アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

この手順の全体的な目的は、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析し、アストロサイトの形態を評価することです。この手法は、病理学的条件下または介入戦略の効果として、さまざまな細胞型に現れ得る形態学的変化を評価するために使用できます。この技術の主な利点は、細胞構造に関連する多くのパラメータを同時に研究できることです。

Mariam Bodel博士がこの手順を実演します。免疫組織化学染色のためのスライド作成後、キシレンに10分間2回浸し、切片の脱パラフィンを行います。洗浄後、99.8%、95%、70%の各エタノールで10分間ずつインキュベートし、切片を親水化させます。PBSで洗浄後、1:1500に希釈したglial fibrillary acidic protein（GFAP）一次抗体溶液中で、4°Cで一晩インキュベートします。

インキュベーション後、切片をPBSで5分間、3回洗浄します。次に、1:100に希釈したアルカリホスファターゼ標識二次抗体溶液を用い、室温で1時間インキュベートします。使用前30分以内に、再び切片をPBSで5分間、3回洗浄します。

3 mLの基質バッファーに赤色発色剤溶液を1滴加えます。各スライドをこの溶液100 µL中で、暗所で15〜20分間インキュベートします。その後、PBSで5分間ずつ3回スライドを洗浄します。

最後に、PBSで1:500に希釈したDPIで核を染色します。切片にAntifa mediumを1〜2滴滴下し、直ちにカバーガラスで封入します。封入状態を確実にするため、顕微鏡観察前にスライドを4°Cで24〜48時間インキュベートしてください。

共焦点顕微鏡観察を開始するには、スライドを顕微鏡ステージに設置し、63x 対物レンズを選択します。解析ソフトを起動後、「acquisition」タブ内の「smart setup」をクリックし、適切な蛍光フィルターセットを選択します。ここでは、DAPIおよびAlexa Fluor 555を使用します。

次に、[best signal]をクリックし、続いて[apply]をクリックします。その後、[set exposure]をクリックして、コンピュータに最適な露光パラメータを決定させます。画像を最適化するには、[channels]ウィンドウを開き、画像を[live]に切り替えます。必要に応じてフォーカスを調整してください。

次に、ピンホールを最適化するために1つのauをクリックし、最高の強度が得られるようにゲインを調整します。最後に、デジタルゲインを2から3の間に設定します。この最適化が完了したら、ライブイメージを停止し、取得モードウィンドウを開きます。

X by Yをクリックしてフレームサイズを調整し、10 24 by 10 24を選択します。また、スキャン速度は低速（slow speed）を選択してください。次に、平均化（averaging）タブを開き、4以上の数値を選択します。

次に、snapボタンをクリックして、キャプチャした2D画像を保存します。3Dイメージングを設定するには、smart setupタブを開き、ZS stack項目にチェックを入れます。これにより、Zs stackウィンドウが開きます。Zstackの開始位置と終了位置を設定するために、再度liveをクリックし、アストロサイトの最上部までフォーカスを調整します。

まず「set first」をクリックします。次に、フォーカスをアストロサイトの最下位に合わせ、「set last」をクリックしてからライブビューを停止します。続いて、「optimal」をクリックしてインターバルを選択します。

ここでのスライス数を設定します。間隔は1.01 µmです。最後に、「start」および「experiment」をクリックし、スキャンが完了したら画像を保存します。また、10倍または20倍の対物レンズを使用して2D画像を取得してください。

蛍光強度の測定を行うには、画像ウィンドウで長方形または円形ツールを選択し、測定領域を指定して、アストロサイトの核、細胞体、およびテリトリーの体積と表面積を定量化します。3D画像を、解析ソフトウェアのVelocity 6.1などの適切な解析ソフトへ転送します。新しいライブラリを作成し、すべての画像を左側のグレーの列にドラッグします。

3D画像から1枚を選択し、dapiなどの取得済みチャンネルのうち、目的のものを1つオンにします。核の測定を行う場合は、コントラストを最適化するために輝度を手動で調整してください。次に、ツールメニューを選択します。

Make Volumeを選択し、Zack画像から単一の3D画像を生成します。編集メニューを開き、プロパティをクリックします。X、Y、およびZのプロパティが表示されていることを確認してください。

次に、ツールバーからフリーハンドROIツールを選択します。選択したツールを使用して、DPIで標識された核の周囲に線を描き、アストロサイト核の体積と表面積を測定します。同様に、フリーハンドROIツールを用いて、細胞体およびすべての分枝の表面に沿って線を引くことで、アストロサイト全体の体積と表面積を測定します。

画像ウィンドウ上部の測定メニューをクリックし、「find objects」をウィンドウの最上部までドラッグします。population oneに適切な名称を入力し、対応する色を選択して「measure」をクリックすると、新しいウィンドウが開きます。この新しいウィンドウで、パラメータとして「volume」または「surface area」のいずれかを選択し、「okay」をクリックしてください。

データを保存するには、測定メニューをクリックし、「測定作成」項目を選択します。ウィンドウから「新しい測定項目」を選択してください。データのファイル名を入力し、「OK」をクリックします。

最後に、統計解析を行いデータプロットを作成するために、測定データを適切なソフトウェアパッケージにエクスポートします。ここでは、アミロイドβ1-40、またはアミロイドβ1-40とIanで処理したラットの固定脳組織におけるアストロサイトを比較しました。アミロイドタンパク質の注入による処理の結果、アストロサイトの分枝がより太く、かつ長くなることが示されました。

Ian投与動物から得られたこれらのアストロサイトは、短く細い突起を持つ星状の形態を示した。また、Ian投与ラットの脳切片では、アストロサイトのGFAP陽性蛍光が減少していた。特定のアストロサイトの形態計測分析により、アミロイド単独投与群と比較して、Ian投与群ではアストロサイトの核、細胞体、アストロサイト全体、およびアストロサイト領域の体積が減少していることが明らかになった。

この画像処理に習熟すれば、適切に実施することで1細胞あたり数分で解析を完了させることができます。本手順を行う際は、構造を高精度にマーキングすることが重要です。実験の展開後、実際に開始する前に、目的の構造を手動でマーキングする練習をしておくことを推奨します。

この手法は、細胞生物学、組織学、病理学の分野の研究者が、健康な状態または疾患状態における細胞構造を探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、3D画像を用いて単一細胞の12種類の異なるパラメータを測定する方法について、十分に理解することができます。