ギブソンアセンブリを使用して、ヒト伸長因子1αプロモーターの制御下でFLAGタグ化タンパク質を発現するプラスミドベクターの作製

この手順の全体的な目標は、ギブソンアセンブリアプローチを使用して、いくつかの異なるDNAソースからの短いセグメントと長いセグメントを組み合わせた大規模で複雑なDNAコンストラクトを作成することです。まず、プラスミドの完全なヌクレオチド配列を計算で設計し、次にオーバーラップするプライマーセットを設計します。次に、アセンブリ反応のDNAテンプレートをPCRで増幅します。

次に、PCR産物の精製を行う。最後のステップは、得られたプラスミドのアセンブリ反応形質転換とプラスミドクローンの検証です。最終的に、ギブソンアセンブリ反応は、ヒト伸長因子1αプロモーターの転写制御下で、野生型および変異型CSTF 64タンパク質のフラグタグ付きバージョンを含むパラレルプラスミドの開発に使用されます。

この手法が従来のDNAコーニングのような既存の方法と比較した場合の主な利点は、コーニングの連続的なステップを経ることなく、デザインが類似した野生型、変異型プラスミドを並行して作成できることです。最終的なプラスミドを表す連続ヌクレオチド配列を設計します。次に、タグやプロモーターのさまざまな組み合わせを単一または複数の合成二本鎖DNAフラグメントとして提供するなど、すぐに入手できないDNAフラグメントのPCRオーダーのテンプレートとして使用される実際のプラスミドとDNAフラグメントをリストアップします。

次に、最終コンストラクトの連続ヌクレオチド配列をPCRに適したDNA断片に分割します。フラグメントが利用可能なプラスミドと合成DNAフラグメントと一致することを確認します。200ヌクレオチド未満のDNA断片は避けてください。

プライマー生成ツールにアクセスする次に、ギブソンアセンブリ設定の変更ポップアップウィンドウで設定メニューを選択します。[change pres]タブを選択し、[build construct]メニューを選択して、スプリットDNAフラグメントをプライマー生成ツールに5プライムエンドから3プライムエンドに順次挿入します。「enter vector or insert fragment」ウィンドウを開き、ベクトル DNA の 5 つのプライムエンドを表す最初の DNA フラグメントを高速 A 形式で貼り付け、この DNA フラグメントに名前を付けます。

DNA断片を取得するための適切な方法を選択してください。次に、[続行]タブをクリックします。最終コンストラクトの接合部にヌクレオチドまたは制限部位を追加する必要がある場合は、アセンブルウィンドウへの追加および挿入フラグメントをフォワードまたはリバースプライマースペーサー領域で開きます。

追加のヌクレオチドまたは制限部位をDNA断片の1つだけに入力します。次に、[完了]タブをクリックします。コンストラクトが完成するまで、すべてのフラグメントに対して繰り返します。

View Primersメニューを選択し、プライマー配列を確認します。また、すべてのコンストラクト、ベクター、バックボーン、インサート、または異なるDNA断片についても繰り返します。PCRプライマーを水またはteバッファーで10マイクロモルに希釈します。

次に、PCR用のすべてのDNAテンプレートと一本鎖合成DNAを水中で1マイクロリットルあたり1ナノグラムに希釈します。各プライマーの10マイクロモルの2.5マイクロリットルを組み合わせて、室温でPCR反応を組み立てます。1マイクロリットルの1マイクロリットルは、1マイクロリットルのテンプレートDNA断片25マイクロリットルのホット。

DNAポリメラーゼと19マイクロリットルの水の校正を開始します。チューブを穏やかにフリックして混合し、短時間の遠心分離で液滴を収集します。使用するDNAポリメラーゼの推奨に従って、同様のサイズのDNA断片を別々のチューブで同時に増幅します。

25〜28回のPCRサイクルを実行するか、十分なDNA収量が得られるサイクル数を決定します。標準的なAROSゲル電気泳動を使用して、PCRの5マイクロリットルを分離します。PCR 産物を表す 1 つの DNA バンドが見えることを確認します。

必要に応じてDNA分子量標準を使用してDNA断片のサイズと相対量を決定し、PCRを繰り返して十分な量のDNA断片を取得します。DPN Oneで事前に消化したPCRを1.5ミリリットルのチューブに移し、各チューブに81マイクロリットルのDNA精製磁気ビーズを追加します。混合物を室温で10分間インキュベートします。

チューブを磁気コレクターに2分間置きます。次に、透明な液体を捨てます。200マイクロリットルの80%エタノールで30秒間2回洗浄します。

次に、乾燥ビーズを10マイクロリットルの10ミリモルトリス塩酸塩pH 8.0に再懸濁します 2分後、短時間回転させ、チューブを磁気コレクターに2分間配置します。8.5〜10マイクロリットルの透明な溶液を取り出し、新しいラベル付きチューブに入れます。UV分光法によりDNA断片の濃度を測定します。

ベクター骨格を表すDNA断片、または選択的マーカーを保有するDNA断片を少なくとも100ナノグラム使用します。インサートとして使用されるDNA断片の3倍のモル過剰を計算します。計算された量のDNA断片をPCRチューブ内で混合します。

次に、容量を10マイクロリットルに調整します。ギブソンアセンブリマスターミックスを10マイクロリットル加えます。PCRサーマルサイクラーで反応液を摂氏50度でインキュベートします。

無能な大腸菌の組立製品の変換を進めるか、必要になるまで製品を摂氏マイナス20度で凍結します。ケミカルコンピテントセルまたはエレクトロコンピテントセルに付随する形質転換手順に従います。通常、形質転換反応ごとに2マイクロリットルのアセンブリ反応を使用します。

最後に、特異的または標準的なプライマーを使用したDNAシーケンシングにより、DNAクローニングの成功を確認します。シーケンシングデータの精度を解析します。この実験は、切断刺激因子タンパク質64および変異型CSTF 64をクローニングするように設計されました。

タンパク質は、HE F1 αプロモーターの発現制御下で3 x flagタグに融合しました。HE F1 α とそれに続く 3 x フラグタグを含むプラスミドは入手できませんでした。しかし、以下のプラスミドが利用可能であった。

PC DNA 3.1 M hiss HF 1 α 含有プラスミドおよびマウス CSTF 64 プラスミド。コンストラクトの全配列は、ヌクレオチドおよびテキスト編集アプリケーションを使用して組み立てられました。続いて、配列を利用可能なプラスミドDNAに対応する4つの便利な断片に分割した。

アセンブリ反応のための4つのDNA断片をPCRによって増幅した。個々のクローンから得られたプラスミドを増幅し、制限酵素消化によって分析し、pc DNAベクターに適切に組み立てるために、Selectクローンをシーケンシングによって検証しました。プラスミドや一次設計などのアセンブリ技術を習得すると、その後のPCRおよび通信検証は、一次および合成DNAの合成と送達の時間を除いて、5日以内に実行できます。