Name: 粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶマイクロ流体CODES技術による粒子の多重検出とサイズ測定法。抵抗パルスセンシングとCDMAを組み合わせ、外部機器不要で電子的に粒子を追跡し、ポイントオブケア検査に適したポータブルデバイスを実現します。

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この研究は、National Science Foundation Award No.の支援を受けました。ECCS 1610995。著者らは、共有施設の使用に際し、Institute of Electronics and NanotechnologyおよびParker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscienceのスタッフに感謝します。著者はまた、原稿の準備に協力してくれたChia-Heng Chuに感謝したいと思います。

コーディング電極の1デザイン 注：図1aは、微細電極の3次元構造を示しています。 <ol><li>マイクロ流体チャネル23を符号化するための4つの7ビットのゴールドコードのセットを設計します。 <ol><li> 2つの線形フィードバックシフトレジスタ（LFSRに）、原始多項式を表す各を構築します。 </li><li> 7ビットメートルの -sequencesの好ましいペアを生成するためのLFSRを使用してください。 </li><li>周期的メートルの -sequencesの好ましい組をシフトし、4つの異なるゴールド符号を生成するためのmod 2でそれらを追加します。 </li></ol></li><li>コーディング電極（ 図1b）のレイアウトを設計します。 <ol><li> 3コーナーに正、負、および参照電極を表す、3電極端子を配置します。 </li><li>ルート正および負電極は、各マイクロ流体チャネルの両側にトレースします。 </li><li>正極および負極を拡張一意に割り当てられたゴールドコード（ 図1c）は、次の電極指のようなマイクロ流体チャネル、。 </li><li>正と負電極指との間に基準電極を配置します。 </li><li>コード領域の外側の電気伝導を最小限にするために、はるかに最も外側の参照電極指からの正負の電極トレースを置きます。 </li></ol></li></ol>表面電極の2微細加工 注：図2bは、表面電極の製造工程を示す図です。 <ol><li>ピラニア溶液で4インチホウケイ酸ガラスウェーハ清掃（98％硫酸：30％過酸化水素水= 5：1）20分間、全ての有機汚染物質を除去するために120℃。その後、残留水を除去するために20分間、200℃のホットプレート上にウエハを配置します。 </li><li>スピナーにウェハを転送します。ウェハ上に2 mLのネガ型フォトレジストを分配し、3の速度でウェハを回転、均一にコートする40秒1.5μmのフォトレジスト層を有するウェハ000 rpmで。 </li><li> 150℃のホットプレート上でウェーハを置き、1分間回転させ、フォトレジストを焼きます。 </li><li>マスクアライナを使用して、クロムマスクを介して365nmのUV光（225ミリジュール/ cm 2）でのフォトレジストを公開します。 </li><li> 100℃のホットプレート上にウエハを配置し、1分間露光されたフォトレジストを焼きます。 </li><li> 15秒のためのフォトレジスト現像液（RD6）にウェハを浸漬することによりフォトレジストを開発します。ゆっくり脱イオン（DI）水を噴霧し、ウェーハを洗浄します。圧縮窒素を吹き付けて乾燥しました。 </li><li>電子ビーム金属蒸発器にパターン化されたフォトレジストを有するウェハを置き、3×10 -6 Torrのベース圧力とでウエハ上に80nmの厚さの金膜に続いて厚さ20nmのクロム膜を堆積1 A / Sの堆積速度。 </li><li>部屋の気性で30分間、100％の振幅と周波数40kHzの超音波浴セット中のアセトンへの金属被覆されたウェハを浸し基本となるフォトレジストをエッチングし、リフトオフプロセスを完了するためにature。 </li><li>サイコロ従来のダイシングソーを使用して小片にウェハ。 </li></ol>マイクロ流体チャネルのためのSU-8鋳型の3製作 注：図2aは、マイクロ流体チャネル用モールドの製造工程を示す図です。 <ol><li>きれいにし、2.1に記載の同じ手順を使用して、4インチのシリコンウェハを焼きます。 </li><li>スピナーにウェハを転送します。ウェハ上に4 mLのフォトレジストを注ぎます。コートフォトレジストを有するウェーハ。 <ol><li> 15秒間500rpmでウエハをスピン。 </li><li> 15秒間1000rpmでウェハをスピン。 </li><li> 60秒が均一に被覆された15μmの厚さのフォトレジスト層を得るためにするために3000rpmでウェハを回転。 </li></ol></li><li>クリーンルームワイプアセトンに浸した上で、ウェハ面を配置し、裏面とウェハのエッジから残留フォトレジストを除去。 </li><li>ホットPL上にウェハを転送ソフトベーキングのために食べました。まず、1分間、65℃でウェーハを焼きます。その後すぐに95℃のホットプレートにウェハを移動し、2分間焼きます。 </li><li>マスクアライナを使用して、クロムマスクを介して365 nmのUV光（180ミリジュール/ cm 2）でのフォトレジストを露光します。 </li><li> 2分間、1分間、65℃で曝露した後、次いで95℃でウェハベーク。 </li><li>現像液中のウェハを浸し、軽く3分間の容器を振ります。その後、イソプロパノールアルコール（IPA）とのウェハを洗浄し、圧縮窒素を吹き付けて乾燥。白色の残留物がウェハ上に表示された場合は、再び開発者にそれを浸すと、より長い時間、乾燥のために開発しています。 </li><li>それを完全に乾燥させるために30分間、200℃のホットプレート上にウエハを焼きます。 </li><li>均一性を保証するために、ウェハ上の異なる場所でプロフィルメータを用いてパターニングされたフォトレジストの厚さを測定します。 </li><li>蒸着の技術を利用することにより、モールドウェーハSilanize。 TRの200μLを追加8時間のSU-8の金型ウエハと共に真空デシケーター中でペトリ皿や場所でichlorosilane。 </li></ol>マイクロ流体CODESデバイスの4組立<ol><li> 150 mmの直径ペトリ皿に金型と4インチのシリコンウェーハを配置し、その縁からテーピングすることによってそれを修正。 </li><li> 10の割合でポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーと架橋剤の混合：1、およびペトリ皿に混合物を50g注ぎます。 1時間脱ガスし、混合物を真空デシケーター中でペトリ皿に置き、その後、少なくとも4時間（ 図2A）を65℃のオーブンで硬化。 </li><li>メスを用いて硬化PDMS層を切り取り、ピンセットを用いたモールドウエハを、それをはがします。プルーフの原理装置の大きさは、約20mm×7 mmです。その後、生検パンチャーを使用して、マイクロ流体チャネルの入口と出口のためのPDMSを介して1.5ミリメートルの直径を有する穴をパンチ。 </li><li>私を置くことによって、PDMS部のパターン形成された側をきれいにしてくださいクリーンルーム粘着テープ上のトン。 </li><li>アセトン、IPA、脱イオン水ですすぐことによって表面電極を有するガラス基板を洗浄し、圧縮窒素を使用して乾燥させます。 </li><li>各部品の微細加工された側が100 mWのに設定されたRFプラズマ発生器内で上に向けて30秒間酸素プラズマ中のPDMSとガラス基板の表面を活性化させます。 </li><li>光学顕微鏡を用いてガラス基板上に表面電極を有するPDMSマイクロ流体チャネルを整列した後、物理的に接触する2つのプラズマ活性化表面をもたらします。 </li><li>ホットプレートに面したガラス側で、5分間、70℃のホットプレート上でデバイスを焼きます。 </li><li>半田付けすることにより、ワイヤと電極の接触パッドを接続します。 </li></ol>模擬生物学的サンプルの5準備<ol><li>培養RPMI 1640中HeyA8ヒト卵巣癌細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、5％CO 2雰囲気中37℃で彼らは、80％コンフルエンスに達するまで。 </li><li>ガラスピペットを用いて培養フラスコから培地を吸引します。分配した後、細胞を洗浄し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を吸引除去します。 </li><li>接着細胞を懸濁し、37℃で2分間（w / v）のトリプシン溶液2ml中の細胞を、0.05％をインキュベートします。その後、トリプシンを中和するために培養培地の4 mLを加え。 </li><li>遠心機で5分間、100×gで細胞懸濁液を試験管に細胞をペレット化します。その後、完全に上清を吸引除去します。 </li><li>穏やかにピペッティングすることによって、および機械的に解離細胞塊まで1-2 mLの1×PBSで細胞を再懸濁します。 </li><li>ピペットに細胞懸濁液の少量を描画し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li> 10 5〜10 6細胞/ mLの最終細胞濃度でサンプルを調製するためにPBSで細胞懸濁液を希釈します。 </li></ol> 6.マイクロ流体CODESデバイスを実行します 注：Fiを提供してグレ3に実験を示しています。 <ol><li>光学顕微鏡のステージ上にマイクロ流体CODESデバイスを配置します。 </li><li>電子ファンクション・ジェネレータを使用して、チップ上の基準電極400 kHzの正弦波を適用します。 </li><li>電圧信号は、それぞれの電流信号に変換するために、2つの独立したトランスインピーダンス増幅器に正および負の検知電極を接続します。 </li><li>バイポーラ信号を得るために、差動電圧増幅器を使用して、負の感知電極電圧信号から正の感知電極電圧信号を減算します。 </li><li>検証と特性解析の目的のために、デバイスの光学的に記録動作に高速度カメラを使用してください。 </li><li>シリンジポンプを用いて一定の流量（50〜1000μL/時間）マイクロ流体CODES装置を介して細胞懸濁液を駆動します。 </li><li>ロックインアンプを用いてインピーダンス変調信号を測定します。 <ol><li>参考文献を参照AC信号を接続しますロックインアンプのレンス入力。入力信号としてロックインアンプに差動バイポーラ信号を接続します。 </li><li>ロックインアンプの出力から差動信号のRMS振幅を取得します。 </li></ol></li><li>さらなる分析のためのデータ収集ボードを介してコンピュータに1メガヘルツの速度でのロックインアンプの出力信号をサンプリングします。 </li></ol>センサ信号の7処理<ol><li>後処理および復号化のためにMATLABに記録された電気データを転送します。 </li><li>高周波ノイズ（&gt; 2.5 kHzの）を除去するためにバターワースフィルタ（MATLAB組み込み関数）を使用して、デジタル領域で記録された信号をフィルタリングします。 </li><li>センサ信号からテンプレートコードライブラリを生成します。 <ol><li>デバイス内の各センサに対応する代表非重複コード信号を識別し、別々の波形ベクトルとしてデータセットから、これらの信号ブロックを抽出します。 </li><li>各テンプレートコード波形ベクトルを正規化その力によって。信号電力を測定するためにMATLAB組み込み関数（bandpower）を使用してください。 </li><li>デジタル的に電極上の細胞流速の変動に対応するために、継続時間を変えて正規化されたコード信号のバージョンを作成することにより、テンプレートライブラリを拡張するためにMATLAB関数（リサンプル）を使用してください。 </li></ol></li><li>フィルタリング波形：（SNR&gt; 12デシベル閾値）の活動をセンサに対応する信号ブロックを特定します。閾値下のSNRの波形はノイズとして扱われることになります。 </li><li>連続干渉除去に基づく反復アルゴリズム、一般的にマルチユーザCDMA通信ネットワーク24、25に使用される技術を使用して記録された信号のセンサ活性の個々のブロックを復号します。 <ol><li>スライディング内積を使用して、ライブラリ内のすべてのテンプレートで各信号ブロックの相互相関を計算します。 </li><li>ラーグを生成するテンプレートを識別するEST自己相関ピークが支配的な個々のセンサコード信号を決定します。自己相関ピークの時間と振幅の両方を記録します。 </li><li> （ステップ7.5.2で決定）は、測定自己相関ピークの振幅とタイミング情報に基づいて識別コードテンプレートをスケーリングすることによって推定センサーコード信号を構築します。 </li><li>元のデータから推定センサーコード信号を減算します。 </li><li>残差信号は、数学的には0.5未満である相関係数として定義され、テンプレートライブラリ内の任意の信号に似なくなるまで、7.5.1からの処理を繰り返します。 </li></ol></li><li>最適化プロセスを用いて、ステップ7.5からの初期のセンサ信号の推定を絞り込みます。 <ol><li>各反復から推定個々のセンサ信号を加算して信号を再構成します。 </li><li>記録された電気信号との最良適合を生成するために元の推定値の周りの個々のセンサ信号の振幅、持続時間およびタイミングをスイープ最小二乗に基づいて、26を近似。 </li></ol></li><li>光学像に対して電気信号を較正することにより、セルサイズに推定センサ信号の振幅を変換します。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

