三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

この手順の全体的な目標は、3次元共焦点蛍光画像から取得した未定義の形状細胞の形態の変化を分析および定量化するための自動化された方法を提供することです。これは、最初にアゴニスト細胞で処理された細胞、アンタゴニストで処理された細胞、続いてアゴニストおよび無処理の細胞を含む化学刺激実験を行うことによって達成されます。その後、細胞を免疫蛍光分析のために調製します。

2番目のステップは、マルチスペクトルの3次元蛍光画像を取得することです。次に、ameris neuroscience、ameris XT、およびMATLABコンピューターソフトウェアを使用して、3次元形態計測解析を行います。3次元の形態計測解析によって視覚化されたシングルセルの表現型の変化は、最終ステップとして分析および定量化されます。

最終的に、このソフトウェアプラットフォームは、受容体活性化後の細胞形状の変化を定量化するために使用され、創薬のための追加ツールを提供します。一般に、研究者は生物学的システムに関する標準的な専門知識を持っていますが、コンピューターアプリケーションに精通していない場合があります。I 60モジュールのこのプロトコルでは、この手順を開始する前に、de視覚化とコンピューター言語の間のギャップを埋めます。

ヒト胚性腎臓細胞を、書面によるプロトコルで参照されているように、ヘマグルチニンタグ付きコルチコトロピン放出因子受容体2またはCRF R 2でトランスフェクトします。CFR 2は、Gタンパク質共役受容体またはGPCRです。トランスフェクションの翌日、フレームカバーが滑り落ち、6ウェルプレートに入れます。

5ミリグラムの凍結乾燥ポリリジンのバイアルに10ミリリットルのPBSを加えて混合します。次に、5ミリリットルの溶解ポリリジンを500ミリリットルのPBSで希釈し、各カバースリップに2ミリリットルの混合物を追加します。プレートをカバースリップと一緒に室温で20分間放置します20分後、2ミリリットルのPBSを追加してカバースリップを洗い、次に取り外し、このプロセスを2回繰り返します。

10%FBS培地を含む2ミリリットルのDMEMのエディションに続いて、カバースリップに2〜5滴のセルを追加します。細胞は、60%coの流暢さを達成するために必要な濃度にある必要があります。翌日。

翌日、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。アゴニスト治療のために細胞が60%コンフルエントであることを確認してください。1マイクロモルの濃度でCRF R 2つの内因性リガンドコルチコトロピン放出因子を補充した2ミリリットルの培地で培地を置き換えることにより、指定された細胞を刺激します。

を摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートし、アンタゴニストで前処理する細胞を探します。培地を、1マイクロモルの濃度で選択的CFR2アンタゴニスト抗サルベージ30を補充した2ミリリットルの培地と交換します。細胞を摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートします。

拮抗薬治療後。アゴニストCRFで細胞を刺激し、未処理の細胞について摂氏37度で30分間インキュベートします。治療後は、メディアを2ミリリットルの新鮮なメディアと交換してください。

各ウェルの培地を2ミリリットルの新鮮な培地と交換し、1〜1000に希釈した抗HHAを添加し、その後、摂氏37度で60分間インキュベーションします。メディアを吸引し、それぞれに2ミリリットルの固定剤を追加します。固定液を吸引した後、プレートを室温で20分間よくインキュベー

トリスパファー生理食塩水で細胞を3回洗浄します。カイン。各カバーの上に100マイクロリットルの血液溶液を加え、滑らせて室温で30分間インキュベートします。次に、ウェルから既存のブロット溶液を吸引し、室温で45分間の暗所洗浄後、TBSCで45分間インキュベートした後、最終洗浄液中にウェルの側壁から溶液を穏やかに追加および除去することにより、各カバースリップに100マイクロリットルの新鮮な二次抗体カクテルを追加します。

針と湾曲した鉗子で各カバースリップを拾います。カバースリップセルを下向きにしてスライドに置き、マニキュアで軽く固定したベクトルシールド封入剤を滴下してスライドに置き、15〜20分間乾燥させます。Alexa、4 88ナノメートルのコンジュゲートミューズ抗体を使用してCFR 2を視覚化し、DAPIを使用して核の有糸分裂段階を視覚化し、固定細胞を蛍光顕微鏡にマウントして実験の主観性を制限し、画像を取得して画像を取得するまで実験条件を不明に保ちます。

