Name: 実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶ、細菌プラスミドからDNA鎖置換ゲートを抽出し蛍光動態測定で評価する手法。高純度DNA源を活用し、分子プログラミングや合成生物学における堅牢なゲート設計に応用可能です。

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図1、2、3、4、6、8及び表2、3、10、15、16は、参考文献29から変更されています。この作品は、国立科学財団（NSF-GSにCCF 1117143およびNSF-CCF 1162141を付与する）によってサポートされていました。 Y.-JCは、台湾政府のフェローシップによってサポートされていました。 SDRは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム（GRFP）によってサポートされていました。

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
<li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+production+of+%27monoclonal+stoichiometric%27+single-stranded+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li>
<li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
<li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li>
<li>Érdi, P., Tóth, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%89rdi%2C+P+%22Mathematical+models+of+chemical+reactions%3A+theory+and+applications+of+deterministic+and+stochastic+models%22">Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models</a>. , Manchester University Press. (1989).</li>
<li>Magnasco, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+kinetics+is+Turing+universal%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemical kinetics is Turing universal.</a> Phys. Rev. Lett. 78, 1190(1997).</li>
<li>Oishi, K., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+implementation+of+linear+I%2FO+systems%5BTitle%5D)+AND+%22IET+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular implementation of linear I/O systems.</a> IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).</li>
<li>Senum, P., Riedel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-independent+constructs+for+chemical+computation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rate-independent constructs for chemical computation.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+with+finite+stochastic+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Computation with finite stochastic chemical reaction networks.</a> Natural Computing. 7, 615-633 (2008).</li>
<li>Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+universal+substrate+for+chemical+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA as a universal substrate for chemical kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).</li>
<li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniffers%2C+buzzers%2C+toggles+and+blinkers%3A+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li>
<li>Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-domain+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Math.+Struct.+Comput.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-domain DNA strand displacement.</a> Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).</li>
<li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Distrib.+Comput%22%5BJournal%5D)">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li>
<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
<li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li>
<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

本論文では、高純度のプラスミドDNAからndsDNAゲートを導出するための方法を説明します。また、プロトコルは、蛍光動力学アッセイを用いて、ゲート性能を特徴付けるために提示されています。実験データは、プラスミド由来の系、合成系は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて精製したストランドから組み立てられていても、その合成対応物よりも優れていることを示しています。多分、プラスミド由来のゲートの性能の改善は、主に生物学的DNAの非常に高純度に起因するものです。合成DNAは、さまざまなエラーが含まれ、特に、長さN-1のオリゴヌクレオチド、およびそのような副生成物を生じる欠失は、典型的には、完全PAGEまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）精製手順で除去されません。ここで報告されたものと同様の改善はまた、生物学的供給源21に由来するDNAを使用した触媒ヘアピン増幅器の以前の研究で観察されました。 <p clお尻= &quot;jove_content&quot;&gt;しかし、プラスミド由来のゲートを用いても、完全に少なくとも2つの理由がありますするためのゲート性能のエラー、排除することはできません。あまりにも多くてゲートにつながることができ、最初の過消化またはカット精度の欠如を間違った位置にニックまたはニック。いずれの場合においても、ゲートが望ましくない反応に関与する可能性が高いです。このような問題は、（ 図4を参照）を使用する酵素の量を最適化することにより緩和することができます。第二に、これらの実験では、ほとんどの入力および補助鎖合成DNAであり、したがって、欠失および変異を含みました。原則として、すべての一本鎖入力と補助鎖はまた、事前符号化M13ウイルスゲノム26のニッキング酵素消化を介してファージミドDNAから得ることができます。おそらく回路性能は、さらに、細菌ゲノムに由来​​する一本鎖DNAを用いて改善することができます。 プラスミド由来のゲートの使用は、回路性能を改善することが見出されたが、分析コストや処理時間のプラスミド由来のゲートの製造がやや安い（ 表15）であるが、それは商業的に合成されたオリゴ（ 表16）からゲートのアセンブリおよび精製に比べて2~3倍長い処理時間を要することが明らかになりました。プラスミド由来のゲートの主要コストは、遺伝子合成、制限酵素の使用です。 （30 nmで15の反応のために十分な）ゲートの300ピコモルのために、参加ゲートの推定コストはフォークゲート、違いによるニッキング酵素の使用にいるコストの差は約$ 170と$ 200です。これとは対照的に、PAGE精製料込み$ 260の周りに同じゲー​​ト費用鎖の化学合成。プラスミド由来のゲートのための主要な時間コストは、単にDNA合成と同様に、遺伝子合成会社に委託することができ、クローニング手順、です。しかし、一旦組み立て、プラスミド由来のゲートは、宿主プラスミドを容易に複製することができるという利点を有しますND細菌のグリセロールストックの形で保存することができます。これは、上にゲートを何度も再利用することができます。 楽しみにして、プラスミド由来のゲートの改良された性能を実験的にDNA CRNsで、これまでに実証されているよりも、力学挙動のはるかに大きな範囲を可能にすることができます。例えば、最近の理論的研究47,48は、マクロスケールでの自己組織化の空間パターンは、反応拡散機構を介してDNA CRNsで実現することができることを示唆しました。ここで紹介する方法は、自己パターニングDNA材料の基礎となる分子成分を構築するための実行可能なパスを提供します。挑戦が、プログラム可能な方法で、マクロスケールの形態を開発するバイオマテリアルの研究から再生医療に至るまでの分野で重要な意味を持っているでしょう。

