ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

本プロトコルの総合的な目的は、高効率な単一細胞の分離および培養を可能にするマイクロ流体チップの作製と動作を実証することです。この手法は、単一細胞の分離と培養が有用なあらゆる分野において有用なツールとなります。本技術の主な利点は、大規模なマイクロウェルアレイに単一細胞を高効率にロードできることです。

さらに、本装置の操作には緩やかな流れと重力のみが利用されるため、細胞へのダメージを最小限に抑えることができます。この手法の意義は、細胞の不均一性が細胞応答に影響を及ぼす癌などのヒト疾患の最終診断に向けられています。限界希釈法は非常に時間がかかり効率が悪かったため、マイクロウェル細胞株を構築していた際に、本手法を開発するというアイデアに至りました。現在、この手法は個々の細胞解析に知見を提供することが可能です。

また、個々の細胞の経過や挙動の確立および経時的な観察など、他のアプリケーションにも適用可能です。まず、付属のテキストプロトコルに記載されている標準的なフォトリソグラフィを用いて、単一細胞分離層とマイクロウェル培養層の両方のためのシラン化マスターモールドを作製します。各マスターモールドについて、使い捨てカップに16 gのPDMSベースと1.6 gの硬化剤を合わせ、混合物が均一になるまで撹拌します。

次に、マスターモールドを150 millimeterのペトリ皿に入れ、モールドの上にPDMSを流し込みます。ペトリ皿をデシケーターに入れ、真空状態にして1時間置き、PDMSから気泡を除去します。1時間後、皿をデシケーターから取り出し、65 degrees Celsiusに設定した一般的なオーブンで3〜6時間加熱してPDMSを硬化させます。

次に、ディッシュをオーブンから取り出し、室温まで冷却します。冷却後、硬化したPDMSキャプチャーウェルアレイおよびマイクロウェル培養アレイをマスターモールドから剥がし、カミソリ刃を用いてデバイスを切り出します。続いて、0.75 millimeterパンチを使用して、キャプチャーウェルアレイ層のマイクロチャネルの両端に穴を1つずつ作成します。

テープを用いてデバイスの内面となる部分を清掃し、その後、内面を上に向けて各層をプラズマクリーナーに入れ、短時間の酸素プラズマ処理を行います。処理が完了したら、PDMS層をプラズマクリーナーから取り出し、実体顕微鏡を用いてデバイスの上層と下層の位置合わせと接合を行います。位置合わせをしたデバイスを65 °Cのオーブンに24時間置き、PDMS層間に恒久的な結合を形成させます。

次に、接合したPDMSデバイスを脱イオン水に入れ、容器をデシケーターに入れて15分間真空状態にし、デバイスのマイクロチャネル内から空気を除去します。デバイス内の空気がすべて除去されたら、PDMSデバイスを組織培養フード内に置き、UVライトを用いてデバイスの表面を30分間滅菌します。続いて、デバイス内の脱イオン水をPBSで調製した5%牛血清アルブミンに置換し、デバイスを37°Cで30分間インキュベートします。

これにより表面がブロッキングされ、キャプチャウェルから培養ウェルへの単離細胞の移行効率が向上します。30分後、デバイス内のブロッキング溶液を滅菌済みPBSに置換します。1 mLあたり250万個の細胞を含む単細胞懸濁液を調製し、ピペットに50 µLの懸濁液をロードします。

次に、デバイスの出口穴を通じて細胞をデバイス内に移します。さらに50 µLの細胞懸濁液をロードし、入口穴からデバイス内に移して、マイクロチャネル全体に細胞を均一に充填します。ロード後、直径1 mmのナイロン製釣り糸で作った滅菌プラグを使用して、デバイスの出口穴を密封します。

次に、1 mLの滅菌シリンジに培地を満たし、残っている気泡を排出した後、シリンジポンプにセットします。シリンジに23ゲージの鈍針を装着し、ポリテトラフルオロエチレンチューブを用いて針をデバイスの入口に接続します。チューブの接続後、出口のプラグを取り外し、重力によって細胞が単一細胞キャプチャーウェルに沈降するまで2分間待ちます。

次に、シリンジポンプを600 µL/minに設定します。出口プラグを取り外し、捕捉されなかった細胞を30秒間洗い流します。圧力が安定するまで2分間待ちます。

次に、デバイスの入口からチューブを取り外し、入口と出口の両方の穴をプラグで封止して、密閉培養システムを形成します。ここで、デバイスを手で反転させ、捕捉した単一細胞をデバイスの反対側にある培養マイクロウェルに移動させます。その後、デバイスを100 millimeterの組織培養皿に入れ、デバイスの周囲に10 millilitersの滅菌PBSを加え、皿をインキュベーターに入れます。

培養液を交換するには、まずマイクロチャネル内に気泡が混入するのを防ぐため、PDMSデバイス上部の入口および出口付近に培養液を2滴ずつ滴下します。次に、0.75 millimeterの生検パンチを使用して、マイクロチャネルの両端付近からPDMSデバイスの上部に向かって2か所の穴を開けます。このとき、デバイスの最上層のみをパンチするように注意してください。

次に、あらかじめ温めておいた新鮮な培地を1 mLのプラスチック製シリンジに満たし、23ゲージの鈍針とPTFEチューブを用いて、新しく作成した入口ポートに接続します。5分間かけて約120 µLの新鮮な培地をデバイス内にゆっくりと流し、古い培地を置換します。完了後、入口と出口のポートを2つのプラグで封止し、デバイスを細胞培養インキュベーターに戻します。

キャプチャーウェルに回収される細胞の割合は、細胞の種類によって約68%から85%の範囲にあります。また、3種類すべての細胞において、ほとんどのキャプチャーウェルには単一の細胞のみが含まれていました。回収したKT98細胞を培養ウェルに移送した後、ウェルの約77%に単一の細胞が含まれ、16%に細胞が含まれず、6%に2個の細胞が含まれ、3個以上の細胞が含まれていたウェルは1%未満でした。

7日間にわたり、単離された単一細胞は不均一な増殖パターンを示しました。一部の細胞は増殖しましたが、そうでない細胞もありました。この手法を習得し、適切に実施すれば、約20分で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、このハイスループット単一細胞分離内分泌培養プラットフォームを使用して、単一細胞実験の生産性を向上させる方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、マイクロチャネルに気泡が入らないようにすること、および時間の経過とともに細胞が凝集するのを防ぐことが重要です。