粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

この手順の全体的な目的は、抵抗パルスセンシングと符号分割多重接続を組み合わせ、複数のマイクロ流体チャネルにおける粒子の検出およびサイズ測定を多重化するマイクロ流体プラットフォームを実証することです。microfluidic CODESと名付けられたこの技術は、リソースが限られた環境での生物学的試料のポイントオブケア検査に適した、完全に統合され、真にポータブルなラボオンチップデバイスの実現に寄与します。この手法の主な利点は、マイクロ流体チップ上の粒子の空間的および時間的な操作を電子的に追跡できるため、顕微鏡のような外部機器が不要になることです。

本技術はソフトリソグラフィーとの互換性があり、粒子を分画してコールターカウンターと同様の直接的な電子読み出しを行うマイクロフォトニックデバイスへ容易に統合することが可能です。マイクロ流体デバイスの作製を開始するには、まず4組の7ビットのゴールドコードを生成します。次に、AutoCADなどのコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを用いて、これらのゴールドコードに基づいた4種類の固有な電極レイアウトを設計します。

最後に、設計した電極レイアウトに基づいたフォトマスクをフォトマスク業者に作製させます。次に、4インチのホウケイ酸ガラスウェハを、120 °Cで20分間、ピラニア溶液（5:1）に浸漬します。洗浄後、ウェハをホットプレートで200 °Cで20分間加熱し、残留水分を蒸発させます。

洗浄し乾燥させたウェハをスピンコーターに設置します。ウェハにネガ型フォトレジスト溶液を2 milliliters滴下し、3000 revolutions per minuteで40 seconds間スピンコートします。スピンコート後のウェハをホットプレートにて150 degrees Celsiusで1 minute間乾燥させます。

ウェハーを、所望の電極パターンのクロムマスクで覆います。マスクされたフォトレジスト表面に365 nanometerのUV光を照射し、225 millijoule per centimeter squaredに到達させます。その後、露光したフォトレジストをホットプレートを用いて100 degrees Celsiusで1分間ベークします。

ウェハーをフォトレジスト現像液に15秒間浸し、その後、脱イオン水の緩やかなスプレーでパターンウェハーを洗浄し、窒素ガス流でウェハーを乾燥させます。次に、パターン形成後のウェハーを電子ビーム金属蒸着装置に設置します。1 Å/sの速度で、厚さ20 nmのクロム層と厚さ80 nmの金層をウェハー上に堆積させます。

次に、金属コーティングしたウェーハをアセトン中で40 kHz、振幅100%で30分間超音波加熱し、下層のフォトレジストをエッチングします。ダイシングソーを使用して、必要に応じてウェーハを小さく切断します。マイクロ流路モールドの作製を開始するには、前述のホウケイ酸ガラスウェーハと同様の方法で、4インチシリコンウェーハを洗浄し、乾燥させます。

シリコンウェハーをスピンコーターにセットし、ネガ型フォトレジスト溶液を4 mL塗布します。ウェハーを500 rpmで15秒間、次に1,000 rpmで15秒間、最後に3,000 rpmで60秒間スピンコートします。ウェハーをアセトンを浸したクリーンルームワイプの上に表面を上にして置き、ウェハーの裏面およびエッジから残留フォトレジストを除去します。

ウェハーを65°Cで1分間、続いて95°Cで2分間ベイクします。乾燥させたウェハー上に、マイクロ流路用のクロムマスクパターンを配置します。フォトレジストに365 nmのUV光を180 mJ/cm²で露光し、その後、ウェハーを再び65°Cで1分間、および95°Cで2分間ベイクします。

パターン形成したウェハーをフォトレジスト現像液を入れた容器に入れ、3分間緩やかに振盪させます。現像したウェハーをイソプロパノールで洗浄し、窒素ガス流で乾燥させます。ウェハーを200 °Cで30分間ベークした後、プロフィロメーターを用いて、パターン化したフォトレジストがウェハー全体にわたって均一な厚さであることを確認します。

ウェハーを真空デシケーターに入れ、蓋のないペトリ皿に入れた200 µLのトリクロロシランと共に置きます。ウェハー表面をシラン化するため、トリクロロシランと共にデシケーター内で8時間静置します。デバイスの組み立てを開始するため、汎用クリーンルームテープを使用して、シリコンウェハーモールドを直径150 mmのペトリ皿に固定します。

10対1の割合で混合したポリジメチルシロキサン前駆体を50 grams、ペトリ皿に加え、真空デシケーター内で1時間脱気します。脱気した混合物を65 °Cで少なくとも4時間硬化させます。メスを用いて硬化したPDMS層を切り出し、ピンセットでモールドから硬化層を剥がします。