63倍倍、開口数1.4のDIC対物レンズを、コヒーレントな統合2光子レーザーシステムに接続されたzeis LSM five 10メタ共焦点顕微鏡と組み合わせて使用 データ取得プロセス中に、マルチチャンネルとc分割の両方で細胞を区画化し、核膜から細胞外受容体四肢までのデータを含めました。amrisを使用して蛍光データを処理すると、3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションが可能になります。まず、Amarisが設計したアルゴリズムに従って、表面レンダリングを利用してNU核膜を表現します。

Amarisは、対象領域に複数の核があるかどうか、つまりROIを判断します。次に、スポット作成アルゴリズムを使用して、CFR の 2 つの拡張スポットを特定します。CFR 2の蛍光検出の各単位の包含を最大化するために、アモルファス形状の細胞の複雑なネットワークのバックグラウンドノイズと不規則な強度を補償し、スポットの直径を画像内の最小単位である0.2マイクロメートルに設定します。

これにより、測定された強度の形で異なる情報を外挿することができます。ガウス フィルターを使用して、スポットの自動作成プロセスにスポット フィルターを組み込みます。データ カチオンを回避するには、データセットを 8 ビット固定小数点から 32 ビット浮動小数点に変換します。

作成したサーフェスを選択し、核膜を基準点として距離変換を行うことで、核サーフェスの外側の各スポットの正確な空間位置を決定します。MATLAB とインターフェースされた ameris XT モジュールを使用して、ボクセル強度データをスポット座標データに交換します。スポットを選択し、統計タイプで統計コードを選択します。

作成した新しいチャネルで報告された強度の中心を選択します。表示用の色をロードし、分析用のカラーマップ範囲を設定します。数値データは統計タブで視覚化し、GraphPadプリズムを使用してExcelにエクスポートできます。

結果のデータを定量化し、統計分析のためにグラフ形式で表示します。二元配置の Inova と Bonferroni を使用してグループ間の比較を実行し、テスト後にデータを平均プラスまたはマイナス標準偏差として表示します。このアプローチの力を実証するために、Gタンパク質共役受容体とコルチコトロピン放出因子受容体2とその内因性リガンドCRFとの相互作用から生じる細胞変化。

トランスフェクトしたHT K2 93細胞を定量化した、Alexa4 88標識、抗マウス、二次抗体、およびDPIを用いて結合した画像を可視化し、核を可視化した。その結果、CRF Rの2つの受容体が原形質膜に位置し、細胞膜の有限領域から突出していることが明らかになりました。従来の2D解析では、ガラスカバー上の受容体接着点を解析した場合のみ、この細胞外CRF R 2受容体のサブセットを検出することが可能でした。

その結果、ZS スタック MULTISPECTRAL データから得られるその他の情報はすべて失われます。その結果、無治療とアゴニストの間に差はなかった。細胞をCRFで処理すると、受容体の接着点は劇的に異なりますが、細胞外受容体は、原形質膜からのスポットの距離の減少によって示されるように大幅に減少します。

また、主に有限の場所から、いくつかの目立たない場所に再分配されます。受容体膜分布に対するCRFの影響は、CRの2つの特異的アンタゴニストによる前処理によって防止されます。30 30。

これらの条件下では、CRFRの2つの延長はCRF処理によって変化しません。5マイクロメートルのスペクトルの色分けされた間隔でプロットされたスポットの遠位分布は、核膜からのボクセルの距離を視覚化するために使用されます。無治療およびアゴニスト治療前のアンタゴニスト前治療では、GPCRの収縮に有意差は認められなかった。

アゴニストCRFによる細胞の処理は、無処理または細胞と比較して、CFR 2含有ボクセルの数を徐々に減少させる。彼の開発後、拮抗薬Asで前処理されました。この技術は、定量イメージング技術の分野の研究者が多数のシングルセル表現型の変化を探求し、特徴付ける方法を提供し、この細胞ベースのアッセイを創薬プロセスのための追加のシングルセルプロファイリングツールにしました。