Name: 多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ多段鎖変位リソグラフィーを用いたDNA固定化法とバイオチップ上での無細胞遺伝子発現実験の手法。この技術は合成生物学研究において再現性と汎用性を提供する。

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我々 は感謝してフォルクスワーゲン財団 (グラント号 89 883)、欧州研究評議会 (契約番号 694410 - AEDNA) で、このプロジェクトのための財政支援を認めます。M. S. S.GRK 2062 を通じて DFG による支援を認めています。

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

Bephore リソグラフィは、DNA や RNA のパターンの固定化のため堅牢で汎用性の高いテクニックです。まだ、手順、- 変更 - 場合はエラーのソースをすることができるいくつかの手順が含まれています。 またはシステムのパフォーマンスが低下します。
Bephore チップの作製の重要なステップは、表面の生体適合性を提供する基板の peg 修飾操作です。ここでは、それはまたその後シリル化のために表面を活性化するので、RCA の手順でクリーニングのステップは重要です。実際 peg 修飾操作中に、基板が乾燥してする必要があります。さらに、シラン ペグ ビオチンは、適切に (1.2 節) の反応性を維持し、架橋を避けるために格納する必要があります。Peg 修飾操作の結果を評価するために基板を蛍光標識ストレプトアビジンと培養および、非ペグインターフェロン コントロールに比較が可能します。正常にペグインターフェロン基板はコントロールよりもはるかに多くのストレプトアビジンをバインドする必要があります。
また、リソグラフィー プロセスの後...

