Name: マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた自動化された微小粒子分離法。音響マイクロデバイスで生物学的粒子を高精度に分離し、臨床研究やバイオ検出への応用を支援します。この技術はモジュール性と堅牢性を備えています。

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この作業は、ローレンス・リバモア国立研究所が米国エネルギー省の後援の下で契約DE-AC52-07NA27344の下で実施し、LLNLの研究所主導研究開発(LDRD)プログラム、14-LW-077によって部分的に支援されました。 著者らは、GGVおよびBoa細胞のサンプルを寛大に提供してくれたカリフォルニア大学サンフランシスコ校のMichael Wilson氏、Mark Stenglein氏、Joe DeRisi氏に感謝します。 EJFは、LLNLローレンス奨学生大学院プログラムからの支援を認めています。 MSは、UCの学長室ラボフィー研究プログラムからの支援を認めています。 LLNL-JRNL-665235

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著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、自動化された生物学的サンプルの処理を実行するためのマクロスケール装置のマイクロ流体デバイスのシステムレベルでの統合を提供します。このプラットフォームのモジュールは、一例として提示したプロトコルを特徴付けるとacoustofluidic粒子分離装置の性能を最適化することに焦点を当て、それは任意の連続流装置に適応することを可能にする、と。このプロトコルの三つの主要な利点が強調表示されます：（I）モジュール性とチップ・ツー・世界インタフェース、デバイス性能の（ii）の強固な特性評価、および粒子分離のために正確に計量サンプル容量の（iii）の自動処理を。 私。モジュール化とチップ・ツー・世界インタフェース 図2に示すように 、マイクロ流体チップは、簡単に直接観察するための顕微鏡ステージ上にフィットするようにカスタムブレッドボードに搭載されています。ブレッドボードは、5ミリメートルピッチグリッド、ENAの＃6-40 UNFネジ穴が含まれていますチップを見せびらかすことは固定されるように、流体接続がなされます。流体接続は、ゴムフェイスシールガスケットとステンレス鋼の襟付き流体チップに対してどのシール、機械加工端部と管をPEEKています。このインタフェース方式は簡単にチップの交換と迅速なデバイスの再設計になり、他のシステムコンポーネントにいくつかまたは全く変更を必要とする、設けられたチップのフットプリントは、グリッド形式に準拠しています。例えば、我々は、連続フロー電気泳動のためのマイクロ流体チップ、熱細胞溶解、29迅速な化学合成のための試薬 ​​の混 ​​合、および単一細胞捕捉と尋問でこのプラットフォームを使用していました。 II。デバイス性能のロバスト特性評価 任意のマイクロ流体分離装置の性能を最適化するために、その動作は、第1の完全に特徴付けされなければなりません。ここで説明するシステムは、これを行うための迅速かつ自動化されたプロトコルの開発をサポートしています。特定exampについてル音響集束装置、焦点品質、動作周波数、及びマイクロ流体チャネル内の集束粒子の位置は、各個々のデバイスのために測定されなければなりませんの。これらの測定は、高品質の分離のための最適なパラメータの組み合わせを同定するために、圧電駆動周波数、電圧、流量の範囲を掃引する必要があります。提示されたプロトコルは、自動的にこれらの調整可能なパラメータを変化させると、品質、周波数、および位置（ 図3）粒子集束の必要な測定値を生成するために後処理されているチャンネル内を流れる粒子の関連データーすなわち 、蛍光画像をキャプチャします。 音響装置の性能の完全な特性は異なる実験条件の下で、必要に応じて、手順4.4と4.5を繰り返す必要があります。例えば、チップの絶対的な焦点位置は、比較的低流量と高電圧で周波数スキャンを実行することによって発見されましたSは、ノード位置への完全な移行を確実にします。さらに、このような周波数スキャンは、（既知のサイズのポリスチレンビーズを使用して実行）デバイスアセンブリの品質を評価することができ、または（チップビーズで特徴づけされた後に）以前に未知の粒子タイプがシステムにどのように振る舞うかを決定するために。悪いエネルギー移動のものにも焦点を当てるものではありませんが、マイクロ流体チャネルへの圧電セラミックからの良好なエネルギー移動とチップは、タイトな高流量（&gt; 1 ml /分）と低電圧（12〜15 V ppの）に焦点を当てになります低流速（&lt;100μL/分）、高電圧（&gt; 20 V PP）で。我々は、マイクロ流体チップと圧電セラミックの間の密接な接触は、流体への効率的なエネルギー伝達のために重要であることを見出しました。マイクロ流体チップと圧電セラミックを接着する最適な方法のさらなる調査は、高性能デバイスの信頼性の高い生産を可能にします。 最後に、完全なacoustophoretic装置の動作の画像は、マイクロスフェアを用いて行わ分離実験から、関連した動作パラメータの関数としてSPOとLPOから収集粒子数とステップ4（ 図 3）の画像ベースの周波数スキャンの測定を組み合わせることによって得ることができます図6に示すように、ステップ5で説明したように、自動化された実験のような一連の急速に粒子を分離するためのデバイスを動作させるために最適なパラメータ空間をユーザに知らせる、個々のデバイスの性能と可変性を特徴付けることができます。 III。粒子分離用の自動小サンプル処理 成功し、正確なマイクロ流体チップベースのサンプル処理のためには、確実かつ正確にメーター、負荷は、提供し、彼らが通過などの流体の体積を収集することが重要です。試料容量が小さい場合、この精度は特に重要です（〜0.1〜1ミリリットル）を、臨床または研究実験室の設定では一般的です。30正確なサンプル処理が時サンプルのフィードバックのないデバイスに注射器や点滴へのサンプルのマニュアル撤退を採用し、従来のマイクロ流体実験に挑戦しています分離されていて、それが収集されるタイミング。