3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製
2022年5月19日
操作されたフラップは、組み込まれた機能的な血管網を必要とする。このプロトコルでは、ラット大腿動脈への階層的血管網およびその直接顕微手術吻合を含む3D印刷組織フラップを作製する方法を提示する。
私たちのプロトコルにより、研究者は完全に設計された埋め込み型フラップ内に階層的な血管ネットワークを生成することができ、インビボでの統合下での血管挙動に関する新しい研究への道が開かれました。この技術は、2つの3D印刷技術の汎用性を組み合わせて、マイクロサージャリーを使用して宿主血管と直接吻合することができるマイクロおよびメソスケール上の血管を作成および組み立てる。完全に設計された血管新生フラップは、大きな組織欠損を治療し、組織の発展と統合を研究するためのプラットフォームを提供するために使用できます。
提案された方法は、組織特異的細胞の取り込みを研究し、ならびに異なるバイオインクおよびサポート材料の使用を評価するために拡張することができる。まず、BVOHモールドに30マイクロリットルのポリマー溶液を充填します。金型を100倍gで2分間遠心分離し、さらに20マイクロリットルのポリマー溶液で金型を補充して、完全な充填を確実にします。
充填された金型をマイナス80°Cで少なくとも30分間凍結し、すべてのポリマー溶液が凍結することを確認します。金型から溶媒を一晩凍結乾燥することによって除去する。犠牲型材料を除去するために、凍結乾燥処理後の型を穏やかに攪拌しながら5リットルの脱イオン水浴に移す。
お風呂の水が曇ったら交換してください。すべてのBVOHが溶解したら、足場を風乾し、使用時まで真空チャンバーに保管してください。調製し、圧縮した担体材料の約4ミリリットルを、正の変位ピペットを用いて12ウェルプレートの各ウェルに移す。
硬い表面のウェルプレートをタップして、サポート材料がウェル内に均等に広がるように強制します。10ミリリットルの内皮細胞培地に200万個のHAMEC−ZsGreenおよび600万個の歯髄幹細胞を含む懸濁液を調製する。細胞懸濁液を200倍gで4分間遠心分離して細胞ペレットを得、次いで上清培地を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルのrhCollMAバイオインクに再懸濁して、バイオインク1ミリリットル当たり総細胞濃度800万細胞のバイオインクを得た。
内径 0.22 mm の針を 3 ミリリットルのオレンジ色の印刷カートリッジに合わせ、カートリッジを 50 ミリリットルの円錐形のチューブに入れます。気泡を低減するために、正の変位ピペットを使用して上から充填することによって、細胞 - バイオインク混合物の1ミリリットルを印刷カートリッジに移す。印刷カートリッジをバイオプリンターの適切なツールに取り付けます。
中央に直径 2 ミリメートルの円形のチャンネルを含む 4 mm 四角の 2D パターンをスケッチします。スケッチを 4 mm 押し出して、中央のチャンネルがある 4 mm の立方体を取得します。このオブジェクトを STL ファイルとしてエクスポートします。
12ウェルプレートSTLテンプレートをバイオプリンタースライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートし、仮想プリントベッドの指定された領域に配置します。立方体形状のSTLファイルをバイオプリンタスライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートします。[外部スライサーを使用する] チェックボックスをオンにしてから、[オブジェクト] プロパティ セクションの下にある [スライサーの構成] をクリックします。
ポップアップウィンドウで、塗りつぶしパターンの直線パターンを選択し、塗りつぶし密度に「30%」と入力して、[承諾] をクリックします。立方体をクリックし、マウスを使用して移動し、立方体形状のコピーを目的の各仮想井戸に配置します。バイオプリンタースライスソフトウェアの材料タブにある材料の追加ボタンをクリックして、rhCollMAバイオインクの新しい材料設定を作成します。
印刷する材料設定を選択します。圧力の場合は 2 psi と入力し、速度の場合は対応するボックスに 20 mm/秒と入力します。線幅と線の高さの値を 0.24 ミリメートルに割り当て、加速度の値を 400 ミリメートル/平方秒に割り当てます。
ソリッドモデリングタブで、立方体オブジェクトをクリックし、材料セクションからrhCollMA材料をクリックして立方体形状に割り当てます。バイオアセンブリタブで、[印刷ジョブの送信]ボタンをクリックして、印刷ジョブをバイオプリンタに送信します。セルラーバイオインクを装填した印刷カートリッジを、3D押出ベースのバイオプリンタの3ミリリットルの周囲空気圧ディスペンスツールにロードします。
バイオプリンターのインターフェース画面の[加熱または冷却の制御]タブの下にある[冷却]ボタンをクリックして、プリントベッドの温度を摂氏4度に設定します。サポートバスの入ったプレートをプリンタベッドに積み込みます。バイオプリンターインターフェース画面の「印刷」タブで、印刷ジョブをクリックし、「開始」をクリックし、続いて「GO」をクリックして印刷ジョブを開始します。
印刷後、ウェルプレートを405ナノメートルの光源に30秒間1平方センチメートルあたり3ミリワットの強度で露光し、rhCollMAバイオインクの架橋を開始します。架橋後、ウェルプレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で、すべての支持浴が溶けるまで少なくとも20分間インキュベートする。液化した支持浴を穏やかに吸引し、内皮細胞培地と交換する。
構築物を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。バイオプリントされた微小血管網の担体材料除去の直後に、バイオプリント構造の隣にフィブロネクチンコーティングされたPLLA:PLGA血管足場を置く。血管足場をバイオプリント構造のメインチャネルに挿入する。
組み立てた構築物を摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間インキュベートする。tdTomato発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞の細胞懸濁液を1ミリリットル当たり1000万細胞の濃度で調製した。この細胞懸濁液の20マイクロリットルの液滴を疎水性表面上に置く。
一端の足場の内腔が細胞液滴と接触するように、血管足場を液滴の上に静かに置く。足場の反対側の端から液滴を吸引し、その内腔を細胞懸濁液で満たす。座った足場を微小遠心チューブに入れ、加湿インキュベーター内の回転子に60分間入れます。
最後に、足場を12ウェルプレートに移し、2ミリリットルの内皮細胞培地を加える。血管足場の内皮内皮ライニングの4日後に画像化された代表的な操作されたフラップの側面図がここに示されている。バイオプリントされた微小血管系は緑色で示され、内皮内層は赤色で示されている。
代表的な画像は、バイオプリントされた血管系と内皮内層との間の吻合を示す。インキュベーションの7日後の平滑筋アクチン、核、および内皮細胞についての免疫染色がここに示されている。代表的な画像は、クランプ除去前およびクランプ除去後にラットの大腿動脈を有する操作されたフラップの完了した吻合を示す。
この技術は、インビボでの3Dプリント血管系の成熟と統合を研究し、後肢のインプラントの灌流を監視して、組織欠損を治療するための使用の可能性と安全性を確立するために使用することができる。
概要
このプロトコルは、ラットの大腿動脈への直接的な微小外科的吻合を可能にする、階層的な血管ネットワークを持つ3Dプリントされた組織フラップを作成する方法を概説しています。このアプローチは、生体内での統合中の血管挙動の研究を促進するための先進的な3Dプリンティング技術を組み合わせています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 血管生物学
- 3Dバイオプリンティング
背景
- エンジニアリングされたフラップは、成功した統合のために機能的な血管ネットワークを必要とします。
- 現在の方法は、血管化された組織構造を作成するための効率的な技術が不足しています。
- この研究は、革新的な3Dプリンティング方法を通じてこれらの制限に対処することを目指しています。
- 血管の挙動を理解することは、効果的な組織工学戦略を開発するために重要です。
研究の目的
- 階層的な血管ネットワークを持つ3Dプリントされた組織フラップを製造すること。
- 宿主の血管との直接的な吻合を可能にすること。
- 組織の発達と統合を研究するためのプラットフォームを提供すること。
使用された方法
