マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

この手順の全体的な目的は、マイクロ流体フォトニックデバイスを用いて、少量の粒子の自動分離を行うことです。この手法は、バイオ検出や臨床研究アプリケーションに向けたサンプルの堅牢な処理および分離など、生物医学工学分野における主要な手順を可能にします。この技術の主な利点は、モジュール性、精度、堅牢性、および自動化にあり、網状赤血球（reticulocyte）の分離だけでなく、多種多様なフロースルー型マイクロ流体分離デバイスにも適応可能で柔軟な運用が可能です。

私たちはまず、分析物の大幅な希釈や損失を伴わずに、サブミリリットル単位の生物学的サンプル量でルーチンかつ信頼性の高い分離を行う能力が必要であることを認識しました。サンプルの計量およびソースから回収までの自動ルーティングを、標準的なシリンジポンプ操作と統合することが、このスケールで正常に動作させるために不可欠です。設計を開始するには、付随するテキストプロトコルのセクション1に記載されている通り、音響レティクデバイスおよび2枚のフォトマスクのレイアウトを作成してください。

次に、両面研磨済みの1 0 0シリコンウェハ上に背面流体ポートをパターニングします。標準的なポジレジストを用いたフォトリソグラフィーを行い、深反応性イオンエッチングを用いてこの形状を350から400 µmの深さまでエッチングします。続いて、ウェハを裏返し、表面の流体チャネル形状をパターニングします。

再び標準的なポジレジストを用いたフォトリソグラフィーを行い、パターン形成したウェハーを2枚目のブランクシリコンキャリアウェハーに実装します。次に、フォトレジストを用いて、露出したチャネルを200 µmの深さまでエッチングします。深反応性イオンエッチングを行い、その後、デバイスウェハーをレジスト剥離液に浸し、ブランクシリコンウェハーから分離させます。

次に、ピラニア溶液を用いてデバイスウェハーと特徴のない厚さ0.5 millimeterのホウケイ酸ガラスウェハーを洗浄します。洗浄後、ここに示す条件でガラスウェハーとシリコンウェハーをイオン結合させ、流路を封止します。最後に、2液混合型の低粘度エポキシキットを用いて、ダイシングソーのダイヤモンドブレードで個々のチップを切り出します。

両方のコンポーネントを推奨比率で秤量し、十分に混合します。次に、ジルコンチタン酸鉛（PZT）またはPCT圧電セラミックスを適切な治具にセットし、ピペットを用いてエポキシ混合液を約10 µL、表面全体に均一に広げ、薄い均一な層を作成します。続いて、チップを治具に配置し、圧電セラミックスのエポキシ側をマイクロ流体チップと合わせます。

アライメントを行う間、チップを固定するためにテープで仮止めする必要がある場合があります。アセンブリを万力で固定しますが、その際、構成部品を破損させないように注意し、エポキシ樹脂メーカーが推奨する温度と時間で硬化させてください。エポキシ樹脂が硬化した後、極細のハンダごてを使用して、ピエゾセラミックスの両側に細いゲージのリード線を接続します。

必要に応じて、適切なフラックスを使用してピエゾ表面を準備します。熱による脱分極を防ぐため、ピエゾへの接触時間は可能な限り短くするように注意してください。クランピング固定具を用いて、チップをフルイディックブレッドボードに取り付けます。

また、音響実験中の温度を調節するため、ブレッドボードに冷却ファンを取り付けます。次に、チップをワールドコネクタにネジで固定します。ブレッドボードを顕微鏡ステージに設置し、ワールド・チップ間コネクタを入口および出口にある追加のチューブに接続します。

標準的な1/4-28ネジ付きユニオンを使用します。1/16インチのチューブを用いて、ここに示し、また付属のテキストプロトコルの図4で説明している通りに、マイクロ流体チップをシリンジポンプ、コンピュータ制御のマルチポート選択バルブ、PCインターフェース付き流量計、およびチューブに接続します。分離を開始する前に、洗浄試薬リザーバーを満たし、対応する流路をプライミングしてください。

また、チップ出口にあるバルブ3と4を、最初は廃棄リザーバーへ流れるように設定します。次に、冷却ファンをオンにします。ピエゾセラミックリードをパワーアンプに接続し、使用するアコースティックチップの共振周波数にファンクションジェネレータを設定します。

所望の分離に適した12〜25 V peak-to-peakのRFアンプ出力となるように、ファンクションジェネレーターの電圧設定値を調整します。次に、適切な回収用バイアルとバッファー入力バイアルをシステムに接続します。分離させる細胞または粒子に適したサンプルバッファー、あるいは分離後に使用する分析アッセイで要求されるバッファーを使用してください。