複数の抵抗パルスセンサが以前に、マイクロ流体チップ28、29、30、31、32に組み込まれています。これらのシステムでは、抵抗パルスセンサはどちら28、29、30、31、またはそれらは異なる周波数32で駆動されるように、個々のセンサを必要と多重化されていませんでした。両方の場合において、専用の外部接続は、チップ上の各抵抗脈拍センサのために必要とし、したがって、センサの多くは、より大きなハードウェアの複雑さなしに統合...

このような液体中に懸濁された細胞、細菌またはウイルスのような生物学的粒子の正確な検出および分析アプリケーション1、2、3の範囲のための非常に興味深いです。サイズがよくマッチ、マイクロ流体デバイスは、高感度、穏やかなサンプル操作とよく制御微小環境4、5、6、7、この目的のためのユニークな利点を提供します。さらに、マイクロ流体デバイスは、受動的に種々の性質8、9、10、11、12に基づいて、生物学的粒子の不均一な集団を分画するために流体力学とフォースフィールドの組み合わせを使用するように設計することができます。これらの装置ではS、得られた粒子分布は、読み出しとして使用することができるが、空間情報は、ラボのインフラストラクチャに結びつけることにより、マイクロ流体デバイスの実用性を制限する、唯一の顕微鏡を通して一般的にアクセス可能です。したがって、それらはマイクロ流体デバイス上で操作しているように容易に、粒子の時空間マッピングを報告することができる統合されたセンサーは、潜在的にモバイルでの試料の試験のために特に魅力的で低コスト、統合されたラボオンチップデバイスを有効にすることができます、リソースが制限された設定。 薄膜電極は、様々なアプリケーション13、14のためにマイクロ流体デバイスに統合されたセンサーとして使用されています。抵抗パルスセンシング（RPS）は、電気測定15から直接、堅牢敏感、およびハイスループット検出機構を提供していますように、マイクロ流体チャネル内の小さな粒子の統合センシングのために特に魅力的です。 RPSは、電解液中に浸漬一対の電極間のインピーダンスの変調は、粒子を検出するための手段として使用されます。粒子が開口部を通過するとき、粒子のオーダーの大きさ、数および電流の過渡パルスの振幅は、それぞれ、カウントおよびサイズ粒子に使用されます。また、センサの幾何学的形状は、感度16、17、18、19を強化するか、マイクロ流体チャネル20内の粒子の垂直位置を推定するために、抵抗パルス波形を整形するために、フォトリソグラフィの解像度を有するように設計することができます。 我々は最近、電気的検出（マイクロ流体CODES）21によってマイクロ流体符号化直交検出と呼ばれる拡張性とシンプルな多重抵抗パルスセンシング技術を導入しています。マイクロ流体コードはに依存しています抵抗パルスセンサの相互接続ネットワーク、多重化を可能にするために、それぞれ、一意の識別可能な方法で伝導を調節するために微細加工電極のアレイからなります。我々は、特に符号分割多元接続で使用されるデジタルコードに似て、直交電気信号を生成するために各センサを設計した22（CDMA）通信ネットワーク、個々の抵抗パルスセンサ信号は一意に単一の出力波形から回収することができるようにも信号の場合異なるセンサが干渉する。このように、我々の技術は、最小限に、デバイスに、両方のシステムレベルの複雑さを維持しながら、マイクロ流体チップ上の異なる位置での粒子のモニタリングを可能にする、1D電気信号への粒子の2次元空間情報を圧縮します。 本稿では、実験と計算マイクロ流体CODES技術を使用するために必要な方法と同様に、Rのための詳細なプロトコルを提示しますシミュレートされた生物学的試料の分析におけるその使用からepresentative結果。技術を説明するための例の4多重センサを有する試作装置の結果を使用して、我々は、（2）実験の説明を含むマイクロ流体CODES技術とマイクロ流体デバイスを作成するために、（1）微細加工プロセスのプロトコルを提供します、電子的、光学的、および流体ハードウェア、（3）異なるセンサからの干渉信号を復号するためのコンピュータアルゴリズム、および（4）の検出およびマイクロ流体チャネル中の癌細胞の分析からの結果。私たちは、ここで説明する詳細なプロトコルを使用して、他の研究者が自分の研究のために当社の技術を適用することができると信じています。

