粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、抵抗パルスセンシングとコード分割マルチアクセスを組み合わせて、複数のマイクロ流体チャネル内の粒子の検出とサイジングを多重化するマイクロ流体プラットフォームを実証することです。マイクロ流体CODESと名付けられたこの技術は、リソースが限られている環境での生物学的サンプルのポイントオブケアテストに適した、完全に統合され、真にポータブルなラボウェアチップデバイスを実現するのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイクロ流体チップ上の粒子の空間的、時間的な操作を電子的に追跡できるため、顕微鏡などの外部機器が不要になることです。

当社の技術はソフトリソグラフィーと互換性があり、粒子が分画されるマイクロフォトティックデバイスに簡単に統合して、コールターカウンターと同様の直接電子読み出しを提供できます。マイクロ流体デバイスの構築を開始するには、4つの7ビットゴールドコードのセットを生成します。次に、コンピューター支援設計、またはAutoCADなどのCADソフトウェアを使用して、ゴールドコードに基づいて4つの独自の電極レイアウトを設計します。

最後に、Photomaskの供給業者によって製造された設計されていた電極レイアウトでPhotomaskedを持って下さい。次に、4インチのホウケイ酸ガラスウェーハを摂氏120度の5対1のピラニア溶液に20分間浸します。洗浄後、ホットプレート上でウェーハを200°Cで20分間加熱し、残留水分を蒸発させます。

清潔で乾燥したウェーハをスピンコーターに入れます。ウェーハに2ミリリットルのネガ型フォトレジスト溶液を塗布し、毎分3000回転で40秒間スピンコートします。スピンコーティングされたウェーハを150°Cのホットプレートで1分間乾燥させます。

ウェーハを目的の電極パターンのクロームマスクで覆います。マスクされたフォトレジスト表面を365ナノメートルのUV光にさらして、225ミリジュール/センチメートルの正方形を達成します。露光したフォトレジストを100°Cのホットプレートで1分間焼きます。

ウェーハをフォトレジスト現像液に15秒間浸漬し、パターンウェーハを脱イオン水の穏やかなスプレーで洗浄し、窒素ガスの流れの下でウェーハを乾燥させます。次に、パターン化されたウェーハを電子ビーム金属蒸着器に入れます。厚さ20ナノメートルのクロム層と厚さ80ナノメートルの金層を、1秒あたり1オングストロームの速度でウェーハに堆積します。

次に、金属被覆ウェーハをアセトンで40キロヘルツ、100%の振幅で30分間超音波加熱することにより、下にあるフォトレジストをエッチングします。必要に応じて、ダイシングソーを使用してウェーハを小さくカットします。マイクロ流体チャネルモールドの製造を開始するには、前述のホウケイ酸ウェーハと同じ方法で4インチのシリコンウェーハを洗浄して乾燥させます。

シリコンウェーハをスピンコーターにセットし、4ミリリットルのネガ型フォトレジスト溶液を塗布します。ウェーハを500rpmで15秒間スピンコーティングし、次に1, 000rpmで15秒間、最後に3, 000rpmで60秒間スピンコーティングします。ウェーハを上向きにして、アセトンを染み込ませたクリーンルームワイプにセットして、ウェーハの背面と端から残留フォトレジストを取り除きます。

ウェーハを摂氏65度で1分間焼き、次に摂氏95度で2分間焼きます。ドライウェーハ上のマイクロ流体チャネルのクロームマスクパターンを配置します。フォトレジストを180ミリジュール/センチメートル四方で365ナノメートルのUV光にさらし、次にウェーハを摂氏65度と95度でそれぞれ1分間と2分間焼きます。

パターン化されたウェーハをフォトレジスト現像液の容器に入れ、容器を3分間静かに振とうします。開発したウェーハをイソプロパノールですすぎ、窒素ガスの流れでウェーハを乾燥させます。ウェーハを摂氏200度で30分間焼き、プロファイラー(表面形状測定機)を使用して、パターンフォトレジストがウェーハ全体で均一に厚いことを確認します。

ウェーハを真空デシケーターに入れ、蓋のないペトリ皿に200マイクロリットルのトリクロロシランを入れます。ウェーハをトリクロロシランと一緒にデシケーターに8時間置いて、ウェーハ表面をシレン化します。組み立ては、汎用のクリーンルーム用テープで、直径150mmのシャーレにシリコンウェーハモールドを貼り付けます。

ポリジメチルシロキサンプレポリマーの10対1の混合物50グラムをペトリ皿に加え、真空デシケーターで1時間脱気します。脱気した混合物を摂氏65度で少なくとも4時間硬化させます。メスを使って硬化したPDMS層を切り取り、ピンセットで硬化した層を型から剥がします。