次に、制御ソフトウェアをロードし、それを用いてバルブ、フローセンサー、およびポンプを制御し、完全自動のプライミングおよび分離ルーチンを実行します。分離手順を開始する直前に、サンプルバイアルを短時間ボルテックスし、沈殿した可能性のある粒子を再懸濁させます。あるいは、ボルテックスによる損傷や凝集が起きやすい生物学的サンプルの場合は、ピペットで10回吸い上げ・吐出を繰り返して混合してください。

次に、サンプルバイアルを入力ラインに取り付け、遅滞なくプライミングおよび分離ルーチンを開始します。まず、ソフトウェアを使用してバルブ1およびバルブ2の空気入口をプライミングし、チューブ内に液体が含まれていないことを確認します。同時に、バッファー入力バイアルからバルブ2へ、およびサンプル入力バイアルからバルブ1へ接続されているチューブをプライミングします。

シリンジポンプを用いて、両方のバイアルから約15 µLを吸引してチューブ内を完全に満たし、バルブに接続します。最後に、バルブ1と2を廃棄側に切り替え、ローディングコイルに進入した余分な液体や気泡を排出します。次に、まず50 µL/minの速度で25 µLの空気を吸引し、サンプルコイルにロードするためのプログラムを設定します。

次に、サンプル 250 µLを 200 µL/minで負荷し、続いてリーディングバッファー 35 µLを 200 µL/minで、最後に空気 25 µLを 50 µL/minで負荷します。その後、シリンジポンプを設定して、負荷した流体プラグを 100 µL/minで注入し、フローセンサーを用いて小粒子および大粒子出口での流速をモニタリングします。適切な流量比は、付属のテキストプロトコルに記載されている方法で決定できます。

フローセンサーが流量の急増を検知し、最初のエアギャップの通過が示されたとき、対応する出力バルブを廃棄バイアルからサンプル回収バイアルに切り替えます。フローセンサーの読み取り値を観察し、サンプルがチップを通過して分離される際に、流れが安定していることを確認してください。サンプルがチップを通過すると、分離されたフラクションが出口バルブで回収されます。

サンプルプラグの終端でフローセンサーを観察し、2回目のエアギャップを検出します。この時点で、出力バルブを廃液側に戻します。全量が分注された後、シリンジポンプの注入を停止し、自動化ルーチンを終了します。

分離実験の完了後、小粒子および大粒子の試料回収バイアルを取り外し、後続の分析のために適切に保存してください。チューブ内を洗浄する余剰な洗浄液を回収するため、試料ピックアップチューブを空のバイアルに固定してください。その後、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、システムの自動洗浄ルーチンを開始してください。

このプロセス中、プログラムがバルブとシリンジポンプを制御し、洗浄試薬をホールディングコイルに順次充填してシステム内をフラッシュします。自動洗浄および除染プロセスが完了したら、生物学的または化学的廃棄物の取り扱いに関する適切な手順に従い、過剰なフラッシング溶液とそれを回収したバイアルを廃棄してください。ここに、適切に結合したピエゾおよびマイクロ流体デバイスからの代表的な周波数スキャンを示します。

ピエゾとマイクロ流体デバイスの結合が良好な場合、共振周波数において粒子が密に集束し、その結果、蛍光強度に明確なピークが現れ、期待される集束位置への移動が起こります。対照的に、結合が不十分な場合は粒子が適切に集束せず、高品質な集束や高速フローが必要なアプリケーションには不適となります。このグラフの各ラインは、さまざまなサイズのポリスチレン粒子およびピエゾ駆動電圧を用いた分離結果を表しています。

一般的に、より小さな粒子を抽出するには、より高い電圧が必要です。しかし、放熱量の増大やアコースティックストリーミングの影響が強まるため、印加電圧を無限に上げることはできません。生物学的粒子の分離における本プラットフォームの有用性を実証するため、平均直径 8 ～ 10 µm のヒトRaji細胞に、直径約 50 nm のデングウイルスを添加し、音響マイクロ流体デバイスを用いて分離を行いました。

このようなシステムを組み立ててプログラムすれば、分離操作を通常約5分で実行できます。サンプル間の完全な洗浄と除染を含めて、1時間あたり約3サンプルの処理が可能です。本手順に続いて、細胞計数、ウェスタンブロッティング、または次世代シーケンシングなどの手法を行うことで、分離の純度を確認し、生物学的意義を解明することができます。

このビデオを視聴することで、一般的なマイクロ流体分離デバイスの作製方法について十分に理解できるはずです。ワールド・トゥ・チップ接続を用いてハードウェアとインターフェースし、自動分離手順を正確かつ堅牢に実行してください。感染性物質の取り扱いは非常に危険であるため、適切な生物学的安全のために機関で規定された設備と手順を用い、十分な訓練を受けた人員のみが行う必要があることに留意してください。