無細胞発現反応様々 なアプリケーションのための生化学、バイオ テクノロジー、合成生物学で注目されています。無細胞タンパク質発現は、純粋な蛋白質のサンプルは、多くの研究のための基礎は、構造生物学の準備のため尽力しました。例えば、無細胞システム正常に使用された蛋白質複合体1または膜蛋白質2の式のセル ベースの式を使用して生成することは困難であります。特に、無細胞遺伝子発現反応は 1961年3ニーレンバーグとマッセイによる画期的な実験から始まる遺伝コードの構造の解明にも使われました。
最近では、バイオ テクノロジー、合成生物学4,5,6セル自由な方法で新たな関心がずっとあります。非生物学的化合物と無細胞システムを拡張できより簡単に7多様な生物学的起源のコンポーネントを組み合わせることができます。それは基本的な代謝機能を持つオープン携帯無料バイオリアクターを準備し、ときに単純な炭素とエネルギーの代謝産物を合成させて考えられるにもかかわらず無細胞システムがある明らかにそうでない「成長し、分裂」不利、入力8。合成生物学の新たな分野で無細胞システムは、合成生物学的機能の実装をより予測可能な「シャーシ」をすることを約束します。
現在、無細胞遺伝子発現反応いずれかを使用して実行されます (細菌、酵母、昆虫などさまざまなソース) から細胞を抽出または転写/翻訳システム (例えば、異なるアプリケーション用に最適化されました。原核生物と真核生物遺伝子発現、膜タンパク質等の生産)。(TXTL とも呼ばれる) の細菌の細胞抽出液の準備のための一般的なプロトコルは、V. Noireaux と同僚の9によって最近提供されました。生物物理プロパティは徹底的に特徴づけられる10をされているし、TXTL システムはすでに使用されて正常に一連の複雑な生化学的なタスクを実行する:などの機能的なバクテリオファージを介してアセンブリバクテリオファージのゲノム11、細菌のタンパク質フィラメント12の合成または無細胞遺伝子回路13,14の実装の無細胞式。
無細胞合成生物学で人気のある別のシステムは、浄化されたコンポーネント15,16から再構成した純粋のシステムです。TXTL システムと比較して、それは核酸やタンパク質分解機械を含まれません。線形 DNA の分解中、rna または蛋白質、問題の少ない純粋なシステム崩壊経路が動的な関数の実装のために実際に重要です。(RecBCD) による TXTL システムの線形遺伝子テンプレート exonuclease 劣化の影響を減らすために Gam の終わりを保護するタンパク質は追加しなければなりません。TXTL、純粋なシステムが購入できます。
生化学的な反作用の区画化の効果と人工細胞のような構造や吹き込む17,18,19 の更なる創造の研究が細胞生物学の問題に話題が密接に関連 ,20。人工細胞研究は通常リン脂質や他の両親媒性物質から作られた小胞のコンパートメント内の生化学的反応システムのカプセル化を行います。このようなシステムは、区画の基本的な側面や細胞性と自己複製の構造の出現を探索するため、クローズド システムの典型的な問題に直面彼ら: 機能代謝と適切な不在で膜輸送機構、それが時間の長時間実行されている区分の反応を維持することは困難 - 燃料分子使用し、廃棄物を蓄積します。
このようなセルを模倣したコンパートメント内の区画に興味深い代替はフォトリソグラフィー メソッドを使用して遺伝物質の空間的組織です。「チップ上の遺伝子」の固定化は 10 年以上前のワイツマン研究所のバー Ziv グループによって開拓された21。解決する持っていた主要な問題の中でチップの表面蛋白質の潜在的な変性と DNA の非特異吸着をあった。バー Zivら「デイジー」は、二酸化ケイ素の表面にレジスト分子固定化保証長いポリエチレング リコール (PEG) スペーサー用反応性ターミナル シランで構成されていたと呼ばれる専用のフォトリソグラフィ レジストの開発生体適合性、および光分解性の headgroup、紫外線 (UV) 照射時に反応性アミンに変えられました。チップ表面 (数キロ塩基対 (kbp) の長さ) の遺伝子長 DNA 分子を固定するデイジーを使えることが示されています。ビューの高分子物理学の観点からは、システムは、固体基板上にグラフトした高分子ブラシを表されます。Dna 高分子電解質性質では、これらのブラシの構造は浸透圧などのイオン効果22,23に強く影響します。
最も重要なは、基板固定化遺伝子がまだ機能している、転写と翻訳の RNA および蛋白質にすることができます示されています。遺伝子ブラシはソリューション24、RNA ポリメラーゼのためアクセス、転写・翻訳の複雑な高分子混合物表面の変性していません。基板上の遺伝的要素の固定化の利点の 1 つは、彼らが小さな前駆体分子とする廃棄物は、削除された25から絶えず供給されるオープン マイクロ流体リアクター システムで動作する,26。
我々 は最近開発 (生体電子ビームのフォトレジスト) Bephore27, 市販コンポーネントに専ら基づいていた、シーケンス DNA 鎖の侵略の反応を活用と呼ばれるこのメソッドのバリエーションチップに基づく人工細胞の作成を簡単に実装できる多段階露光プロシージャの実現。手順の概要を図 1に示します。それは、生体適合性 PEG 層が固定化する光分解性グループを含んでいる DNA のヘアピンの分子に基づいています。ヘアピンの電子スピンダイナミクス興味 (「変位」DIS シーケンスを含む) の分子がストランドの足掛かりを介した侵入接続経由でをすることができますどの DNA を一本鎖足掛かりシーケンスを公開します。
デイジーが非常に密できれいなのも実現できます Bephore は潜在的に簡単に実装が、「遺伝子のブラシ」は、特定のアプリケーションの利点があります。原則として、ただし、デイジーと Bephore リソグラフィ簡単に組み合わせ。関連リソグラフィー法による DNA を構築するための DNA ストランド変位は金ブラシ黄らで以前に開発したが、無細胞遺伝子式28,29のコンテキストで未使用だった。
次のプロトコルの DNA の生産の詳細な説明は、Bephore 法を用いた無細胞発現のブラシを提供しています。遺伝子チップを試作し、チップの遺伝子の空間的構造の固定化のための多段階露光の使用方法を示す方法について述べる。反応室の作製とマイクロ流体チップで遺伝子発現反応のパフォーマンスのためのアプリケーションについても述べる。