<table><tbody><tr><td>98%硫酸&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDHケミカルズ社</td><td>BDH3074-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>30%過酸化水素&nbsp;&nbsp;</td><td>BDHケミカルズ</td><td>社 BDH7690-3</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロシラン</td><td>アルドリッチ化学社</td><td>235725-100G</td><td></td></tr><tr><td>NR9-1500PY ネガ型フォトレジスト</td><td>フルテックス</td><td></td><td></td></tr>レジ<tr><td>スト現像液 RD6</td><td>フルテックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>BDHケミカルズ</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2015年型 ネガ型フォトレジスト</td><td>マイクロケム</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 現像液</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td> <td>ダウ コーニング</td><td>3097358-1004</td><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>BDH ケミカルズ</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>コーニング セルグロ</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>セラディム</td><td>1500-050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>アムレスコ</td><td>K952-100ML</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PHD 22/2000シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-2001</td><td></td></tr><tr><td>HF2LIロックインアンプ</td>チュー<td>リッヒ機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HF2TA電流増幅器</td>チュー<td>リッヒ機器</td>エ<td></td><td></td></tr><tr><td>クリプスTi-U顕微鏡</td><td>ニコン株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi2 高精細カラーカメラ&nbsp;</td><td>株式会社</td><td></td><td></td>ニコン</tr><tr><td>v7.3 ハイスピードカメラ</td><td>Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCIe-6361 データ収集ボード&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>781050-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2120シールド端子台</td><td>National Instruments</td><td>777960-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PX-250 プラズマ処理システム</td><td>ノードソン MARCH&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

生物学的サンプルのマイクロ流体処理は、典型的には、空間的に関心のある生物学的特性に基づいて、試料を分別するために、様々な力場下の浮遊粒子の微分操作を含みます。得られた空間分布は、アッセイの読み出しとして使用するために、マイクロ流体デバイスは、多くの場合、より高いコストおよび低減可搬性を有する複雑な機器を必要とする顕微鏡分析に供されます。この制限に対処するために、我々は、マイクロ流体チップ上の異なる位置での粒子の多重検出のための統合された電子センシング技術を開発しました。マイクロ流体CODESと呼ばれる私たちの技術は、1D電気信号に二次元空間情報を圧縮するために符号分割多元接続で抵抗パルスセンシングを兼ね備えています。本稿では、検出するためのマイクロ流体CODES技術の実用的なデモンストレーションを提示し、サイズ培養癌細胞は、複数のマイクロ流体チャネルにわたって分布します。として高速顕微鏡によって検証、当社の技術は、正確に外部機器を必要とせずに、すべての電子密度の高い細胞集団を分析することができます。このように、マイクロ流体CODESは、潜在的に生物学的サンプルのポイント・オブ・ケア検査するのに適している低コストの統合されたラボオンチップデバイスを有効にすることができます。

4マイクロ流体チャネルに分散4つのセンサから成るマイクロ流体CODES装置は図1bに示されています。 （1）複数のセルが並行して、電極を通過することができず、（2）細胞の感受性を増加させる電極に近いままであるように、このシステムでは、各マイクロ流体チャネルの断面は、セルの大きさに近くなるように設計されました。各センサは、ユニークな7ビットのデジタルコードを生成するように設計されています。デバイスは、その後、細胞懸濁液を用いて試験しました。 4個々のセンサに対応する記録電気信号は、図4の関連する理想的なデジタルコードで示されています。小さな偏差が存在しない一方で記録された信号は、密接に、理想的な矩形パルスと一致しています。このような偏差は、同一平面上の電極、異なる電極対の間の結合の球状の間に不平等電界を含むいくつかの要因の組み合わせに起因します細胞、ならびにマイクロ流体チャネル内の細胞の一定の流速。我々は、再符号化センサ信号に基づいて、テンプレートライブラリを作成しました。ライブラリ内のすべてのテンプレー...

我々は、複数のマイクロ流体チャネル中の粒子の検出及びサイズを多重化するために、符号分割多重アクセス（CDMA）を有する抵抗パルスセンシング（RPS）を組み合わせた統合表面電極ネットワークとマイクロ流体プラットフォームを示します。

