Name: アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析プロトコル。GFAP免疫組織化学染色と共焦点顕微鏡を用いて、病理条件下または治療介入後の細胞構造変化を評価する方法です。

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この研究は、医学のイラン大学（テヘラン、イラン）の倫理委員会によって承認された実験動物の管理と使用（NIH）のためのガイドに記載されたポリシーに準じて行きました。 1.動物、手術検体の準備注：3D共焦点顕微鏡分析のために、脳組織を準備します。 <ol><li>二つのグループに無作為に動物を分割：Aβ1-40 -injection（N = 8）、およびゲニステイン治療（N = 8）と、Aβ1-40 -injection。手術前に強制飼養1時間によってゲニステイン（例えばポリエトキシル化ヒマシ油等の車両に希釈した10mg / kgの）を管理。 </li><li>ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で動物を麻酔。つま先をつまん後引っ込め反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、手術中に目に軟膏を使用してください。 </li><li>定位固定装置と剃りヘッドの動物を配置します。 IODの適用INE溶液を切開前頭皮をきれいにし、感染のリスクを減らすために、手術中に無菌手術部位を維持します。ラット脳アトラス8によれば、ブレグマ-3.5ミリ後方、正中線±2ミリメートル、横方向、および硬膜下の-2.8 mmに海馬におけるAβ1-40定位（4μl）を注入します。定位方法については、以前の出版物9を参照してください 。 </li><li>動物は動物の快適さを確保するために完全に意識されるまで術後観察/ケアを提供します。リカバリ中に暖かい動物を維持し、完全に回復するまで、他の動物とのケージにそれらを返しません。手術後、動物に感染の兆候に注意してください。 </li><li> 3週間手術後（150ミリグラム/ kg）をケタミンにより深く動物を麻酔。 0.1 M PBS（pH値= 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドに続いて、0.9％の生理食塩水で動物を灌流することによってtranscardial固定を行い、その後、削除して、10で説明したように、&lt;脳を修正/ SUP&gt;。 </li><li> 4℃で2〜3日、4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 </li><li>組織包埋装置を使用することにより、パラフィンブロック中の組織を埋め込み、それが正しい位置合わせまたは切片を妨げる可能性があるため、充填アンダーまたはオーバー充填カセットを避けます。パラフィンブロック中の組織の向きに注意してください。 注：ラット海馬は、例えば、大脳半球の後部に近接しています。したがって、組織は、脳の後部で開始を区画する方法に埋め込まれるべきです。目的の解剖学的構造に到達するためのガイドとしてPaxinosアトラス8を使用してください 。 </li><li>空気の動きがセクションの取り扱いが困難になることから離れて空気ドラフトや戸口からミクロトームを置きます。 </li><li>この深さは完全なアストロサイトのZスタック画像を生成するために必要なことのように厚さ≥20ミクロンでセクションを使用してください。彼らは望ましくない厚さを有することができるように熱電子に、最初のカップルのセクションを使用しないでくださいxpansion。 </li><li> （5±2 C、パラフィンの融解温度以下）だけで十分な長さのセクションを平坦化する温水の表面にセクションを配置します。 注：セクションの拡大にわたり構造の形態を乱すことができます。慎重にセクションを転送するために小さな絵筆を使用してください。各スライドの2〜3のセクションを収集します。 </li><li>ストア直立位置にあるラックにスライドし、いくつかの時間またはO / N 37℃でそれらが乾燥してみましょう。 </li></ol> 2.免疫組織化学<ol><li>キシレン、2×10分間で脱パラフィン切片、及びアルコール勾配（99.8％、95％、70％、10分毎）およびPBSを介して再水和します。 </li><li> 0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.25％トリトンX-100および3.5％正常血清（4℃でO / N）を含有するPBSで1,500：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体でインキュベートし、1に希釈しました。