<table><tbody><tr><td>50nmの二酸化ケイ素を使用したシリコンウェーハ(Bephore基板)</td><td>Siegertウェーハ</td><td></td><td>の厚さ(&マイクロ;メートル):525 &plusmn;25、直径(mm):100</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ(PDMSマスターモールド用)</td><td>Siegertウェーハ</td><td></td><td>の厚さ(&マイクロ;メートル):525 &plusmn;25、直径(mm):76.2(3インチ)</td></tr><tr><td>スライドガラス No. 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr> スライド <tr><td>No. 1.5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5,000</td></tr><tr><td>無水トルエン</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>スピンカラム PCR クリーンアップキット</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>無細胞発現システム</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>PTFEチューブ(ID:0.8mm、OD:1.6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td>マイクロ<td>レジストテクノロジー&nbsp;</td><td></td> GmbH <td>フォトレジスト</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>マイクロレジスト技術&nbsp;</td><td></td> GmbH <td>フォトレジスト現像液</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>接着促進剤</td></tr><tr><td>二液型シリコン接着剤</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紫外線防止黄色箔</td><td>Lithoprotect(MicroChemicals経由)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masks for Photolithography</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Photolithography and fluorescence imaging</td></tr><tr><td>60x 水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LumPlanFl</td> オ<td>リンパスBX51、NA 0.9</td></tr><tr><td>20倍水浸対物レンズ</td>で使用 <td>オリンパス</td><td>LumPlanFl</td><td>オリンパスBX51、NA 0.5カメラ</td></tr><tr><td></td><td>で使用 フォトメトリクス</td><td>Coolsnap HQ</td>オ<td>リンパスBX51</td></tr><tr><td>Ligthtソース</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>オリンパスBX51</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td>Ti2-E</td><td>蛍光で使用遺伝子発現のイメージング</td></tr><tr><td>4倍対物</td><td>レンズ ニコン</td><td>CFI P-Apo 4倍ラムダ</td><td>ニコンTi2-Eカメラと使用</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>ニコンTi2-Eに使用</td></tr><tr><td>光源</td><td>ルーメンコール</td><td>SOLA SM II</td><td>ニコンTi2-E</td></tr><tr><td>ケージインキュベーター</td>に使用 <td>オコラボ</td><td>ボールドライン</td><td>ニコンTi2-E</td></tr><tr><td>圧力コントローラー</td>に使用 <td>エルベフローOB1</td><td>MK3</td><td></td></tr><tr><td>ナノフォトメーター</td><td>DNA濃度測定</td><td>をインプリメント</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナー</td><td>フェムト</td><td>200 W、ファラデーケージ内のサンプルで0.8 mbarで操作</td></tr></tbody></table>

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

パターニング構造表面の遺伝子の固定化は、オープン マイクロ バイオリアクターで仕切られた遺伝子の研究の表現プロセスを許可します。人工のセルラ システムへの他のアプローチと対照をなしてこのようなセットアップを可能遺伝子式試薬と同時排出廃棄物の連続的な供給に。動的遺伝子制御フィード バック システムの実現のために重要である時間の長時間にわたって無細胞遺伝子発現プロセスの実装が容易になります。ここを用いたシンプルな使い平版 DNA ストランド変位反応に基づく市販コンポーネントを排他的に使用する遺伝のバイオチップの作製のための詳しいプロトコルを提供します。我々 もポリジメチルシロキサン (PDMS) で仕切られた遺伝子の統合のプロトコルを提供-を用いたマイクロ流体システム。さらに、システムが DNA と式ミックスに含まれている分子の分子間相互作用の直接観察に使用することができます内部全反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡と互換性があることを示します。

2 段階露光:図 5蛍光に分類された DIS ストランドのパターンを重複でスライド ガラス上二段リソグラフィー プロセスの結果を示しています。
遺伝子のブラシからの蛍光蛋白質の表現:図 6から DNA 固定化蛍光タンパク質 YPet の式を示します。蛍光タンパク質を部分的に漂白と蛍光信号の回復を観察することによって遺伝子発現率を検討した時にいくつかポイントに即時の回復は、蛋白質の表現からは行われませんを無視します。式の 2 時間で最初の漂白後、蛍光強度はすぐに回復したし、漂白する前にその値を上回った。4 〜 6 時間後、蛍光を新鮮な式ミックスの供給なしには、反応が約 3-4 時間後終了を示す前勢力を回復しなかった。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA 分子の固定化のための単純な石版プロシージャについて述べる。