提示されたプロトコルは、自動化されたサンプルコイルの負荷を採用し、少量の試料の再現可能な分離を可能にするために流量センサからのリアルタイムのフィードバックと結合された分注。 図5は、典型的な分離実験からSPOとLPOで測定されたフロープロファイルを示します。まず、少なくとも35マイクロリットルのリーディングバッファーは、サンプルは、音響チップに到達する前に、安定した流れを確保するためにロードされます。リーディングバッファーにサンプル希釈が過剰になるため、100μlのより少ないサンプルボリュームは、このようなシステム構成に推奨されていません。空気のプラグは目の初めに使用されていますサンプルの混合および希釈を防止し、流量センサの指標となる、以下の流体からサンプルプラグを分離するリーディングバッファーの前に電子注入。流体がシステムを通って移動し始めると、初期の過渡後、両方の店の鋭いスパイク信号は、最初の気泡の通過を示しています。これらの過渡現象は、シリンジポンプが停止した後にゼロに第2の空気の泡が通過し、別のスパイク、サンプルがシステムを通って流れるように安定した流れの長い期間が続き、最終的には流量の最終的な減少しています。 流量センサを通る空気プラグの通路は、このように、非サンプル流体体積​​によって失われた試料および希釈を最小化し、サンプルの収集を開始および停止するためのバルブを切り替えるトリガーポイントとして使用されます。処理されたサンプルボリュームの閉ループ調量は実験開始前に、これらの値の入力サンプルが変更されるたびに再プログラムする必要がなくなります。この機能は、特に重要なサンプル容量は、多くの臨床サンプルの場合には、例えば、制限されている場合。リアルタイムフローモニタリングはまた、トラブルシューティングに役立ちます。貧しいラン（ 例えば 、コンセントのいずれかで形成詰まり）が図5bのように、結果として得られる流れプロファイルから直ちに明らかです。 柔軟性とacoustofluidic分離の有効性提示システムアーキテクチャを使用して、精製DENVとGGVウイルスストックを実証するために、マイクロ流体チップを介して細胞株にスパイクして処理することにより分離した。 図7aは、Raji細胞を97として、ウイルスから十分に分離されたことを示していますチップを出るRaji細胞の％は、それによってSPOにDENVの高度に濃縮されたサンプルを残して、LPOであることが見出されました。比較では、DENV分離の効率がDENVの70％がSPOで見つかったチップを出て、低かったです。これはseparatiのターンによって誘発されるわずかな対流混合に起因することができますチャネルではなく、LPOにRaji細胞と一緒に移行するいくつかのDENV粒子に可能性が高いです。流線を横切って横方向に移動する細胞は、低レイノルズ数で、彼らといくつかの流体をドラッグします。このメカニズムだけでなく、非特異的な表面吸着することにより、ウイルス粒子は、LPOに移します。それにもかかわらず、SPOにおけるDENVの高度に濃縮されたサンプルは、 デノボシーケンシングは、ウイルスを検出し、識別するために使用される場合、例えば、重要な利点です。 図7bは、一つの実験では、チップを出るボア細胞の約70％は、Raji細胞のためにほぼ100％の分離効率と比較して、LPOで発見されたことを示しています。したがって、より小さな音響力をもたらす、Raji細胞と比較して、2つの細胞型間の分離性能の差は小さい平均サイズまたはボア細胞のより低い密度に起因し得ます。これらの仮定、ボアの大きさ、密度及び形態を確認または反論するために、ボア細胞の（通常は付着成長）懸濁液中の細胞を正確に、さらなる調査のための努力を測定する必要があります。同じ実験では、同様にDENVでの実験に、回復GGVの大部分は、ウイルス画分の濃縮を示す、SPOから出ました。 提示されたデータは、生物学的サンプルのさまざまなを処理するためのエンジニアリング広く、該当するプラットフォームの固有の課題を強調表示します。重要なことは、生物学的相互作用は、物理的および機械的効果として大きな役割を果たして始めることができます。しかしながら、これらの予備実験は、臨床および研究の用途において、サンプル処理のために、このシステムアーキテクチャを使用しての力と約束を実証します。堅牢、よく特徴付けられた設計システムとして、このプラットフォームは、新しい科学的な質問の回答を求める機能を提供します。

サンプル分離及び分画は、マイクロ流体技術の応用の最も有望な分野の一つです。このようなサンプル処理の手順は、効果的な臨床診断、治療の開発、biosurveillance努力、および生命科学の研究と技術の進歩のために不可欠です。無数のマイクロ流体分離戦略は、流体浮遊粒子やコロイドのために、並びに化学と生物種のために実証されています。 9 -いくつかのレビューは、これらのフィールド1に最近の進歩と発展の概要を提供します。これらのマイクロ流体分離技術（以下、「コアデバイス」と呼ばれる）の多くは、広範に特徴付けられているが、いくつかのレポートは、システムレベルでの試料の分離問題と考えられています。コアデバイスは、一般的に変位または圧力ポンプによって供給される流体では、フルオロポリマーチューブにインタフェース個々のセンチメートルスケールのチップです。増加した自動化、信頼性、およびサンプル量の減少を含む - - マイクロフルイディクスの約束があればしかし、現実になることであり、少なくとも同等の努力はコアデバイスが統合されてその中に完全に分離するシステムの設計に専念する必要があります。 また、バイオ検出するマイクロ流体アプローチのための大きな課題は、マイクロインターフェイスにマクロです。これは〜（マクロスケールの構成要素へのマイクロ流体デバイスの物理的な「世界・ツー・チップ」接続すると、典型的な臨床または分析試料の体積（〜0.1〜10ミリリットル）とマイクロ流体チップの内部容積の間のミスマッチのみならずいい0.01〜10μl）を、だけでなく、これらのサイズスケールをブリッジから生じる統計的サンプリングの制限。これらの問題は、サンプルの前処理と準備がバイオ検出の「弱点」であるという認識に貢献しています。