ワトソン-クリック塩基対の予測可能性は、動的なDNAのナノテクノロジーは、動的特性1,2と分子デバイスを設計するためのプログラム可能な方法として出現することができました。特に、DNA鎖置換 - プログラム可能な、競合ハイブリダイゼーション反応は - 動的DNAシステムを操作するための強力な機構であることが判明しました。 DNAの鎖置換反応では、入ってくるオリゴヌクレオチドは、相補的結合パートナーか​​らの以前に結合した「出力」鎖を置換します。複数のそのような反応は、個々の反応3ステップの順序やタイミングを制御度の高い多段階反応カスケードに一緒に連鎖させることができます。 DNA鎖変位カスケードは4-7、切り替え可能なナノ構造体8-10、自律分子モーター11-15、および非共有結合触媒アンプ13,16-21デジタルとアナログの分子回路を生成するために使用されています。また、D鎖置換反応を用いてNAデバイスをシミュレートし、コンピュータ支援設計ソフトウェア22-24を使用して 、多様な用途のために設計することができます。 現在、化学的に合成されたDNAは、DNAナノテクノロジーのための主材料として機能します。しかし、DNA合成プロセスにおけるエラー、そして得られた不完全なオリゴヌクレオチドは、誤った副反応を引き起こすことにより、動的DNAデバイスの性能を制限すると考えられています。例えば、「リーク」反応も反応トリガーの非存在下での出力オリゴヌクレオチドの放出をもたらすことができます。このような効果は、最初のリークであっても最小限の量は、最終的にカスケード19,20の完全な活性化につながる自己触媒反応のカスケードに最も明白です。一部のコンポーネントが意図した入力7,25の存在下でさえも誘発しないので逆に、反応はしばしば活性化の期待されるレベルに到達することができません。 DNAベースの性能を作成するにはそれらの生物学的なタンパク質ベースの対応物に匹敵するナノデバイスは、エラーモードが劇的に低減する必要があります。 細菌プラスミドまたは他の生物学的DNAは、ナノテクノロジーのアプリケーションのための高純度のDNAの比較的安価な供給源として働く可能性があります。 DNAの大量の細菌中で複製することにより生成することができ、生物系の固有の校正能力は、得られたDNAの純度を確保します。実際には、いくつかの最近の論文は、ナノテクノロジーのアプリケーション21,26-28のための生物学的DNAの潜在的な有用性を認識しています。しかしながら、プラスミドDNAの完全に二本鎖の性質は、これまで一般的に複数のオリゴヌクレオチドからなり、二本鎖および一本鎖ドメインの両方を含む動的DNAデバイスを製造するための材料としての使用を禁止しています。最近の論文29この問題が対処された、主にニックの入った二本鎖DNA（ndsDNA）で構成されて新たなDNAのゲートアーキテクチャでは紹介しましたD。 重要なことには、ndsDNAゲートのシステムは、正式な化学反応ネットワーク（CRN）29で指定されたダイナミクスを実現するように設計することができます。 ndsDNAゲートは、このように振動とカオス、双安定性とメモリ、ブール論理またはアルゴリズムの挙動30-38を示 ​​す動的システムを作成するには、原則として、使用することができます。例えば、参考文献29は、「コンセンサス」プロトコル、分散コンピューティングアルゴリズム29,39,40のタイプの分子の実装を提供三反応CRNを示しました。この作品は、最初に急速に機能性分子システムを合成するための「プログラミング言語」（ 図1A）などのCRNの形式化のための新規な使用を実証しました。 ここでは、プラスミドDNAからndsDNAゲートを導出するための詳細なプロトコルが提供されます。最初のシーケンス設計プロセスのレビューです。そして、どのように含む合成オリゴヌクレオチドの説明を次のゲート配列は、細菌培養物を介して検証され、増幅されたプラスミドとの配列中にクローニングされます。 ndsDNAゲートは、酵素処理によりプラスミドから誘導することができる方法を次に、それが示されている（ 図2参照）。最後に、蛍光動力学アッセイを用いてゲートの動作をテストするための方法を概説します。 反応機構 例として、プロトコルは、触媒化学反応A + B-&gt; B + Cに焦点を当てています。種A、B、およびC（「シグナル」、 図1B）は、すべての異なる一本鎖DNA分子に対応します。これらの分子の配列は完全に独立しており、鎖は互いに直接反応しません。すべての信号のシーケンス、すなわち二つの異なる機能的ドメイン、鎖置換反応において一緒に作用する部分配列を有する：1）短い足掛かりドメイン（ラベル鎖置換rの開始のために使用され、TB、TC）TA信号の同一性を決定するeaction、及び2）長いドメイン（A、B、Cのラベル）。 信号鎖間の相互作用は、ニックの入った二本鎖DNA（ndsDNA）ゲート複合体（ABとフォークBCに参加呼ばれる）と補助一本鎖種（&lt;TR R&gt;、&lt;BのTR&gt;、&lt;CのTB&gt;と&lt;私のTCによって媒介されます&gt;）。正式な反応A + B-&gt; B + Cは、各反応工程は、その後の反応（ 図1B）のための足掛かりを公開鎖置換反応の一連のステップを介して実行されます。信号Cは、フォークゲートに結合している間に、この例では、信号A及びBは、最初に溶液中で遊離しています。反応BとCの終了時に溶液中にあります。より一般的には、ゲートにバインドされた信号は、溶液中で遊離している信号がアクティブな間に、つまり、彼らは鎖置換反応などに参加することができ、非アクティブです入力。反応の時間経過は、蛍光レポーター戦略（ 図1C）を使用して続いています。以前の研究29には、この反応機構は、正しい化学量論だけでなく、目的とする反応の速度を実現するだけでなく、ことが示されました。