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>二次アルカリホスファターゼコンジュゲートantibodieでインキュベート1時間のためのS（1：PBSで希釈した100、21℃）。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 注：これは、バックグラウンド染色を最小限にするために、適切な二次抗体の後のセクションを洗浄することが重要です。 </li><li>液体パーマネントレッドクロモゲン（15〜20分）で暗闇の中でのセクションをインキュベートします。注：使用する前に解決策がない以上30分以上を準備します。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>最後に、4-6ジアミジノ-2-フェニルと、核染色（DAPI; 1：PBSで希釈した500）の前にカバー・スリップします。顕微鏡の前に冷蔵庫24〜48時間でスライドを保管してください。 </li></ol> 3.共焦点顕微鏡注：定量的評価（下記参照）の場合は、エラーのリスクを減らすために枝を重複を最小限に抑えてはっきりと見えるDAPI染色核とアストロサイトを選択します。 Zスタック画像を生成することは時間がかかります。我慢して、処理中に停止しないでください。直立共焦点レーザー走査型顕微鏡は、Uでありますアストロサイトから3D画像を作成するためのsed。 <ol><li>顕微鏡ステージ上にスライドを入れて、63Xの目的を選択します。 </li><li>イメージングソフトウェアを開き、スタートシステムをクリックします。探しタブをクリックします。割り当てに移動し、適切な光を調整するために、GFPを選択します。 </li><li>光を反射するようにシャッターを開きます。シャッターの右側にリフレクターリボルバーを見つけて、アストロサイト（緑、赤または紫）によって反射されるべき色を選択します。赤色（FSet20 WF）は、ここで使用しました。 注：顕微鏡の接眼レンズに直接絵を集中することを忘れないでください。 </li><li>最適な焦点を見つけるために、すべての閉じをクリックして、画面モードで顕微鏡ピンを入れ、取得]タブをクリックします。 </li><li>取得]タブの下でスマートセットアップをクリックします。ウィンドウが開きます。リストから適切な蛍光団（現在のプロジェクトで、すなわち DAPIおよびAlexaフルーア555、）を選択します。色が自動的に選択されます。 </li><li>最良の信号をクリックして、[適用し、設定された露出をクリックしました;その後、コンピュータは自動的に露光パラメータを設定します。 </li><li>画像を最適化するために、チャンネル・ウィンドウに移動します。マーク解除トラック2は、トラック1を強調表示し、ライブをクリックしてください。必要に応じて画像の焦点を合わせます。 </li><li> Channelsウィンドウで次のキーを調整します。自動的にピンホールを最適化するために、1AUをクリックしてください。それ以外の場合は、共焦点画像を非最適になりますこの手順を実行することは非常に重要です。最高の強度（余分なノイズを低減するために800の下には、この設定を保持する）を持つようにゲインを調整します。最後に、2と3の間のデジタルゲインを設定します。 </li><li>マーク解除トラック1は、トラック2をクリックして、トラック2のためのステップ3.8を繰り返します。そして、ライブを停止します。 </li><li>取得モードのウィンドウに移動します。フレームサイズを最適化し、平均化することによって、画像を改善します。フレームサイズは、X * Yに移動して、1,024×1024を選択変更するには。良好な画像を作成するために遅い速度を選択してください。 </li><li>アベレージに移動し、数≥4を選択します。この平均値はな生産するために平均化されるスキャンの数を示します取得した画像を電子。今スナップボタンをクリックして、キャプチャされた2D画像を保存します。 </li><li> 3Dイメージングの場合は、Z-Stack]ウィンドウを開くには、原因となるスマートセットアップ下のZスタック項目をマークします。 </li><li>セルの深さ、すなわち 、zスタックのための最初と最後の位置を設定します。初のライブを​​クリックしてください。その後、Zスタックが開始する組織でアストロサイトの最上位の位置に集中する顕微鏡のフォーカス駆動を使用しています。設定された最初のをクリックします。その後、Zスタックのスキャンを停止する必要がある組織内のアストロサイトの最も低い位置まで焦点を当てます。最後に設定をクリックします。そして、ライブを停止します。 </li><li>間隔を選択します。 1.01μmのは、現在の研究で使用されています。