PDMSを小さく切り分ける。バイオプシーパンチャーを用いて、マイクロ流路の入口と出口の穴を開ける。マイクロ加工された表面を洗浄するため、PDMSレイヤーのパターン面を下にしてクリアルームテープに貼り付ける。

あらかじめ準備した電極付きガラス基板を、アセトン、イソプロパノール、および脱イオン水で洗浄します。窒素ガス気流下で基板を乾燥させます。PDMS層と基板を、マイクロマシン面を上にして、100 milliwattsに設定したRFプラズマ発生装置に入れます。

酸素プラズマを用いてマイクロマシンの表面を30秒間活性化させます。次に、光学顕微鏡を使用して、パターン化したPDMS層と表面電極の位置を合わせます。位置合わせが完了したら、表面同士を物理的に接触させ、PDMS層をガラス基板上に密封します。

ガラス基板上のコーティング電極パターンを、PDMSマイクロ流路と正確に整合させることが極めて重要です。適切に整合されることで、粒子と表面電極との相互作用により、マルチプレクシングのための目的のコード波形が生成されます。組み立てたデバイスを、ガラス面を下にして70 °Cで5分間加熱してください。

最後に、電極コンタクトパッドにワイヤをはんだ付けし、デバイスの組み立てを完了させます。実験を開始するには、マイクロ流体デバイスを光学顕微鏡のステージ上に配置します。デバイスのリファレンス電極をロックインアンプの信号出力ポートに接続し、400 kilohertzの正弦波を印加します。

正および負のセンサー電極を、2つの独立したトランスインピーダンスアンプに接続します。両方のトランスインピーダンスアンプをロックインアンプの差動電圧入力に接続し、正のセンサー信号が負のセンサー信号から差し引かれるようにします。ロックインアンプの復調器出力をデータ収集ユニットに接続します。

データ収集ソフトウェアで、ロックインアンプ出力のサンプリングレートを1 Megahertzに設定します。顕微鏡下でのデバイスの動作を光学的に記録するため、高速カメラをセットアップします。準備した細胞懸濁液をシリンジに吸い込みます。

サンプルシリンジをシリンジポンプに固定し、シリンジを導入チャネルに接続します。流出チャネルを廃棄容器に向けます。シリンジポンプを使用して、インピーダンス変調信号を記録しながら、一定の流量で細胞懸濁液をデバイスに流します。

実験完了後、解析ソフトウェアを用いて電気データを処理します。処理された電気信号を高速度カメラの画像と比較し、細胞サイズの校正曲線を作成します。直交センサコードから導出された4つの固有の電極パターンを持つマイクロ流体センサデバイスに、細胞懸濁液を流しました。

4つすべてのセンサー信号は、単一の電気出力から記録されました。記録された各信号に対応する個々のセンサーは、記録されたセンサー信号とあらゆる可能なコードとの相関によって特定されました。これにより、明確に区別可能な自己相関ピークが得られました。4つの全チャネルで細胞が同時に検出された際に生じる干渉信号による波形は、反復アルゴリズムを用いて分離されました。

記録された波形をすべての可能なコードと相関させ、最大の自己相関ピークを特定した。対応する個々のセンサー信号を再構成し、それを入力波形から差し引いた。得られた残留信号を次のイテレーションへの入力として渡し、残留信号に自己相関ピークが現れなくなるまでこのプロセスを繰り返した。

推定された信号は、最小二乗近似を用いて、再構成された波形と元に記録された波形の間の最良の適合性を求める最適化アルゴリズムに基づいて精緻化されました。その後、推定されたセンサー信号のチャンネル番号、振幅、持続時間、および相対的なタイミングから、細胞の位置、サイズ、およびセンサーを通過するまでの時間が決定されました。この手順は、電気信号を高速カメラによる光学的な測定結果と比較することで検証されました。

この手法は一度習得すれば、ハードウェアの観点から非常にシンプルであるため、実装が極めて容易です。チップ上のアクティブコンポーネントを必要とせず、ソフトリソグラフィーと直接的に互換性があり、信号処理は単純な計算アルゴリズムに基づいています。

本プロトコルに従うことで、コードベースのマルチプレックス電気センサーを備えたマイクロ流体チップを作製し、バイオ分析測定のための電気信号をデコードすることができます。この汎用性と拡張性に優れた電子センシング技術は、さまざまなマイクロ流体デバイスに容易に統合でき、チップ上で処理される粒子を時空間的に追跡することで定量的なアッセイを実現します。このビデオを視聴することで、マイクロ流体CODES技術の設計、作製、および実装方法について十分に理解できるはずです。