<table><tbody><tr><td>HFバッファーNEB</td><td></td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>ギブソンアセンブリマスターミックスNEB</td><td></td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>素晴らしいブロス、修正型</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprepキット(250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-stranded Genomic Blocks</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 蛍光計</td><td>堀場製作所/ジョビン・イヴォン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>合成石英セル&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドバックボーン</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>アンピシリン耐性を持つ高コピー数プラスミド。シーケンスは http://parts.igem.org から見つけることができます</td></tr></tbody></table>

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のdna鎖置換ゲイツ

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNAナノテクノロジーは、エンジニアリング材料として大量の高純度DNAを必要とします。プラスミドDNAは、高い忠実度で複製され、細菌培養によって容易に増幅され、細菌のグリセロールストックの形で無期限に保存できるため、このニーズを満たすことができます。しかし、プラスミドDNAの二本鎖の性質は、これまでのところ、DNAナノ構造の構築や、通常は一本鎖または分岐ドメインを含むデバイスの効率的な使用を妨げてきました。最近の研究では、ニックド二本鎖DNA(ndsDNA)鎖置換ゲートがプラスミドDNAに由来することがわかりました。以下は、これらのndsDNAゲートをプラスミドに効率的にコードする方法、および少数の酵素プロセッシングステップを通じてプラスミドから誘導する方法を詳述したプロトコルです。また、蛍光速度論測定を使用してndsDNAゲートを試験するためのプロトコルも示されています。NdsDNAゲートは、任意の化学反応ネットワーク(CRN)を実装するために使用でき、したがって、規範的な分子プログラミング言語としてのCRN形式の使用に向けた道筋を提供します。この技術を実証するために、触媒反応速度論を持つ多段階の反応カスケードを構築します。さらに、プラスミド由来成分は、合成DNAから組み立てられた同一成分よりも優れた性能を発揮することが示されています。

このプロトコルは、プラスミドからDNA鎖置換ゲートを導き出し、蛍光速度測定を使用してそれらを試験する方法を説明しています。ゲートは、形式的な化学反応ネットワーク(CRN)の振る舞いを近似するために、多成分システムにモジュール化することができ、分子プログラミング言語としてのCRNの新たな用途を示しています。