10この作品TAで説明プラットフォームこれらの課題に対処に向けたKES主要なステップ。 システム・レベルのビューを取って、このプロトコルは、〜10分の時間スケール上の（0.15〜1.5ミリリットルの範囲）正確に計量分析スケールのボリュームの信頼性の高い処理を詳述します。これは、「ワンボタン」の操作である：フラクションコレクションのためのサンプルと宛先のバイアルを含むソースバイアルがシステムに置かれたら、「実行」コマンドは、手続きを開始し、すべての手順は、コンピュータ制御されています。実行の終わりに、回収バイアルは分離された画分の下流の分析のためにシステムから除去することができます。 このシステムのコアデバイスは、試料からの哺乳動物細胞の大きさ（5〜20ミクロン）の粒子を抽出acoustophoresisチップです。それは、このように実行可能なホテルビルを分離する利点を提供し、高スループット（μL/分の100秒まで）、ラベルフリー、非接触であるため、Acoustophoretic分離は主にここで選択されています他のいくつかのマイクロ流体技術を一致させることができ、細胞からのSES。 13とこのプロトコルの焦点ではなく、基礎となる概念の概要は、マイクロ流体分離への応用の理解を助けるために、以下の-音響粒子の物理学は広く、11に記載されている焦点を当てています。 液体で満たされたマイクロチャネル内で共振する超音波の定在波が低圧のノードに向かって粒子を駆動力を生じさせる圧力フィールドを生成します。力の大きさは、中心に音響は、理想的なサイズの細胞（〜7-15の分離に適している、粒子の体積に依存し、このように相対密度、粒子の圧縮率由来音響コントラスト因子および懸濁流体に。14ウイルスサイズ（〜50-200 nm）の粒子からミクロン）。より大きな粒子は、圧力ノードに向かって移動します。しかし、力の大きさは非常に小さいため2-3ミクロン未満の粒子は、これらの小さな粒子または溶存種はほとんど全く動きません。音響分離の私たちの具体的な実装では、前述したように、15は、流体流路を分割するために、薄い壁を内蔵しており、調整可能な、焦点位置の非対称の配置を可能にします。これは、デバイスの設計に柔軟性を追加し、パフォーマンス上の利点-含む増加分離の品質と速度が-され、完全に別の場所に記載。16,17 しかし、この研究で説明したシステムレベルの設計アプローチの主な利点は、マイクロ流体コアデバイスの多種多様に適用可能であるということです。適切な調整は、入口/出口構成の変更を考慮してなさで例えば、慣性、流れ場分別、決定論的横変位（DLD）、および動電デバイスの様々なタイプを含むほとんどの他の連続フロー分離モードは、容易に組み込むことができます、流速、サンプルボリューム。様々なオンチップ・フィールドの種類（電気、磁気）または勾配（熱的、化学的）を持つデバイスは、このプラットフォームが対応し、チップ、または追加のハードウェアの統合への追加の接続が必要な場合があります。 このプロトコルは、マイクロ流体分離装置を設計するために、深い反応性イオンエッチング（DRIE、深い達成するために、エッチングと不動態化のサイクルを交互に使用し、多くの微細加工施設で利用可能なプラズマエッチングプロセスによってシリコンガラスチップを製造するために必要な手順を提供します垂直な側壁18）と機能。次に、acoustofluidicデバイスの特性を分離するための最適な動作パラメータを決定するために、そして最終的に詳細に完全に統合された分離システムと生物学的サンプルを処理するための手順を説明します。典型的なデバイス特性評価結果とサンプル処理データは、次に提示し、議論されており、このアプロの主な利点ACHは、モジュール性、堅牢性、精度、自動化を含む、ハイライト表示さ​​れます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">ステップ1-3に必要な材料:デバイスの設計、製造、組み立て</td></tr><tr><td>両面研磨シリコンウェーハ</td><td>Silicon Quest International, Inc. カリフォルニア州サンノゼ、米国</td><td>100 mm <100>&nbsp;プライムウェーハ</td><td>1-20オーム-cm、495&#177; 25&#160;&マイクロ;m 両面研磨</td></tr><tr><td>ガラスウエハー</td><td>Bullen Ultrasonics、Eaton、OH、USA</td><td>100 mmx0.5 mm Boro</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist、AZ 1518</td><td>MicroChemicals GmbH、ウルム、ドイツ</td><td>AZ 1518</td><td>DRIE エッチング用ブランクウェーハにウェーハを接着するために使用されるフォトレジ</td></tr>スト<tr><td>、AZ 4620</td><td>MicroChemicals GmbH、ウルム、ドイツ</td><td>AZ 4620</td><td>流体およびビアマスクパターンを定義するフォトレジスト</td></tr><tr><td>DRIE プラズマエッチャー</td><td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td><td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Bonder</td><td>Electronic Visions Group,&nbsp;St.Florian am Inn, Austria</td><td>EVG 501</td><td></td></tr><tr><td>ダイシングソー</td><td>Kulicke &Soffa Industries、シンガポール</td><td>K&S 982</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ キット</td><td>エポキシ技術、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国</td><td>EPO-TEK 