイオインクの架橋を開始します。架橋後、ウェルプレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で、すべての支持浴が溶けるまで少なくとも20分間インキュベートする。液化した支持浴を穏やかに吸引し、内皮細胞培地と交換する。構築物を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。バイオプリントされた微小血管網の担体材料除去の直後に、バイオプリント構造の隣にフィブロネクチンコーティングされたPLLA:PLGA血管足場を置く。血管足場をバイオプリント構造のメインチャネルに挿入する。組み立てた構築物を摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間インキュベートする。tdTomato発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞の細胞懸濁液を1ミリリットル当たり1000万細胞の濃度で調製した。この細胞懸濁液の20マイクロリットルの液滴を疎水性表面上に置く。一端の足場の内腔が細胞液滴と接触するように、血管足場を液滴の上に静かに置く。足場の反対側の端から液滴を吸引し、その内腔を細胞懸濁液で満たす。座った足場を微小遠心チューブに入れ、加湿インキュベーター内の回転子に60分間入れます。最後に、足場を12ウェルプレートに移し、2ミリリットルの内皮細胞培地を加える。血管足場の内皮内皮ライニングの4日後に画像化された代表的な操作されたフラップの側面図がここに示されている。バイオプリントされた微小血管系は緑色で示され、内皮内層は赤色で示されている。代表的な画像は、バイオプリントされた血管系と内皮内層との間の吻合を示す。インキュベーションの7日後の平滑筋アクチン、核、および内皮細胞についての免疫染色がここに示されている。代表的な画像は、クランプ除去前およびクランプ除去後にラットの大腿動脈を有する操作されたフラップの完了した吻合を示す。この技術は、インビボでの3Dプリント血管系の成熟と統合を研究し、後肢のインプラントの灌流を監視して、組織欠損を治療するための使用の可能性と安全性を確立するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

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