間隔を選択するスライスの数を設定することが最適でクリックすることによって行うことができます。 </li><li>スタート実験をクリックします。スキャンが完了すると、画像を保存します。この画像は、以下のパラメータの測定に使用されます：アストロサイトの領土の表面積と体積、ブラジャーを含む全体のアストロサイトnches、細胞体および核。 </li><li>ステップ3.6から3.11に記載されているように10倍または20倍対物レンズを使用して二次元画像を取得します。この画像は、測定抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の強度のために使用することができます。 </li></ol> 4.星状細胞密度およびGFAP +蛍光強度<ol><li> 20X 2D画像を開きます。画像ウィンドウの左側にヒスト（Hisogram）をクリックします。 </li><li>アストロサイトの密度を計算するために、20Xの対物レンズの下に三つの連続視野を選択します。フィールドに支店を重ね、最小で明確なソーマを示すアストロサイトの数をカウントします。 </li><li>蛍光強度を定量化するために、画像ウィンドウのフッターに適切なツール（長方形や円）を選択し、測定のための領域を選択します。平均値と標準偏差は、画像の下に自動的に表示されます注意してください。 strの間の現在の研究では、0.7ミリメートル2矩形領域iatumと歯状回の内側ブレードを使用しました。 </li></ol> 5.星状細胞の分岐<ol><li>長さと分枝の総数を定量化するために、画像解析ソフトウェアで（20Xで取得）の3D画像を使用。選択されたアストロサイトの各枝の長さに沿って手動で線を引きます。そして、ラインの長さを測定するために特化された測定ツールを選択します。ブランチの数を定量化するために、マークされた項目の数をカウントするカウントツールを選択します。 </li></ol> 6.ボリュームと表面積注：3D画像解析ソフトウェアで手動で構造をマーキングは、フォーカスと訓練が必要です。実験を開始する前に、何回か練習。 <ol><li>アストロサイトの核、相馬、細胞体と領土の体積と表面積を定量化するために、このようなVolocity 6.1のように3次元画像解析ソフトに（ステップ3.1から3.16で取得された）3D画像を転送します。 </li><li>ソフトウェアを開き、新しいを作成します図書館。新しいライブラリの左側の灰色の列にすべての画像をドラッグします。そして、1 3D画像を選択します。右側には、異なる色の異なるチャネルがあります。興味のある一つのチャネルをオンにします。例えば、DAPI用の青のチャンネルは、核を測定するとき。最適なコントラストを得るために、手動で明るさを変更します。 </li><li> [ツール]メニューを選択し、ボリュームを作成し、Zスタック画像の中から、単一の3D画像を生成するために行きます。 [編集]メニューの[プロパティ]をクリックし、Xは、Y、Zの性質が提示されていることを確認してください。それ以外の場合は、3次元解析を行うことは不可能です。 </li><li>ツールバーのフリーハンドRIOツールアイコンをクリックします。アストロサイトの核の体積と表面積を測定するには、DAPIで標識された核の周りに線を引きます。 </li><li>アストロサイトの細胞体の体積と表面積を測定するには、枝を除く相馬の周りに線を引きます。 </li><li>全体アストロサイト（支店を含む細胞体）の体積および表面積を測定するには、次のソーマの周りに線を引きますすべての枝の表面。 </li><li>アストロサイトの領土の体積と表面積を評価するには、枝の先端との間に線を引きます。 注：押して、不要な図面を消去するには、キーボード上で削除します。 </li><li>測定プロトコルを作成するために、画像ウィンドウの上部にある測定のメニューをクリックします。さまざまなツールを含むウィンドウが開きます。 </li><li>ドラッグすると、ウィンドウ（ウィンドウ枠）の一番上にオブジェクトを検索します。人口1に名前を付け、関連する色を選択し、メジャーをクリックしてください。別のウィンドウが開きます。 </li><li>パラメータすなわち 、ボリュームまたは表面積を選択してください。 [OK]をクリックします。データがテーブルに表示されます。 </li><li>測定メニューのデータをクリックして保存し、測定項目を確認し選択します。 </li><li>開いたウィンドウから呼び出された新しい測定項目を選択します。次に、データに名前を付け、[OK]をクリックします。 </li><li>最後に、グラフパッドまたはプログラムをExcelなどの統計ソフトウェアにデータをエクスポートします。データを分析するためにt検定を使用し、2DグラムをプロットAPHS。 </li></ol>