PDMSを細かく切ります。インレットとアウトレットのマイクロ流体チャネルの穴をバイオプシーパンチャーで開けます。PDMSレイヤーパターンを下向きにして透明な部屋のテープに置き、マイクロマシニングされた表面を清掃します。

事前に準備した電極ベアリングガラス基板をアセトン、イソプロパノール、および脱イオン水ですすいでください。窒素ガスの流れの下で基板を乾燥させます。PDMS層と基板を、マイクロマシンの側面を上にして100ミリワットに設定されたRFプラズマ発生器に配置します。

酸素プラズマ中のマイクロマシン表面を30秒間活性化します。次に、光学顕微鏡を使用して、パターンPDMS層を表面電極に位置合わせします。位置合わせが完了したら、表面を物理的に接触させて、PDMS層をガラス基板にシールします。

ガラス基板上のコーティング電極パターンがPDMSマイクロ流体チャネルと適切に位置合わせされていることが重要です。適切に位置合わせされると、表面電極との粒子の相互作用により、多重化に必要なコード波形が生成されます。組み立てたデバイスを70°Cでガラス面を下にして5分間焼きます。

最後に、電極接点パッドにワイヤをはんだ付けして、デバイスの組み立てを完了します。実験を開始するには、マイクロ流体デバイスを光学顕微鏡ステージに置きます。デバイス参照電極をロックインアンプの信号出力ポートに接続し、400キロヘルツの正弦波を印加します。

正と負のセンサー電極を2つの独立したトランスインピーダンスアンプに接続します。両方のトランスインピーダンスアンプをロックインアンプの差動電圧入力に接続し、正のセンサー信号を負のセンサー信号から差し引きます。ロックインアンプの復調器出力をデータ集録ユニットに接続します。

データ集録ソフトウェアで、ロックインアンプ出力のサンプリングレートを1メガヘルツに設定します。顕微鏡で見たデバイスの動作を光学的に記録するために、高速度カメラをセットアップします。調製した細胞懸濁液をシリンジに引き込みます。

サンプルシリンジをシリンジポンプに固定し、シリンジをインレットチャネルに接続します。出口チャネルを廃棄物容器に向けます。シリンジポンプを使用して、インピーダンス変調信号を記録しながら、一定の流量でセル懸濁液をデバイス内で駆動します。

実験終了後、解析ソフトウェアで電気データを処理します。処理された電気信号を高速度カメラからの画像と比較して、セルサイズの検量線を作成します。細胞懸濁液は、直交するセンサーコードから導き出された4つのユニークな電極パターンを持つマイクロ流体センサーデバイスを介して流れました。

4つのセンサー信号はすべて、1つの電気出力から記録されました。記録された各信号に関連付けられた個々のセンサーは、記録されたセンサー信号とすべての可能なコードとの相関によって識別され、明確に識別可能な自己相関ピークが生成されました。4つのチャネルすべてのセルを同時に検出することで干渉信号によって生成される波形は、反復アルゴリズムで解決されました。

記録された波形は、考えられるすべてのコードと相関し、最大の自己相関ピークが特定されました。対応する個々のセンサー信号が再構成され、入力波形から減算されました。残差シグナルは入力として次の反復に渡され、残差シグナルが自己相関ピークを生成しなくなるまでプロセスが続けられました。

推定された信号は、最小二乗近似を使用して、再構成された波形と元の記録された波形との間の最適な適合を求める最適化アルゴリズムに基づいて精緻化されました。次に、セルの位置、サイズ、およびセンサーを通過する時間は、推定されたセンサー信号のチャンネル番号、振幅、持続時間、および相対タイミングから決定されました。この手順は、電気信号と高速度カメラからの光学測定値を比較することによって検証されました。

この手法を習得すると、ハードウェアの観点からは非常に単純なため、実装は非常に簡単です。アクティブなオンチップ部品はありません。ソフトリソグラフィーと直接互換性があり、信号処理は単純な計算アルゴリズムに依存しています。

このプロトコルに従って、コードベースのマルチプレックス電気センサーを備えたマイクロ流体チップを作製し、バイオ分析測定用の電気信号をデコードできます。この汎用性と拡張性に優れた電子センシング技術は、さまざまなマイクロ流体デバイスに容易に統合でき、チップ上で処理された粒子を空間的に時間的に追跡することで定量的なアッセイを実現できます。このビデオを見た後、マイクロ流体CODESテクノロジーを設計、製造、および実装する方法を十分に理解しているはずです。