301</td><td>ピエゾとマイクロ流体チップの結合に使用されるエポキシ</td></tr><tr><td>PZT ピエゾセラミック&nbsp;</td><td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td><td>PSI-5A4E</td><td>37.5 &times; 10 &times; 0.5 mm</td></tr><tr><td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td><td>UL1422</td><td></td></tr><tr><td>2-part silver epoxy&nbsp;</td><td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td><td>8331</td><td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td></tr><tr><td>L-edit</td><td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td><td>Ledit v15.1 64-bit</td><td>CAD software for mask layout</td></tr><tr><td colspan="4">ステップ4に必要な材料:音響集束性能の特性評価</td></tr><tr><td>デュアルポンプ</td><td>ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州、米国</td><td>PHD ULTRAシリーズ、703007</td><td></td></tr><tr><td>5&#160;mlシリンジ</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Luer to Threaded port adapter</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-659</td><td>シリンジをチューブに接続</td></tr><tr><td>Union</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-623</td><td>世界をチップ接続してフッ素樹脂チューブに接続。&nbsp;ウェッブも使用できます&nbsp;</td></tr><tr><td>フェルール1 / 4-28平底</td><td>IDEX、オークハーバー、ワシントン州、米国</td><td>P-200</td>チューブ<td>とシリンジ、フローセンサーと世界をチップハードウェアに接続するためにナットを使用</td></tr><tr><td>&nbsp; 1 / 4-28平底</td><td>IDEX、オークハーバー、ワシントン州、米国</td><td>P-202</td>チューブ<td>とシリンジ、フローセンサー、および世界からチップハードウェア</td></tr><tr><td>1/16インチODフッ素樹脂チューブ</td><td>IDEXへの接続を行うためにフェルールで使用。 米国ワシントン州オークハーバー</td><td>1912L</td><td>シリンジポンプを世界とチップ接続に接続するためのチューブ。&nbsp;チューブのサイズは、クラブレーションステップ(通常は.01-.03インチIDが使用され、その他の適切な部品番号:1907L、1902L)では重要ではありません。</td></tr><tr><td>小口径フッ素樹脂チューブ</td><td>IDEX、オークハーバー、ワシントン州、米国</td><td>1476-20</td><td>フローリストリクターに使用:0.006インチID、1/16インチOD FEP&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEKチューブ</td><td></td><td></td><td>チップからフッ素樹脂チューブに接続します。</td></tr><tr><td>冷却ファン</td><td>Multicomp, Leeds, England</td><td>MC19663</td><td></td></tr><tr><td>Function</td><td>Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>RF amplifier</td><td>ENI, Rochester, NY</td><td>325 LA</td><td>からの信号を増幅できなければなりません。1&#160;1-2&#160の範囲のV。MHzから25&#160;Vpp をピエゾに。</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>フォトメトリクス、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ</td><td>Axiovert S100</td><td></td></tr><tr><td>FITC フィルターセット</td><td>Chroma Tech、バーモント州、米国</td><td>SP101</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ、10X</td><td>ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ</td><td>ACHROPLAN</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronix、ビーバートン、オレゴン</td>州、米国 <td>TDS3014B</td><td>RFアンプによる電圧出力を監視するには</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td>R2014a</td><td></td></tr><tr><td>フォトメトリクスカメラをLabVIEW