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</ol>

この作品は、オスターゴットラントの州議会、（スウェーデン）と医学のイラン大学の細胞および分子研究センター（テヘラン、イラン）からの助成金によってサポートされていました。

現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために、Aβ1-40とラットの海馬組織-とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態、すなわちアストログリオーシスに対するゲニステインの影響を示すことができました。 脳組織の細胞内および細胞外環境の変化は、細胞/組織の容積および/またはサイズを変更することができます。これらの変化は、様々な脳損傷3,11に病理学的特徴と考えられています。これらの変化を定量化するために、多数の技術が使用されます。ほとんどの調査は唯一のCEのごく一部についての情報を与える光 - または電子顕微鏡（EM）によって捕獲2D低解像度の画像を使用することに基づいていますLL。この制限を克服するために、高解像度画像上の3次元共焦点形態計測は、11を...

健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。 反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。 アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了7を示しています 。 この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサイトで覆われた組織）の表面積と体積を、セル全体、細胞体、および核（支店を含みます）;枝の長さの合計と数。星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光強度。そして、アストロサイトの密度（数/千μm2で）。この目的のために、我々は、抗炎症物質としてゲニステイン処理の有無にかかわらず、Aβ1-40の海馬内注入に暴露されたラットからの脳切片を用いました。記載されているプロトコルは、形態学的ANのために使用することができますインビトロまたはインビボでの異なる条件で異なる細胞型のalysis。

<table><tbody><tr><td>アミロイドベータ 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>-70 °C で維持。C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>キープ -20 &deg;</td></tr><tr><td>グリア線維性酸性タンパク質に対するCポリコロンウサギ抗体</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>アルカリリン酸結合ブタ抗ウサギ IgG抗体</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr>液体<td>永久発色剤</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>液体永久赤色基質バッファー</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>クレモフォアEL</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated ヒマシ油 - ステップ 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ1-40に露出ラット脳組織</サブ&gt;（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。

このセクションでは、3次元形態計測分析によって生成定性的および定量的な観測のいくつかの例を紹介します。前述した全12パラメータの完全な結果を得るために、私たちの以前の出版物10を参照してください 。 定性的観察アストロサイトは、Aβ1-40注射したラット（ 図1）で、通常の長さで細いまたは太い枝を示しました。短い枝といくつかの小さな星形のアストロサイトは、大脳皮質で観察された、とアストロサイトのコンパクトなネットワークは、脳梁に発生しました。 ゲニステイン処理することにより、Aβ1-40 -injectionと動物の脳組織におけるアストロサイトは短く、細い枝（ 図2）10で星状の形を示しました。いくつかの星状細胞は萎縮外観を示しました。 星状細胞の密度およびGFA...

