アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析することにより、アストロサイトの形態を評価することです。この方法は、病理学的状態または介入戦略の効果として、さまざまな細胞タイプに現れる可能性のある形態学的変化を評価するために使用できます。この手法の主な利点は、細胞構造に関連する多くのパラメータを同時に研究できることです。

Mariam Bodel博士は、免疫組織化学染色のスライドの準備に続いて、de parize切片をキシレンに2回10分間浸すことにより、この手順を実演します。99.8%95%エタノールと70%エタノールのそれぞれでスライドを10分間インキュベートし、洗浄後に切片を再水和します。PBSは、1〜1500希釈のグリア線維性酸性タンパク質またはGFAP一次抗体溶液でスライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、切片をPB S3で5分間洗浄します。次に、スライドを1〜100個のアルカリホスファターゼ標識二次抗体溶液と室温で1時間インキュベートします。再度、使用前にPB S3で切片を5分間、30分以内に洗浄します。

3ミリリットルの基質緩衝液に1滴の赤色発色剤溶液を加えます。各スライドをこの溶液の100マイクロリットルで暗所で15〜20分間インキュベートします。次に、スライドをPBS3で5分間洗浄します。

最後に、PBSで1〜500に希釈したDPIで核を染色します。切片にAntifa培地を1〜2滴塗布し、すぐにカバースリップで密封します。顕微鏡検査の前にスライドを摂氏4度で24〜48時間インキュベートして、シーリングを確保します。

共焦点顕微鏡観察を開始するには、スライドを顕微鏡ステージに置き、63 x対物レンズを選択します。取得ソフトウェアを開いた後、取得タブでスマートセットアップをクリックし、適切な4つのフロアを選択します。ここでは、dappyとAlexa、55階が使用されています。

次に、[best signal]をクリックし、次に[Apply]をクリックします。次に、[露出の設定]をクリックして、コンピューターが最適な露出パラメーターを決定できるようにします画像を最適化するには、チャネルウィンドウを開き、画像をライブに切り替えます。必要に応じてフォーカスを調整します。

次に、1つのauをクリックしてピンホールを最適化し、ゲインを最高の強度に調整します。最後に、デジタルゲインを2〜3に設定します。この最適化後、ライブ画像を停止し、取得モードウィンドウを開きます。

X by Yをクリックし、10 24 x 10 24を選択してフレームサイズを調整します。また、低速を選択します。次に、平均化タブを開き、4 以上の数値を選択します。

次に、スナップボタンをクリックして、キャプチャした2D画像を保存します。3Dイメージングを設定するには、スマートセットアップタブを開き、ZSスタックアイテムをマークすると、Zsスタックウィンドウが開きます。Zackの最初と最後の位置を設定するには、再度「live」をクリックし、フォーカスをアストロサイトの一番上の位置に調整します。

最初に[セット]をクリックします。次に、フォーカスをアストロサイトの最も低い位置に調整し、[最後に設定]をクリックしてから、ライブビューを停止します。次に、[最適]をクリックして間隔を選択します。

ここでスライスの数を設定するには、間隔を 1.01 マイクロメートルにします。最後に、[開始]をクリックして実験し、スキャンが完了したら画像を保存します。また、10 倍または 20 倍の対物レンズを使用して 2D 画像を取得します。

蛍光強度測定では、画像ウィンドウで長方形または円のツールを選択し、測定領域を強調表示して、アストロサイト核体細胞の体と領域の体積と表面積を定量化します。3D画像を、解析ソフトウェアのVelocity 6.1などの適切な解析ソフトウェアプログラムに転送します。新しいライブラリを作成し、すべての画像を左の灰色の列にドラッグします。

3D画像を1つ選択し、取得した目的のチャネル(dapiなど)の1つをオンにします。核測定の場合は、手動で明るさを調整してコントラストを最適化します。次に、ツールメニューを選択します。

「ボリューム作成」を選択し、ザックの画像から 1 つの 3D 画像を生成します。編集メニューを開き、プロパティをクリックします。X、Y、Z の各プロパティが表示されていることを確認します。

これに続いて、ツールバーからフリーハンドROIツールを選択します。選択したツールを使用して、DPIでラベル付けされた核の周りに線を引き、アストロサイト核の体積と表面積を測定します。ここでも、フリーハンドのROIツールを使用して、すべての枝の表面に沿って体細胞の周りに線を引くことにより、アストロサイト全体の体積と表面積を測定します。

画像ウィンドウの上部にある測定メニューをクリックし、検索オブジェクトをウィンドウの上部にドラッグして、母集団1にわかりやすい名前を付け、関連する色を選択して測定をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。この新しいウィンドウで。パラメータとしてボリュームまたは表面積を選択し、[OK]をクリックします。

データを保存するには、測定メニューをクリックし、測定項目を作成するを選択します。ウィンドウから新しい測定項目を選択します。データのファイル名を入力し、[OK] をクリックします。

最後に、測定データを適切なソフトウェアパッケージにエクスポートして、統計解析を実行し、データプロットを生成します。ここでは、研究者らは、アミロイドベータ140またはアミロイドベータ140とイアンで治療されたラットの固定脳組織のアストロサイトを比較しました。アミロイドタンパク質による治療注射により、より太く長い枝を持つアストロサイトが得られました。

イアンで処理した動物由来のこれらのアストロサイトは、短くて細い枝を持つ星状の形でした。イアンで処理したラットは、脳切片におけるアストロサイトGFAP陽性蛍光の減少も示しました。特定のアストロサイトの体積の形態計測解析により、アストロサイトの核、細胞体全体、アストロサイト領域の体積が、アミロイド治療単独と比較して、イアン治療によって減少することが明らかになりました。

この画像をマスターすると、適切に実行されれば、分析手法はセルあたり数分で完了できます。この手順を試行するときは、構造を高精度でマークすることが重要です。開発後の実験を開始する前に、関心のある構造を手動でマークする練習をするのが最善です。

この技術は、細胞生物学、組織学、病理学の分野の研究者が、健康な環境や病気の状況で細胞の構造を探求する道を開きました。このビデオを見た後、3D画像を使用して1つのセルの12の異なるパラメータを測定する方法を十分に理解しているはずです。