細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

この手順の全体的な目標は、生体適合性ナノ粒子の超小さな集団を合成し、それらの物理的特性を特徴付け、粒子細胞の相互作用を調査することです。これは、最初に相転移温度法を使用して脂質ナノ粒子を合成することによって達成されます。このプロセスでは、脂質と界面活性剤が最初に共溶かされます。

特定の量の水を加えた後、相分離が起こるまで混合物を加熱します。次いで、混合物を連続的に攪拌し、ナノエマルジョンが作製され、固体脂質ナノ粒子またはslnの合成が完了する。次に、動的光散乱(DLS)を使用して、粒子サイズと多分散性を測定します。

示差走査熱量測定(DSC)は、粒子をさらに特徴付けるために融点と融解潜熱を決定するために使用される追加の技術であり、最終的には蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを使用して粒子細胞の相互作用を調査することができます。超音波処理マイクロ流体や高圧均質化などの既存の高エネルギー法に対するこの技術の主な利点は、これが比較的穏やかな合成技術であり、シンプルでスケーラブルであることです。LNSを合成するには、0.6ミリグラムの蛍光色素または他の親油性化合物と0.10グラムの線状アルカンまたは脂質を組み合わせます。

15ミリリットルのバイアルに、摂氏90度でコンポーネントをコアメルトし、攪拌して0.11グラムの線状非イオン性界面活性剤を加えます。次に、得られた混合物を摂氏90度でmltし、攪拌します。次に、1.79グラムの滅菌水を加えて混合物を摂氏90度に加熱し、2つの相が観察されるまで溶液を視覚的に監視します。

次に、透明なナノエマルジョンが形成されるまで混合物を攪拌します。対照試料として機能させるために、蛍光色素を添加せずに別のナノエマルジョンを並行して調製します。さらに、滅菌された0.2ミクロンフィルターを使用して各ナノエマルジョンを滅菌します。

DLSを使用して、サンプルの測定前に粒子サイズを測定するための機器設計でガラスを使用してS lnsの粒子サイズと多分散性を測定するには、2つの既知の標準の粒子サイズは、標準の準備と測定のためのメーカーのプロトコルに従って測定する必要があります。次に、それぞれに準備したサンプルを測定します。100秒の実行時間、水の屈折率、摂氏20度の水の粘度を使用します。

DSCを使用してS lnsの熱挙動を調査するために、粒子サイズ分布の平均粒子径と多分散性を報告し、最初にS LNSを約25ミリグラムの質量を持つ40マイクロリットルのアルミニウムパンにピペットで移します。ユニバーサルクリンププレスを使用してパンを密閉し、DSCスキャン中の水分損失を最小限に抑えます。5〜80°Cの各ナノエマルジョンを測定する前に、谷が融点を表し、曲線下の面積の積分を表すDSCプロットから融点と融解潜熱を報告します。

DSCプロットでは、材料の量で割った値が溶融培養の潜熱を表します。ヒト真皮線維芽細胞の培養のための液体培地中の製造業者の指示に従って、初代ヒト線維芽細胞。低血清増殖サプリメントキットを添加し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿雰囲気で維持し、MTTおよびイメージング分析シード細胞の両方で80%のコンフルエンスに達したときに継代培養します。

ウェルあたり20, 000細胞の密度の96ウェルプレート。SLN曝露の一晩前に細胞を摂氏37度で平衡化させ、完全な培地でSLMをゼロ希釈して所望の脂質濃度を達成し、S lnsとのインキュベーションの24時間後に96ウェルプレートの各複製ウェルにウェルあたり10マイクロリットルを追加し、メーカーのプロトコルに従ってMTTアッセイを使用して細胞生存率を決定します。細胞を一度洗浄し、それぞれに100マイクロリットルの新鮮な培地を加えます。

コントロールウェルを70%メタノール溶液で10分間インキュベートしてから、新鮮な培地と交換します。マイクロプレートの各ウェルにウェルあたり10マイクロリットルのMTT試薬を添加し、一晩インキュベートした後、摂氏37度で一晩インキュベートし、提供された洗剤溶液100マイクロリットルで細胞内形態および結晶を可溶化します。メーカーのプロトコルに従って、細胞を界面活性剤溶液中で室温で3時間インキュベートしてから、吸光度値を取得します。

マイクロプレートリーダーを使用して顕微鏡検査の準備をします。線維芽細胞を滅菌リン酸塩パフ生理食塩水で2回洗浄します。線維芽細胞をlnsで投与した後、特定の時点で細胞を冷たい70%メタノールで10分間固定します。

10分後、メタノールをリン酸緩衝生理食塩水またはPBSに交換してから、倒立顕微鏡で画像を撮影します。合成したS SLNは、MTTアッセイを用いて、平均粒子径18.59、ポリ分散度5.83のコントロールS LNSと、平均粒子径16.87ナノメートル、ポリ分散度4.47のナイルレッドロードSLMをもたらしました。細胞代謝に対する用量反応効果を測定し、粒子濃度の増加が細胞生存率の低下をもたらしました。

SLN単独に曝露された細胞とナイルレッドロードに曝露された細胞との間に毒性の差は観察されなかった。SLNです。並行して、細胞が組織培養物への付着について視覚的に調べられました。ポリスチレンと画像は、代表的な細胞形態と経時的な蛍光粒子の取り込みの両方を実証するために、1ミリリットルあたり5マイクログラムに等しい用量を使用して撮影されました。

脂質粒子の取り込みは、ばく露後2時間で観察されました。ナノ粒子の取り込みレベルは、マウスの骨髄由来樹状細胞、またはフローサイトメトリーによるB MDCsにおけるナイル赤色蛍光の強度を測定することによって決定されました。使用されたSNSの濃度とB MDCで評価された蛍光量との間には直接的な相関関係が観察されました。

このビデオを見れば、生体適合性ナノ粒子の超微小集団を合成し、その物理的特性を特徴付け、粒子細胞の相互作用を調査する方法について十分に理解できるはずです。