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

この手順の全体的な目的は、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析し、アストロサイトの形態を評価することです。この手法は、病理学的条件下または介入戦略の効果として、さまざまな細胞型に現れ得る形態学的変化を評価するために使用できます。この技術の主な利点は、細胞構造に関連する多くのパラメータを同時に研究できることです。Mariam Bodel博士がこの手順を実演します。免疫組織化学染色のためのスライド作成後、キシレンに10分間2回浸し、切片の脱パラフィンを行います。洗浄後、99.8%、95%、70%の各エタノールで10分間ずつインキュベートし、切片を親水化させます。PBSで洗浄後、1:1500に希釈したglial fibrillary acidic protein（GFAP）一次抗体溶液中で、4°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、切片をPBSで5分間、3回洗浄します。次に、1:100に希釈したアルカリホスファターゼ標識二次抗体溶液を用い、室温で1時間インキュベートします。使用前30分以内に、再び切片をPBSで5分間、3回洗浄します。3 mLの基質バッファーに赤色発色剤溶液を1滴加えます。各スライドをこの溶液100 µL中で、暗所で15〜20分間インキュベートします。その後、PBSで5分間ずつ3回スライドを洗浄します。最後に、PBSで1:500に希釈したDPIで核を染色します。切片にAntifa mediumを1〜2滴滴下し、直ちにカバーガラスで封入します。封入状態を確実にするため、顕微鏡観察前にスライドを4°Cで24〜48時間インキュベートしてください。共焦点顕微鏡観察を開始するには、スライドを顕微鏡ステージに設置し、63x 対物レンズを選択します。解析ソフトを起動後、「acquisition」タブ内の「smart setup」をクリックし、適切な蛍光フィルターセットを選択します。ここでは、DAPIおよびAlexa Fluor 555を使用します。次に、[best signal]をクリックし、続いて[apply]をクリックします。その後、[set exposure]をクリックして、コンピュータに最適な露光パラメータを決定させます。画像を最適化するには、[channels]ウィンドウを開き、画像を[live]に切り替えます。必要に応じてフォーカスを調整してください。次に、ピンホールを最適化するために1つのauをクリックし、最高の強度が得られるようにゲインを調整します。最後に、デジタルゲインを2から3の間に設定します。この最適化が完了したら、ライブイメージを停止し、取得モードウィンドウを開きます。X by Yをクリックしてフレームサイズを調整し、10 24 by 10 24を選択します。また、スキャン速度は低速（slow speed）を選択してください。次に、平均化（averaging）タブを開き、4以上の数値を選択します。次に、snapボタンをクリックして、キャプチャした2D画像を保存します。3Dイメージングを設定するには、smart setupタブを開き、ZS stack項目にチェックを入れます。これにより、Zs stackウィンドウが開きます。Zstackの開始位置と終了位置を設定するために、再度liveをクリックし、アストロサイトの最上部までフォーカスを調整します。まず「set first」をクリックします。次に、フォーカスをアストロサイトの最下位に合わせ、「set last」をクリックしてからライブビューを停止します。続いて、「optimal」をクリックしてインターバルを選択します。ここでのスライス数を設定します。間隔は1.01 µmです。最後に、「start」および「experiment」をクリックし、スキャンが完了したら画像を保存します。また、10倍または20倍の対物レンズを使用して2D画像を取得してください。蛍光強度の測定を行うには、画像ウィンドウで長方形または円形ツールを選択し、測定領域を指定して、アストロサイトの核、細胞体、およびテリトリーの体積と表面積を定量化します。3D画像を、解析ソフトウェアのVelocity 6.1などの適切な解析ソフトへ転送します。新しいライブラリを作成し、すべての画像を左側のグレーの列にドラッグします。3D画像から1枚を選択し、dapiなどの取得済みチャンネルのうち、目的のものを1つオンにします。核の測定を行う場合は、コントラストを最適化するために輝度を手動で調整してください。次に、ツールメニューを選択します。Make Volumeを選択し、Zack画像から単一の3D画像を生成します。編集メニューを開き、プロパティをクリックします。X、Y、およびZのプロパティが表示されていることを確認してください。次に、ツールバーからフリーハンドROIツールを選択します。選択したツールを使用して、DPIで標識された核の周囲に線を描き、アストロサイト核の体積と表面積を測定します。同様に、フリーハンドROIツールを用いて、細胞体およびすべての分枝の表面に沿って線を引くことで、アストロサイト全体の体積と表面積を測定します。画像ウィンドウ上部の測定メニューをクリックし、「find objects」をウィンドウの最上部までドラッグします。population oneに適切な名称を入力し、対応する色を選択して「measure」をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。この新しいウィンドウで、パラメータとして「volume」または「surface area」のいずれかを選択し、「okay」をクリックしてください。データを保存するには、測定メニューをクリックし、「測定作成」項目を選択します。ウィンドウから「新しい測定項目」を選択してください。データのファイル名を入力し、「OK」をクリックします。最後に、統計解析を行いデータプロットを作成するために、測定データを適切なソフトウェアパッケージにエクスポートします。ここでは、アミロイドβ1-40、またはアミロイドβ1-40とIanで処理したラットの固定脳組織におけるアストロサイトを比較しました。アミロイドタンパク質の注入による処理の結果、アストロサイトの分枝がより太く、かつ長くなることが示されました。Ian投与動物から得られたこれらのアストロサイトは、短く細い突起を持つ星状の形態を示した。また、Ian投与ラットの脳切片では、アストロサイトのGFAP陽性蛍光が減少していた。特定のアストロサイトの形態計測分析により、アミロイド単独投与群と比較して、Ian投与群ではアストロサイトの核、細胞体、アストロサイト全体、およびアストロサイト領域の体積が減少していることが明らかになった。この画像処理に習熟すれば、適切に実施することで1細胞あたり数分で解析を完了させることができます。本手順を行う際は、構造を高精度にマーキングすることが重要です。実験の展開後、実際に開始する前に、目的の構造を手動でマーキングする練習をしておくことを推奨します。この手法は、細胞生物学、組織学、病理学の分野の研究者が、健康な状態または疾患状態における細胞構造を探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、3D画像を用いて単一細胞の12種類の異なるパラメータを測定する方法について、十分に理解することができます。

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。...

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

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マウス脳組織切片における蛍光標識アストロサイトの免疫染色

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

出典: Bagheri, M., et. al.アストロサイトの三次元共焦点形態計測解析のためのプロトコルJ. Vis.

共焦点顕微鏡を用いた免疫標識星状細胞の三次元イメージング

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実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

縦一直線に並べられたアストロ...

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

記載されているパイプラインは、ギガバイトより大きい電子顕微鏡データセットのセグメンテーション用に設計され、細胞全体の形態を抽出します。セルを3Dで再構築すると、個々のニーズに合わせて設計されたカスタマイズされたソフトウェアを使用して、3Dで直接定性的および定量的な分析を実行し、また、仮想現実を使用してビューの閉塞を克服することができます。...

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

アストロサイトは形態的に複雑な細胞であり、その複数のプロセスとふさふさした領域によって例示される。彼らの精巧な形態を分析するために、我々は軽く固定された組織で細胞内ルシファー黄色イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを提示する。...

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。...

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。...

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

学ぶ アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析プロトコル。GFAP免疫組織化学染色と共焦点顕微鏡を用いて、病理条件下または治療介入後の細胞構造変化を評価する方法です。

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

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