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNAバイオチップは、BASFグループが開発した自己再合成生物学の魅力的な研究プラットフォームであり、長期間にわたってインビトロ遺伝子回路の動作を可能にします。このプロトコルを使用して、この技術をより幅広い研究者が利用できるようにしたいと考えています。我々の方法は、ベフォアリソグラフィーと呼び、DNA鎖変位反応に基づくDNAの固定化のための戦略を表している。この技術の強みは、そのマルチステップのリソグラフィ機能、そのシンプルな再現性、およびすべてのコンポーネントの商業的な可用性にあります。他のバイオチップソリューションと同様に、ベフォアは異なる技術と組み合わせることができます。例えば、機能性遺伝子ブラシは、タンパク質発現のためにマイクロコンパートメント内に組み立てることができる。まず、5つの部分の水と30%のアンモニア溶液の一部をガラスビーカーに混合してRCA混合物を調製します。かき混ぜながらホットプレートで70°Cに加熱します。摂氏70度に達したら、1部30%過酸化水素を加えます。その後、直径100ミリのシリコンウエハを溶液中に入れ、そこから有機材料や粒子を除去する。30分後、基板を取り出し、洗浄ボトルの水で十分に洗い流し、窒素銃で乾燥させます。直ちに基板のPEGylationを進める。これを達成するために、まず乾燥トルエン中のビオチン-PEG-シランを1ミリリットル当たり5ミリグラムに希釈し、溶液を十分に混合するまでボルテックスする。ガラスペトリ皿に置かれた基板を使用すると、溶液を基板上にゆっくりとピペットし、表面全体を覆いますが、溶液が端を流れないようにしてください。表面が覆われたら、ペトリ皿を閉じてから、カバーを追加します。30分後、カバーを取り外し、約40ミリリットルのイソプロピルアルコールをペトリ皿に加えます。その後、基板を取り出し、イソプロピルアルコールで再び十分に洗いすり、窒素銃で乾燥させます。乾燥したら、必要になるまで基板を暗闇の中に保管してください。ガラスカッターまたはメスを使用して1センチメートルで1センチメートルを形成することにより、基板を準備します。次に、基板の端に向かって中心から短いスクラッチを作って簡単なアライメントマークを追加します。窒素銃を使用してチップから小さな粒子を吹き飛ばします。次に、2成分シリコーン接着剤の2つの液滴を混ぜ、チップの表面に接着剤を塗布し、スクラッチの先端の周りの領域を空白のままにします。そこに接着剤は、チップ上の水溶液を維持し、疎水性バリアを提供します。これにより、後続の洗浄工程が容易になり、インキュベーションに必要なDNAの量が減少します。後のステップでは、接着剤を簡単に剥がすことができます。以下の手順では、フォトクレアブルDNAは黄色の光環境でのみ処理されます。チップを室温で約10マイクロリットルのベフォア混合物で覆い、蒸発を減らすために部分的に水で満たされた箱にチップを入れます。1時間後、PBSでチップを数回洗い、バインドされていないベフォアミックスを取り除きます。次に、パッシベーションミックスの10マイクロリットルをチップに加えます。2時間後、PBSでチップを数回洗浄し、非結合のパッシベーション剤を除去します。適当なマスクホルダーに合わせて、印刷したフォトマスクを適切なサイズに切ります。フィールドストップの位置に挿入し、位置合わせマークを使用して、マスクをホルダーに配置します。顕微鏡の段階に置かれた基板を用いて、照明経路に赤いフィルターを挿入し、基板表面に焦点を合わせます。次に、露出する基板の領域にナビゲートする。次に、マスクホルダを挿入し、照明をブロックし、UVフィルタに変更します。光強度が低い場合は、シャッターを開き、カメラを使用してマスクを素早く基板にピントを合わせます。基板を揃え、マスクを焦点にして、カメラへの光路をブロックし、所望の露光時間のために高光強度で基板を照らします。露光後、顕微鏡からサンプルを取り出し、乾燥せずにできるだけ多くの緩衝液を基板から取り出します。次に、表面に付着するための配列を持つDNAを10〜20マイクロリットル加えます。乾燥しないように、湿った箱に基板を入れ、室温で2時間、基板上のDNAをインキュベートします。逆顕微鏡上で区画化された遺伝子発現を観察するために、まずサンプルホルダの2つの部分を別々に準備する。