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

この手順の全体的な目的は、抵抗パルスセンシングと符号分割多重接続を組み合わせ、複数のマイクロ流体チャネルにおける粒子の検出およびサイズ測定を多重化するマイクロ流体プラットフォームを実証することです。microfluidic CODESと名付けられたこの技術は、リソースが限られた環境での生物学的試料のポイントオブケア検査に適した、完全に統合され、真にポータブルなラボオンチップデバイスの実現に寄与します。この手法の主な利点は、マイクロ流体チップ上の粒子の空間的および時間的な操作を電子的に追跡できるため、顕微鏡のような外部機器が不要になることです。本技術はソフトリソグラフィーとの互換性があり、粒子を分画してコールターカウンターと同様の直接的な電子読み出しを行うマイクロフォトニックデバイスへ容易に統合することが可能です。マイクロ流体デバイスの作製を開始するには、まず4組の7ビットのゴールドコードを生成します。次に、AutoCADなどのコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを用いて、これらのゴールドコードに基づいた4種類の固有な電極レイアウトを設計します。最後に、設計した電極レイアウトに基づいたフォトマスクをフォトマスク業者に作製させます。次に、4インチのホウケイ酸ガラスウェハを、120 °Cで20分間、ピラニア溶液（5:1）に浸漬します。洗浄後、ウェハをホットプレートで200 °Cで20分間加熱し、残留水分を蒸発させます。洗浄し乾燥させたウェハをスピンコーターに設置します。ウェハにネガ型フォトレジスト溶液を2 milliliters滴下し、3000 revolutions per minuteで40 seconds間スピンコートします。スピンコート後のウェハをホットプレートにて150 degrees Celsiusで1 minute間乾燥させます。ウェハーを、所望の電極パターンのクロムマスクで覆います。マスクされたフォトレジスト表面に365 nanometerのUV光を照射し、225 millijoule per centimeter squaredに到達させます。その後、露光したフォトレジストをホットプレートを用いて100 degrees Celsiusで1分間ベークします。ウェハーをフォトレジスト現像液に15秒間浸し、その後、脱イオン水の緩やかなスプレーでパターンウェハーを洗浄し、窒素ガス流でウェハーを乾燥させます。次に、パターン形成後のウェハーを電子ビーム金属蒸着装置に設置します。1 Å/sの速度で、厚さ20 nmのクロム層と厚さ80 nmの金層をウェハー上に堆積させます。次に、金属コーティングしたウェーハをアセトン中で40 kHz、振幅100%で30分間超音波加熱し、下層のフォトレジストをエッチングします。ダイシングソーを使用して、必要に応じてウェーハを小さく切断します。マイクロ流路モールドの作製を開始するには、前述のホウケイ酸ガラスウェーハと同様の方法で、4インチシリコンウェーハを洗浄し、乾燥させます。シリコンウェハーをスピンコーターにセットし、ネガ型フォトレジスト溶液を4 mL塗布します。ウェハーを500 rpmで15秒間、次に1,000 rpmで15秒間、最後に3,000 rpmで60秒間スピンコートします。ウェハーをアセトンを浸したクリーンルームワイプの上に表面を上にして置き、ウェハーの裏面およびエッジから残留フォトレジストを除去します。ウェハーを65°Cで1分間、続いて95°Cで2分間ベイクします。乾燥させたウェハー上に、マイクロ流路用のクロムマスクパターンを配置します。フォトレジストに365 nmのUV光を180 mJ/cm²で露光し、その後、ウェハーを再び65°Cで1分間、および95°Cで2分間ベイクします。パターン形成したウェハーをフォトレジスト現像液を入れた容器に入れ、3分間緩やかに振盪させます。現像したウェハーをイソプロパノールで洗浄し、窒素ガス流で乾燥させます。ウェハーを200 °Cで30分間ベークした後、プロフィロメーターを用いて、パターン化したフォトレジストがウェハー全体にわたって均一な厚さであることを確認します。ウェハーを真空デシケーターに入れ、蓋のないペトリ皿に入れた200 µLのトリクロロシランと共に置きます。ウェハー表面をシラン化するため、トリクロロシランと共にデシケーター内で8時間静置します。デバイスの組み立てを開始するため、汎用クリーンルームテープを使用して、シリコンウェハーモールドを直径150 mmのペトリ皿に固定します。10対1の割合で混合したポリジメチルシロキサン前駆体を50 grams、ペトリ皿に加え、真空デシケーター内で1時間脱気します。脱気した混合物を65 °Cで少なくとも4時間硬化させます。メスを用いて硬化したPDMS層を切り出し、ピンセットでモールドから硬化層を剥がします。PDMSを小さく切り分ける。バイオプシーパンチャーを用いて、マイクロ流路の入口と出口の穴を開ける。マイクロ加工された表面を洗浄するため、PDMSレイヤーのパターン面を下にしてクリアルームテープに貼り付ける。