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

この手順の全体的な目標は、細菌プラスミドからDNA鎖置換ゲートを導出することです。この技術の主な利点は、細菌プラスミドを高純度の供給源として利用し、堅牢なDNAゲートを生成することです。この手順を実証するのは、同僚のSam Dipと私自身です 大量生産を開始し、付属のテキストプロトコルに記載されているDNA分離キットを使用して、ellucianに続く製造元の指示に従って、DNAゲートを含むDNAゲートを分離します。標準的な手法を用いてプラスミドDNAの濃度を測定します。次に、プラスミドの各ミリグラムに対して4ユニットの制限酵素PV U2 HFを添加してDNAを消化します。次に、2つの等量の氷冷無水エタノールをサンプルに加えます。混合物をマイナス80°Cで少なくとも1時間インキュベートして、DNAを沈殿させます。次に、サンプルを10, 000〜14, 000倍Gおよび摂氏0度で30分間遠心分離することにより、沈殿したDNAをペレット化します。SNATを取り外し、サンプルに室温95%エタノール1000マイクロリットルを追加します。次に、サンプルを10〜15倍反転させ、サンプルを10,000〜14,000倍Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。終了したら、上清を取り除き、ベンチでDNAを10〜20分間風乾します。沈殿したDNAから上清を除去する際は、ペレットを乱さないように注意してください。乾燥したら、DNAペレットを最大200マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に懸濁し、ボルテックスで混合します。200マイクロリットル以上の水を追加すると、通常、サンプルは希釈されて使用されます。動力学実験では、製造元の指示に従って、分光光度計を使用して再懸濁したDNAを測定します。次に、プラスミド1マイクログラムにつき1つずつ、ニッキング酵素M-B-B-S-R-Dを4ユニット追加し、対応する酵素バッファーを追加します。サンプルを摂氏65度で1時間インキュベートし、ジョイントゲートを分解します。次に、プラスミド1マイクログラムあたり1ユニットのニッキング酵素NT BST mbと対応する酵素バッファーを8ユニット追加して、フォークゲートを消化します。サンプルを摂氏55度で1時間インキュベートします。蛍光レポーターを最初に調製するには、付属のテキストプロトコルに記載されているようにサンプルを懸濁して定量します。次に、レポーターのボトムストランド10マイクロリットルとトップクエンチャーストランド13マイクロリットルをトリスアセテートEDTAバッファーに12.5ミリモルのマグネシウムで混合します。すべての植物相、4つのラベル付きストランドが急冷されることを確実にするには、クエンチャーラベルストランドの30%過剰を追加する必要があります。次に、サーマルサイクラーを使用してレポーターC複合体をアニします。サンプルを摂氏95度から摂氏20度まで、1分間に摂氏1度の速度で冷却します。終了したら、キャリブレーション後、サンプルを摂氏4度で保存しました。蛍光測定を開始するには、まず温度コントローラーを25°Cに設定し、温度が安定します。データ集録ソフトウェアで動力学測定の適切なパラメータを設定します。スペクトル蛍光計のソフトウェアを開いた後、励起モノクロと発光モノクロの両方でスリップ幅を2.73ナノメートルに設定します。次に、62番目の時点ごとに積分時間を10秒に設定し、合計測定時間を24時間に設定します。最後に、励起波長と発光波長を、実験で使用した植物相の森林と一致するように設定します。次に、410.2マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水と52.8マイクロリットルの125ミリモルのマグネシウムを含む10個のエクストラアセテートEDTAバッファーを合成石英セルに加えます。また、2マイクロリットルの300ミリモルポリTストランドを追加し、合成石英セルを10〜15秒間ボルテックスします。次に、10マイクロモルのレポーターストランドの9マイクロリットルと10マイクロモルの各補助ストランドの6マイクロリットル。次に、ジョイントゲートとフォークゲートの両方の45マイクロリットルを1マイクロモルで、溶液を少なくとも20回上下にピペッティングして穏やかに混合します。最後に、9マイクロリットルの10%ナトリウムで、0.15%SDSの最終濃度を達成するために、少なくとも20回ピペッティングして反応を穏やかに混合し、すぐに合成クォート細胞をスペクトルフレーターのチャンバーに入れ、速度論測定を開始します。5分間の測定後、入力ストランドを3マイクロリットル追加します。合成クォートセルに10マイクロモルを追加します。データ取得プログラムを一時停止している間に、反応をピペッティングで少なくとも20回上下させて反応を穏やかに混合し、ライトカバーを閉じて反応速度が安定するまで記録を続けます。ここでは、プラズマ由来ゲートと合成ゲートの状態速度論データを実験で示しています。シグナル鎖Aの濃度は固定されていますが、触媒シグナルBの量は変化します。シグナルCは、反応の進行を中断せずに読み出すために使用されます。触媒サイクルのターンオーバーは、特定の時間に各触媒Bに対して生成されるシグナルCの量として定義されます。理想的な触媒システムの場合、この回転数は時間とともに直線的に増加し、基質が制限されない限り、触媒の量とは無関係である必要があります。ここでは、合成された系がプラズマ由来の系よりもはるかに早く理想的な回転率の線形増加から逸脱していることが観察され、望ましくない副反応による触媒の隔離を示しています。ここでは、プラズマ由来ゲートと合成ゲートの回路リークを比較し、プラズマ由来ゲートを用いたリークシグナルの割合は、反応後10時間後に合成ゲートを用いたリークシグナルの割合が合成ゲートを用いた場合に比べて約8%少ないことが観察されます。このビデオを見れば、細菌プラスミドから頑健なDNAゲートを作製する方法と、蛍光速度論測定を使用してゲートをテストする方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

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実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

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