まず、両面粘着テープを使用して、固定化された遺伝子ブラシでベフォアチップをチップホルダーに接着します。次に、ホルダーの底部の中央の穴の周りにいくつかの真空グリースを追加し、チップホルダーを挿入します。ホルダーの上部を組み立てます。コンパートメントを持つ薄いPDMSチップを可能な限り小さく切り、チャネルを片側に開いたままにして、後で拡散による廃棄物と前駆体分子の交換を可能にし、酸素プラズマでPDMSチップの裏側にあるガラスカバースリップをプラズマ処理します。処理の直後に、PDMSチップをガラススライドの中央に置き、コンパートメントを上向きにします。その後、PDMSでガラスを摂氏70度で1時間焼きます。サンプルホルダ全体を組み立てる直前に、ガラススライドをPDMSチップでプラズマ処理します。次に、上部ホルダーの大きな穴の周りにいくつかの真空グリースを追加し、その上にPDMSとガラススライドを置きます。グラスをグリースにそっと押し付ける。慎重にチップからバッファーを取り出し、自己再発現システムの10マイクロリットルでそれを洗浄します。次に、60マイクロリットルの自己再発現システムをチップに加え、2成分のシリコーン接着剤を端から取り除きます。次に、20マイクロリットルの発現システムをPDMSに追加します。PDMSに液滴を置いた後、素早くコンパートメントがよく濡れていて、気泡が無い立体顕微鏡を確認してください。気泡がある場合は、それらを洗い流してみてください。ホルダーの2つの部分を組み立てると、チャンバーとDNAブラシを整列させるために、立体顕微鏡の下で動作します。2本のネジとウイングナットが両手で簡単にアクセスできるように、ボトムホルダーをグリッパーアームで固定します。トップホルダーをボトムホルダーに挿入し、無細胞発現システムの液滴が融合するまで下げます。次に、区画と位置合わせマークが XY 平面の類似領域に含まれているかどうかを確認します。下から、ホルダーの下側に触れるまでウィングナットをねじ込みます。XY平面のコンパートメントとチップを揃えながら、ウィングナットを軽く締めます。このステップは、いくつかの経験を必要とし、サンプルホルダーの構築に依存します。PDMSは、穏やかな力だけでチップに押し付ける必要があります。次に、スポンジを蒸発防止エンクロージャーに水でスプレーし、ホルダーを箱に入れます。その後、5ミリリットルのシリンジに2成分シリコーン接着剤を充填し、それを使用して箱を密封します。最後に、温度制御顕微鏡に箱を移し、蛍光顕微鏡を用いてDNAブラシと反応を画像化する。ここでは、ベフォアガラススライド上で行われる2段階のリソグラフィプロセスにより、蛍光標識されたDNA鎖の重なり合うパターンが得られます。このオンチップ遺伝子発現の実証では、DNAは左側のチャンバーに固定化されています。発現ミックスに曝露すると、黄色蛍光タンパク質YPetが固定化されたDNAから合成される。遺伝子発現系の活性を評価するために、漂白工程後に蛍光の回収が観察される。2時間で、蛍光強度は急速に回復した。しかし、4時間及び6時間後には、回復しなかったが、発現ミックスの新たな供給がなければ、反応は4時間前後で終了したことを示す。遺伝子発現は閉系では限定されるが、マイクロ流体を介して追加の前駆体分子を発現区画に供給することによって、より長い期間にわたって持続することができる。ベフォア法は、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子長DNAを固定化するために使用され、自己再遺伝子発現のための相互作用DNAブラシのシステムを構築するために適用することができる。この技術は、単一分子蛍光研究などの生物物理学における他の用途にも使用され得る。このビデオを見た後、ウエハースやガラススライドからベフォアバイオチップを製造し、研究プロジェクトに統合できるはずです。

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学ぶ多段鎖変位リソグラフィーを用いたDNA固定化法とバイオチップ上での無細胞遺伝子発現実験の手法。この技術は合成生物学研究において再現性と汎用性を提供する。

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

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