あらかじめ準備した電極付きガラス基板を、アセトン、イソプロパノール、および脱イオン水で洗浄します。窒素ガス気流下で基板を乾燥させます。PDMS層と基板を、マイクロマシン面を上にして、100 milliwattsに設定したRFプラズマ発生装置に入れます。酸素プラズマを用いてマイクロマシンの表面を30秒間活性化させます。次に、光学顕微鏡を使用して、パターン化したPDMS層と表面電極の位置を合わせます。位置合わせが完了したら、表面同士を物理的に接触させ、PDMS層をガラス基板上に密封します。ガラス基板上のコーティング電極パターンを、PDMSマイクロ流路と正確に整合させることが極めて重要です。適切に整合されることで、粒子と表面電極との相互作用により、マルチプレクシングのための目的のコード波形が生成されます。組み立てたデバイスを、ガラス面を下にして70 °Cで5分間加熱してください。最後に、電極コンタクトパッドにワイヤをはんだ付けし、デバイスの組み立てを完了させます。実験を開始するには、マイクロ流体デバイスを光学顕微鏡のステージ上に配置します。デバイスのリファレンス電極をロックインアンプの信号出力ポートに接続し、400 kilohertzの正弦波を印加します。正および負のセンサー電極を、2つの独立したトランスインピーダンスアンプに接続します。両方のトランスインピーダンスアンプをロックインアンプの差動電圧入力に接続し、正のセンサー信号が負のセンサー信号から差し引かれるようにします。ロックインアンプの復調器出力をデータ収集ユニットに接続します。データ収集ソフトウェアで、ロックインアンプ出力のサンプリングレートを1 Megahertzに設定します。顕微鏡下でのデバイスの動作を光学的に記録するため、高速カメラをセットアップします。準備した細胞懸濁液をシリンジに吸い込みます。サンプルシリンジをシリンジポンプに固定し、シリンジを導入チャネルに接続します。流出チャネルを廃棄容器に向けます。シリンジポンプを使用して、インピーダンス変調信号を記録しながら、一定の流量で細胞懸濁液をデバイスに流します。実験完了後、解析ソフトウェアを用いて電気データを処理します。処理された電気信号を高速度カメラの画像と比較し、細胞サイズの校正曲線を作成します。直交センサコードから導出された4つの固有の電極パターンを持つマイクロ流体センサデバイスに、細胞懸濁液を流しました。4つすべてのセンサー信号は、単一の電気出力から記録されました。記録された各信号に対応する個々のセンサーは、記録されたセンサー信号とあらゆる可能なコードとの相関によって特定されました。これにより、明確に区別可能な自己相関ピークが得られました。4つの全チャネルで細胞が同時に検出された際に生じる干渉信号による波形は、反復アルゴリズムを用いて分離されました。記録された波形をすべての可能なコードと相関させ、最大の自己相関ピークを特定した。対応する個々のセンサー信号を再構成し、それを入力波形から差し引いた。得られた残留信号を次のイテレーションへの入力として渡し、残留信号に自己相関ピークが現れなくなるまでこのプロセスを繰り返した。推定された信号は、最小二乗近似を用いて、再構成された波形と元に記録された波形の間の最良の適合性を求める最適化アルゴリズムに基づいて精緻化されました。その後、推定されたセンサー信号のチャンネル番号、振幅、持続時間、および相対的なタイミングから、細胞の位置、サイズ、およびセンサーを通過するまでの時間が決定されました。この手順は、電気信号を高速カメラによる光学的な測定結果と比較することで検証されました。この手法は一度習得すれば、ハードウェアの観点から非常にシンプルであるため、実装が極めて容易です。チップ上のアクティブコンポーネントを必要とせず、ソフトリソグラフィーと直接的に互換性があり、信号処理は単純な計算アルゴリズムに基づいています。本プロトコルに従うことで、コードベースのマルチプレックス電気センサーを備えたマイクロ流体チップを作製し、バイオ分析測定のための電気信号をデコードすることができます。この汎用性と拡張性に優れた電子センシング技術は、さまざまなマイクロ流体デバイスに容易に統合でき、チップ上で処理される粒子を時空間的に追跡することで定量的なアッセイを実現します。このビデオを視聴することで、マイクロ流体CODES技術の設計、作製、および実装方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。...

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個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ 

学ぶマイクロ流体CODES技術による粒子の多重検出とサイズ測定法。抵抗パルスセンシングとCDMAを組み合わせ、外部機器不要で電子的に粒子を追跡し、ポイントオブケア検査に適したポータブルデバイスを実現します。

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

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