Rと統合するためのドライバーインターフェースソフトウェア</td><td>Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td><td>SITK</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32&#160;&マイクロ;m ビーズ</td><td>Bangs Laboratory, IN, USA</td><td>FS06F</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ステップ5に必要な追加材料: 自動分離</td></tr><tr><td>マルチポートバルブ</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>C25Z-3180EUHA</td><td>現在の構成では、4つのバルブが必要です</td></tr><tr><td>Flow Sensors</td><td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td><td>SLI-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID</td><td>IDEX, Oakハーバー、ワシントン州、米国</td><td>1902Lおよび1912L</td><td>高純度PFA優先</td></tr><tr><td>ナット</td><td>VICI、ヒューストン、テキサス</td>州<td>、米国 ZN1PK-10</td><td>フェルールと一緒にチューブとバルブ間の接続に使用されます。代替部品番号:MZN1PK-10、LZN1PK-10</td></tr><tr><td>フェルール</td><td>VICI、ヒューストン、TX、</td><td>USAZGF1PK-10</td>チューブ<td>とバルブ間の接続にナットを使用。&nbsp;</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td>LabVIEWプロフェッショナル開発システム</td><td>ラボラトリーオートメーションソフトウェア</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Teknova, Hollister, CA, USA</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATTC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL86</td><td></td></tr><tr><td>Boa Cells</td><td></td><td></td> 提供元:<td>UCSF GGV</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>のDeRisi研究室より提供Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td></tr><tr><td>DENV</td><td></td><td></td><td>Jose Pena at LLNL</td></tr><tr><td>Coulter Counter Z2</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Z2</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td><td>0267151B</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

マイクロ流体デバイスの主な利点は、このように、試薬の無駄を削減し、貴重なサンプルを維持し、少量のサンプルを操作する能力です。しかし、強固なサンプル操作を達成するために、大規模な環境でデバイスの統合に対処する必要があります。マイクロ流体デバイスとの再現性、敏感な粒子の分離を実現するために、このプロトコルは、マイクロ流体デバイスを使用して0.15〜1.5ミリリットルのサンプルの正確な処理を可能にし、完全な自動化と統合マイクロ流体プラットフォームを提供します。このシステムの重要な側面は、チップの接続に信頼性が高く、柔軟な世界をもたらすモジュラーデバイスレイアウトおよび堅牢な固定具を含み、閉ループ試料収集システムのクリーニング及び反復動作を保証するプライミング工程を達成完全自動化液体ハンドリング。別のマイクロ流体デバイスは、このアーキテクチャと互換的に使用することができます。ここでは、acoustofluidicデバイスを組み込んで、細部のcharacterizエーション、パフォーマンスの最適化、および生物学的サンプルのサイズ分離のためのその使用を実証します。分離実験中にリアルタイムのフィードバックを使用して、サンプル収集を節約し、サンプルを濃縮するために最適化されます。複数の機器の統合を必要とするが、このアーキテクチャの利点は、付加的なシステムの最適化、装置の交換を容易に、かつ正確に、強固な試料処理なしで未知のサンプルを処理する能力を含みます。

音響マイクロ流体デバイスの設計の主な機能は 、図1で強調表示され、完全に他の場所に記載されている。15を簡単に、二つの流体の流れの流れサイドバイサイド分離チャネル内では、薄いシリコン壁によって並列バイパス流路から分離されます。一次放射力の大きさは、粒子の体積に比例するので、小さい粒子は、元のストリーム（ 図1B、C）に残っている間、大きな粒子は、隣接する回収流体流に位置する音圧のノードに向けて混合サンプル入力ストリームから移動します。細分化2チャンネルのアーキテクチャは、粒子分離17を向上させ、別のバイパスチャネルの流体を使用してノード位置の調整を可能にする。16流体ブレッドボードや備品は、チップ接続に世界のための堅牢なプラットフォームを提供し、モジュラーデザインは、流体チップ間の迅速な変更を可能にします（ 図2）。このConfigurationは、同様に、迅速かつ確実に（ 図2B、E）作られているシール、最大1,000 psiの、可逆流体接続を許可します。 