- マイクロおよびメソスケールの3Dプリンティング技術の組み合わせ。
- バイオプリンティングのためのポリマー溶液と細胞懸濁液の調製。
- 凍結乾燥と溶媒除去を使用してスキャフォールドを作成すること。
- エンジニアリングされたフラップを宿主の血管に吻合するための微小外科的技術。
主要な結果
- 階層的なネットワークを持つ血管化された組織フラップの成功した製造。
- ラットの大腿動脈への直接的な吻合の実現可能性の証明。
- 生体内での統合中の血管の挙動に関する洞察の提供。
- 組織特異的な細胞の組み込みに関する将来の研究のための基礎の確立。
結論
- 開発された方法は、大きな組織欠損の治療の可能性を高めます。
- これは血管化された組織構造に関するさらなる研究の道を開きます。
- このアプローチは、様々なバイオインクとサポート材料の評価に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Engineering hierarchical vascular networks using 3D bioprinting addresses a critical bottleneck in creating functional, implantable tissues for regenerative medicine and reconstructive applications. This approach enables the fabrication of complex, perfusable tissue constructs that can be directly integrated with host vasculature, supporting translational research and preclinical model development. The method enhances predictive confidence in tissue integration and vascularization, informing risk-adjusted portfolio decisions in advanced tissue engineering pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascular integration and tissue perfusion in engineered constructs.
- Supports biological de-risking by modeling vessel anastomosis and network maturation.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and integration potential.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible vascularized tissue platforms for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of endothelial and support cell behavior in 3D environments.
- Supports scalability and platform reuse for diverse bioink and cell type screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered tissue models with disease-relevant vascularization and integration endpoints.
- Enables continuity from in vitro tissue development to in vivo implantation and perfusion studies.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue constructs for reconstructive and regenerative applications.
Pipeline & Workflow Integration
This combined 3D bioprinting and sacrificial mold approach integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling iterative optimization of vascularized tissue constructs for downstream translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vessel formation, anastomosis, and tissue integration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs on vascular network assembly and cell viability.
- Analytics: Provides imaging and immunostaining readouts for network connectivity and maturation.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue engineering with in vivo perfusion and integration models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various tissue types and vascularization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue integration and vascular function.
- Operational Value: Standardizes fabrication and assessment of vascularized constructs for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for tissue engineering programs targeting clinical translation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue constructs for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, cell culture, and microsurgical techniques.
- Demands access to extrusion-based bioprinters, imaging, and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of bioink formulations and scaffold fabrication.
- Adaptable to different cell types and support materials for diverse tissue models.
- Limited by the need for precise control of vascular network architecture and integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Vascular Scaffold Fabrication
1:54
Granular Support Bath Preparation and Incorporation of Endothelial Cells and Support Cells with the Bioink
3:09
Bioprinting Microvascular Networks Using rhCollMA Bioink
6:00
Assembling the Bioprinted Microvascular Network with the Vascular Scaffold to Obtain the Engineered Vascularized Flap
7:12
Results: Representative Images of the Assembled Vascularized Flap
7:59
Conclusion
