June 16th, 2016
ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。
このプロトコルの全体的な目標は、高効率のシングルセル分離と培養を可能にするマイクロ流体チップの製造と操作を実証することです。この方法は、シングルセルの単離と培養の恩恵を受けるあらゆる領域に有用なツールを提供します。この手法の主な利点は、単一細胞を大きなマイクロウェルアレイにロードするのに非常に効率的であることです。
さらに、穏やかな流れと重力のみを使用してデバイスを動作させるため、セルの損傷が最小限に抑えられます。この技術の意味するところは、細胞の不均一性が細胞の応答に影響を与える癌などのヒト疾患の最終診断に向けられているため、限界希釈法は非常に時間がかかり、非効率的であったため、マイクロウェル細胞株を確立する際にこの方法を開発するというアイデアを思いつきました。現在、この方法により、個々の細胞解析に関する洞察を得ることができます。
また、個々の細胞の経過や挙動の観察の確立や時間性など、他のアプリケーションにも適用できます。まず、付属のテキストプロトコルに記載されている標準的なフォトリソグラフィーを使用して、シングルセル単離層とマイクロウェル培養層の両方に対してシラン化マスターモールドを作製します。マスターモールドごとに、16グラムのPDMSベースと1.6グラムの硬化剤を使い捨てカップに組み合わせ、混合物が混ざるまで攪拌します。
次に、マスターモールドを150mmのシャーレに入れ、モールドの上にPDMSを注ぎます。ペトリ皿をデシケーターに入れ、真空を1時間かけてPDMSから気泡を取り除きます。1時間後、デシケーターから皿を取り出し、摂氏65度の従来のオーブンに3〜6時間置いてPDMSを硬化させます。
次に、オーブンから皿を取り出し、室温まで冷まします。冷めたら、硬化させたPDMSキャプチャーウェルアレイとマイクロウェル培養アレイをマスターモールドから剥がし、カミソリの刃でデバイスを切り取ります。次に、0.75ミリメートルのパンチを使用して、キャプチャウェルアレイ層のマイクロチャネルの両端に1つの穴を作成します。
テープを使用してデバイスの内面になる部分をクリーニングし、次に内面を上にして個々の層をプラズマクリーナーに配置して、短時間の酸素プラズマ処理を行います。終了したら、プラズマクリーナーからPDMS層を取り外し、実体顕微鏡を使用してデバイスの上部と下部の層を位置合わせして接続します。位置合わせしたデバイスを摂氏65度のオーブンに24時間置き、PDMSレイヤー間に恒久的な結合を作成します。
次に、接着したPDMSデバイスを脱イオン水に入れ、容器を真空下のデシケーターに15分間置いて、デバイスのマイクロチャネルから空気を取り除きます。デバイスからすべての空気を取り除いたら、PDMSデバイスを組織培養フードに入れ、UV光を使用してデバイスの表面を30分間滅菌します。次に、デバイス内の脱イオン水をPBS中の5%ウシ血清アルブミンと交換し、デバイスを摂氏37度で30分間インキュベートします。
これにより、表面がブロックされ、捕捉ウェルから培養ウェルへの単離された細胞の移動効率が向上します。30分後、デバイス内のブロッキング溶液を滅菌PBSと交換します。ミリリットルあたり250万個の細胞を含む単一細胞懸濁液を調製し、50マイクロリットルの懸濁液をピペットにロードします。
次に、セルをデバイスの出口穴からデバイスに移します。さらに50マイクロリットルの細胞懸濁液をロードし、入口穴からデバイスに移して、マイクロチャネル全体を細胞で均一に満たします。ロードされたら、直径1ミリメートルのナイロン製釣り糸で作られた滅菌プラグを使用して、デバイスの出口穴を密閉します。
次に、1ミリリットルの滅菌シリンジに培地を充填し、残留気泡を排出してシリンジポンプにセットします。23ゲージの鈍い針をシリンジに接続し、ポリテトラフルオロエチレンチューブを使用して針をデバイスの入口に接続します。チューブを接続した後、プラグを出口穴から取り外し、細胞が重力によって単一細胞捕捉ウェルに落ち着くまで2分間待ちます。
次に、シリンジポンプを毎分600マイクロリットルに設定します。コンセントプラグを取り外し、捕捉されていない細胞を30秒間洗い流します。圧力が安定するまで2分待ちます。
次に、デバイスの入口からチューブを取り外し、入口と出口の両方の穴をプラグで密閉して、閉じた培養システムを形成します。次に、デバイスを手で裏返して、捕捉した単一細胞をデバイスの反対側にある培養マイクロウェルに移します。次に、デバイスを100ミリメートルの組織培養皿に入れ、デバイスの周りに滅菌したPBSを10ミリリットル加え、皿をインキュベーターに入れます。
培地を交換するには、まず、マイクロチャネルに気泡が入らないように、PDMSデバイスの入口と出口の近くに培地の2つの液滴を置きます。次に、0.75 mm の生検パンチャーを使用して、PDMS デバイスの上部からマイクロチャネルの端付近に 2 つの穴を開けます。デバイスの最上層のみを打ち抜くようにしてください。
次に、温めた新しい培地が入った1ミリリットルのプラスチックシリンジに充填し、23ゲージの鈍針とPTFEチューブを使用して、新しく作成したインレットポートに接続します。約120マイクロリットルの新鮮な培地を5分かけてゆっくりと装置に流し込み、古い培地を交換します。終了したら、2つのプラグを使用して入口ポートと出口ポートを密閉し、デバイスを細胞培養インキュベーターに戻します。
キャプチャーウェルにたどり着く細胞の数は、細胞の種類に応じて約68%から85%の範囲です。さらに、ほとんどのキャプチャーウェルには、3つの細胞タイプすべてについて、1つの細胞しか含まれていません。捕捉したKT98細胞を培養ウェルに移した後、ウェルの約77%に細胞が1つしかなく、16%に細胞がなく、6%に細胞が2つあり、ウェルの1%未満が3つ以上の細胞を持っていました。
7日間にわたって、単離された単一細胞は不均一な増殖パターンを示しました。一部の細胞は増殖しましたが、他の細胞は増殖しませんでした。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約20分で完了します。
このビデオを見れば、このハイスループットシングルセル単離内分泌培養プラットフォームを使用して、シングルセル実験の生産性を向上させる方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、気泡がマイクロチャネルに入るのを防ぎ、時間が経つにつれて細胞が凝集するのを防ぐことを覚えておくことが重要です。
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このプロトコルは、高効率の単一細胞の分離と培養のために設計されたマイクロ流体チップの製造と操作を実証します。これは、穏やかな流れと重力を利用することで細胞損傷を最小限に抑えます。
This microfluidic platform addresses a critical bottleneck in single-cell analysis by enabling high-efficiency isolation and long-term culture without compromising cell viability. By reducing reliance on labor-intensive limit dilution methods, it accelerates hypothesis testing in target validation and phenotypic screening workflows. The system supports mechanistic de-risking through clonal expansion and heterogeneity assessment, directly informing go/no-go decisions in early discovery.
The platform integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of clonal cells for target engagement and phenotypic assays, bridging isolation to functional validation.