チップの共振周波数f RESは、単純な 1次元解析計算を用いて推定することができる（ステップ1.1.1参照）。私たちのデバイス断面のより完全な2D有限要素モデルから、2ノード共鳴用16予測される焦点位置が壁から225ミクロンであり、予想される周波数は1.68 MHzです。しかし、実際のデバイスのF 解像度は、動作温度、縦と横共振の結合に依存して、±100kHzで変化し得ます。プロトコルのステップ4で説明したようにそのため、デバイスの組立後、F resが経験的に、関連する流量とピエゾ駆動電圧で検証されなければならない。 図3は 、200μL/分で取られた代表的な周波数スキャンを示しています<html>メイン、バイパスチャネル内の水、および20 V ppのでピエゾに供給されます。ピエゾマイクロ流体デバイスとの間の結合が良好である場合には、粒子が予測される焦点位置（ 図3A）に蛍光強度および移行における明確なピークが得られ、共振周波数でしっかりと焦点を当てます。貧しいカップリングがある場合にはこれとは対照的に、粒子が十分に焦点を当てず、周波数スキャンの結果を図3（b）のようになります。このようなデバイスでは、圧電変換器は、可逆接着剤が使用されている場合、再マウントする必要があるかもしれません。それ以外の場合、このデバイスは不向き高品質フォーカシングや速い流れで必要なアプリケーションのために重要です。 図3のデータは、その後の実験のために動作周波数の選択、及び電圧を知らせると、効率的な粒子の分離のために利用可能な速度範囲を流します。 ファイル/ ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; 図5自動試料処理サンプルコイルにロードされた試料の（A）の回路図。 （B）の成功分離実験の代表的なフロープロファイル。 （C）SPO出口は約220秒で詰まった時に実行分離からプロファイルを流れ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 効果的な分離器であるチップを識別した後、それらは 、図4に示されたシステムに組み込まれている。全システム掃引容積は、主流路に沿って0.01 &quot;の内径を有するチューブを使用することによって最小化される（青線）。 図5Aは、メイクアップを示していますシステムを介して注入された典型的なサンプルプラグの。 「リーディングバッファー」（〜35μl）を少量のpreceする必要がありますデ・サンプルは、分離チップを通って移動している間フローの変動を排除するためのフローのサンプルでは。 図5（b）は、成功した自動化された音響分離実験に起因するフローデータを示しています。成功した実行の主な機能は次のとおりですLPOとSPOの両方における流量（1）一過性の上昇を圧力が構築し、流体がシステムを通って流れ始めると、（2）気泡の通過を示す鋭いスパイク（インセットが原因二つの出口から不均等な流れにLPO前SPOに到達する必要があり、単一の気泡）の拡大プロファイルを示し、システムを介してサンプルを移動するような2つの気泡間の両方のアウトレットから（3）安定した流れ、 （4）全試料体積後の両方の出口での流量が徐々に減少がシステムに供給されます。問題の実行は、SPOは、約220秒後に詰まるとなったことが表示され、図5（c）に類似の流れプロファイルからすぐに明らかにされています。 THIで<html> Sの場合、ステップ5.3で説明したのと同様のクリーニング手順は、チャンネルを邪魔を除くために実行する必要があります。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> 図6.デバイスの調整可能性：粒子サイズと電圧の影響 。 LPOで抽出されたポリスチレン微小球の割合は、圧電セラミックに供給される粒子サイズと電圧に依存します。各行には、装置を通る4総流量は1.62と1.64 MHzの間に印加された駆動周波数で、200μL/ minであるステップで説明したように決定し、共振周波数で異なる動作電圧に対応しています。エラーバーは、少なくとも3つの別々の実験の標準偏差を表します。 / 2014 / AN / c4an00034j http://pubs.rsc.org / EN /コンテンツ/ ArticleLandingから化学の王立協会の許可を得て再現し、修正されました。ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図6に示すように、種々のポリスチレン粒子のサイズと効率的な分離のために必要な動作パラメータを実証するピエゾ駆動電圧を用いて分離した結果をまとめました。予想されるように、一般に、より高い電圧（ すなわち 、より大きな音響力）は、より小さな粒子を抽出するために必要とされます。駆動電圧は、無期限に起因する大きな熱放散と音響流の増加効果には、しかし、増加させることはできない。13プロットは特定の駆動電圧（例えば、で有意に異なる回復を示す粒子の分離・粒子サイズのための一般的なガイドとして役立ちます10-および8.8 V PPで2μmの粒子）が十分に分離します。一般に、このようなウイルス（〜100 nm）を細胞（〜10ミクロン）のような大きなサイズの差を有する粒子の集団は、差分の細胞はできる限り、迅速かつ効率的に分離することができ、erentのサイズ（例えば、6-8μmの円盤状赤血球および8-15μmの白血球）。他の細胞型で動作するために必要な具体的な条件は、細胞の形状、密度、圧縮率としてセルサイズに加えて、その音響コントラストに影響を与え、経験的に決定されなければなりません。このため、ステップ4の手順は、新しい細胞又は粒子タイプに使用可能な分離条件を決定するために有用であり、特定のacoustophoresis装置の品質を評価するだけでなく。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> デング熱ウイルスでスパイク（A）Raji細胞（DENV）と（B）Raji細胞とゴールデンゲートウイルス（GGV）でスパイクボア腎臓細胞からの細胞にウイルススパイクサンプル。分離結果の図7.分離効率 。収集したパーセンテージは、特定のから出てくるウイルスや細胞の割合として定義されていますチップを出た合計金額に比べアウトレット。 （B）内のサンプルのみを、利用可能な少量に一度処理された一方のためのエラーバー（A）は 、3試験の標準偏差です。 1×PBSを全ての実験のためのバイパス流路に水を、サンプル緩衝液と回収流体として使用しました。チップの動作周波数は、16と20 V ppの間の駆動電圧で、1.60と1.64 MHzの範囲であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ヒトRaji細胞（10 5細胞/ mlで、平均粒径8~10ミクロン25）、デングウイルス（DENV、10でスパイクした：生物学的粒子を分離するため、このプラットフォームの有用性を実証するために、我々は最初に、十分に特徴付けられた生物学的サンプルを処理するために使用されます5 PFU / mlで、直径約50nmの26）。 図7ショーSPOとLPO（チップから収集した各粒子の総量と比較して、各コンセントから収集された各粒子タイプの割合と定義される）の両方に集めRaji細胞とDENVの割合。実験を三連で繰り返し、DENVを逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）を用いて定量しながらRaji細胞を、コールターカウンターを用いて定量しました。 次に、システムの性能は、粒子の正確な物理的特性が不明であってもよく、利用可能な試料量が低いいる臨床試料を処理するためのより現実的なシナリオで試験しました。ここでは、最近同定されたゴールデンゲートウイルス（GGV）、ボア・コンストリクター腎細胞に感染ヘビの病原体の分離を評価した。GGVウイルス粒子の27サイズがまだ測定されていないが、GGVはアレナウイルス科ファミリーに属しているので、それをの可能性があります100と150 nmの間で同様のサイズ、28我々はGGVでサンプルを処理したがラジヒト細胞（ウイルスのためではない感染対象）、およびボア腎臓細胞（GGVのための感染症の対象、おおよそのサイズ10に（10 4 PFU / mlに）スパイク10 4細胞/ mlの両方の細胞型と27ミクロン）。これらのサンプルは少量で利用可能であったように、一つだけの実験からの分離結果を図7（b）は、Raji細胞、ボア細胞の割合を示している。この研究で報告され、GGVはSPOとLPOから収集されます。細胞を血球計でカウントすることによってこれらの実験で定量化されたウイルスは、RT-qPCRにより定量しました。

このプロトコルは、マイクロ流体デバイスを使用して自動化された小容量(0.15–1.5 ml)粒子分離を実行するためのシステムアーキテクチャを説明し、音響流体デバイスの性能と操作を最適化する方法を議論します。

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

この手順の全体的な目的は、マイクロ流体フォトニックデバイスを用いて、少量の粒子の自動分離を行うことです。この手法は、バイオ検出や臨床研究アプリケーションに向けたサンプルの堅牢な処理および分離など、生物医学工学分野における主要な手順を可能にします。この技術の主な利点は、モジュール性、精度、堅牢性、および自動化にあり、網状赤血球（reticulocyte）の分離だけでなく、多種多様なフロースルー型マイクロ流体分離デバイスにも適応可能で柔軟な運用が可能です。私たちはまず、分析物の大幅な希釈や損失を伴わずに、サブミリリットル単位の生物学的サンプル量でルーチンかつ信頼性の高い分離を行う能力が必要であることを認識しました。サンプルの計量およびソースから回収までの自動ルーティングを、標準的なシリンジポンプ操作と統合することが、このスケールで正常に動作させるために不可欠です。設計を開始するには、付随するテキストプロトコルのセクション1に記載されている通り、音響レティクデバイスおよび2枚のフォトマスクのレイアウトを作成してください。次に、両面研磨済みの1 0 0シリコンウェハ上に背面流体ポートをパターニングします。標準的なポジレジストを用いたフォトリソグラフィーを行い、深反応性イオンエッチングを用いてこの形状を350から400 µmの深さまでエッチングします。続いて、ウェハを裏返し、表面の流体チャネル形状をパターニングします。再び標準的なポジレジストを用いたフォトリソグラフィーを行い、パターン形成したウェハーを2枚目のブランクシリコンキャリアウェハーに実装します。次に、フォトレジストを用いて、露出したチャネルを200 µmの深さまでエッチングします。深反応性イオンエッチングを行い、その後、デバイスウェハーをレジスト剥離液に浸し、ブランクシリコンウェハーから分離させます。次に、ピラニア溶液を用いてデバイスウェハーと特徴のない厚さ0.5 millimeterのホウケイ酸ガラスウェハーを洗浄します。洗浄後、ここに示す条件でガラスウェハーとシリコンウェハーをイオン結合させ、流路を封止します。最後に、2液混合型の低粘度エポキシキットを用いて、ダイシングソーのダイヤモンドブレードで個々のチップを切り出します。両方のコンポーネントを推奨比率で秤量し、十分に混合します。次に、ジルコンチタン酸鉛（PZT）またはPCT圧電セラミックスを適切な治具にセットし、ピペットを用いてエポキシ混合液を約10 µL、表面全体に均一に広げ、薄い均一な層を作成します。続いて、チップを治具に配置し、圧電セラミックスのエポキシ側をマイクロ流体チップと合わせます。アライメントを行う間、チップを固定するためにテープで仮止めする必要がある場合があります。アセンブリを万力で固定しますが、その際、構成部品を破損させないように注意し、エポキシ樹脂メーカーが推奨する温度と時間で硬化させてください。エポキシ樹脂が硬化した後、極細のハンダごてを使用して、ピエゾセラミックスの両側に細いゲージのリード線を接続します。必要に応じて、適切なフラックスを使用してピエゾ表面を準備します。熱による脱分極を防ぐため、ピエゾへの接触時間は可能な限り短くするように注意してください。クランピング固定具を用いて、チップをフルイディックブレッドボードに取り付けます。また、音響実験中の温度を調節するため、ブレッドボードに冷却ファンを取り付けます。次に、チップをワールドコネクタにネジで固定します。ブレッドボードを顕微鏡ステージに設置し、ワールド・チップ間コネクタを入口および出口にある追加のチューブに接続します。標準的な1/4-28ネジ付きユニオンを使用します。1/16インチのチューブを用いて、ここに示し、また付属のテキストプロトコルの図4で説明している通りに、マイクロ流体チップをシリンジポンプ、コンピュータ制御のマルチポート選択バルブ、PCインターフェース付き流量計、およびチューブに接続します。分離を開始する前に、洗浄試薬リザーバーを満たし、対応する流路をプライミングしてください。また、チップ出口にあるバルブ3と4を、最初は廃棄リザーバーへ流れるように設定します。次に、冷却ファンをオンにします。ピエゾセラミックリードをパワーアンプに接続し、使用するアコースティックチップの共振周波数にファンクションジェネレータを設定します。所望の分離に適した12〜25 V peak-to-peakのRFアンプ出力となるように、ファンクションジェネレーターの電圧設定値を調整します。次に、適切な回収用バイアルとバッファー入力バイアルをシステムに接続します。分離させる細胞または粒子に適したサンプルバッファー、あるいは分離後に使用する分析アッセイで要求されるバッファーを使用してください。次に、制御ソフトウェアをロードし、それを用いてバルブ、フローセンサー、およびポンプを制御し、完全自動のプライミングおよび分離ルーチンを実行します。分離手順を開始する直前に、サンプルバイアルを短時間ボルテックスし、沈殿した可能性のある粒子を再懸濁させます。あるいは、ボルテックスによる損傷や凝集が起きやすい生物学的サンプルの場合は、ピペットで10回吸い上げ・吐出を繰り返して混合してください。次に、サンプルバイアルを入力ラインに取り付け、遅滞なくプライミングおよび分離ルーチンを開始します。まず、ソフトウェアを使用してバルブ1およびバルブ2の空気入口をプライミングし、チューブ内に液体が含まれていないことを確認します。同時に、バッファー入力バイアルからバルブ2へ、およびサンプル入力バイアルからバルブ1へ接続されているチューブをプライミングします。シリンジポンプを用いて、両方のバイアルから約15 µLを吸引してチューブ内を完全に満たし、バルブに接続します。最後に、バルブ1と2を廃棄側に切り替え、ローディングコイルに進入した余分な液体や気泡を排出します。次に、まず50 µL/minの速度で25 µLの空気を吸引し、サンプルコイルにロードするためのプログラムを設定します。次に、サンプル 250 µLを 200 µL/minで負荷し、続いてリーディングバッファー 35 µLを 200 µL/minで、最後に空気 25 µLを 50 µL/minで負荷します。その後、シリンジポンプを設定して、負荷した流体プラグを 100 µL/minで注入し、フローセンサーを用いて小粒子および大粒子出口での流速をモニタリングします。適切な流量比は、付属のテキストプロトコルに記載されている方法で決定できます。フローセンサーが流量の急増を検知し、最初のエアギャップの通過が示されたとき、対応する出力バルブを廃棄バイアルからサンプル回収バイアルに切り替えます。フローセンサーの読み取り値を観察し、サンプルがチップを通過して分離される際に、流れが安定していることを確認してください。サンプルがチップを通過すると、分離されたフラクションが出口バルブで回収されます。サンプルプラグの終端でフローセンサーを観察し、2回目のエアギャップを検出します。この時点で、出力バルブを廃液側に戻します。全量が分注された後、シリンジポンプの注入を停止し、自動化ルーチンを終了します。分離実験の完了後、小粒子および大粒子の試料回収バイアルを取り外し、後続の分析のために適切に保存してください。チューブ内を洗浄する余剰な洗浄液を回収するため、試料ピックアップチューブを空のバイアルに固定してください。その後、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、システムの自動洗浄ルーチンを開始してください。このプロセス中、プログラムがバルブとシリンジポンプを制御し、洗浄試薬をホールディングコイルに順次充填してシステム内をフラッシュします。自動洗浄および除染プロセスが完了したら、生物学的または化学的廃棄物の取り扱いに関する適切な手順に従い、過剰なフラッシング溶液とそれを回収したバイアルを廃棄してください。ここに、適切に結合したピエゾおよびマイクロ流体デバイスからの代表的な周波数スキャンを示します。ピエゾとマイクロ流体デバイスの結合が良好な場合、共振周波数において粒子が密に集束し、その結果、蛍光強度に明確なピークが現れ、期待される集束位置への移動が起こります。対照的に、結合が不十分な場合は粒子が適切に集束せず、高品質な集束や高速フローが必要なアプリケーションには不適となります。このグラフの各ラインは、さまざまなサイズのポリスチレン粒子およびピエゾ駆動電圧を用いた分離結果を表しています。一般的に、より小さな粒子を抽出するには、より高い電圧が必要です。しかし、放熱量の増大やアコースティックストリーミングの影響が強まるため、印加電圧を無限に上げることはできません。生物学的粒子の分離における本プラットフォームの有用性を実証するため、平均直径 8 ～ 10 µm のヒトRaji細胞に、直径約 50 nm のデングウイルスを添加し、音響マイクロ流体デバイスを用いて分離を行いました。このようなシステムを組み立ててプログラムすれば、分離操作を通常約5分で実行できます。サンプル間の完全な洗浄と除染を含めて、1時間あたり約3サンプルの処理が可能です。本手順に続いて、細胞計数、ウェスタンブロッティング、または次世代シーケンシングなどの手法を行うことで、分離の純度を確認し、生物学的意義を解明することができます。このビデオを視聴することで、一般的なマイクロ流体分離デバイスの作製方法について十分に理解できるはずです。ワールド・トゥ・チップ接続を用いてハードウェアとインターフェースし、自動分離手順を正確かつ堅牢に実行してください。感染性物質の取り扱いは非常に危険であるため、適切な生物学的安全のために機関で規定された設備と手順を用い、十分な訓練を受けた人員のみが行う必要があることに留意してください。

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