Name: 三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ三次元蛍光画像を用いた細胞形態変化の自動定量解析法。ImarisとMATLABで不定形細胞の形態変化を解析し、創薬研究における受容体活性化の効果評価に応用する。

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我々はImaris、Imaris XTとMatlabの使用のためにカリフォルニアの生体イメージング技術開発センター（BIDC）大学サンフランシスコ校に感謝します。我々は、原稿の編集への貢献のためにLK Floren、L. Daitch、技術支援のために、ヘンリーVでKharaziaに感謝します。 1R21DA029966-01と薬局のSEBは、UCSFの学校にMLSMRコレクションをスクリーニングするためのNIHのファストトラック賞（：この作品は、SEB、国立衛生研究所（NIH）にUCSFを通じてアルコール＆薬物乱用のカリフォルニア医学研究の国家からの資金によって支えられディーンのOfficeと臨床薬学）とCLHKに医学部（臨床薬理·実験治療）。

1。シングルセル表現型変化の三次元形態計測分析<ol><li>ヒト胚腎臓（HEK293）細胞をトランスフェクションした赤血球凝集素（HA）コルチコトロピンとしてGタンパク質共役受容体（GPCR）は、以前4 5因子受容体2（CRF-R2）の説明解放タグ付き。 </li><li>細胞は、AS（CRF-R2の内因性リガンド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、CRF（1μM、30分）、または選択CRF-R2の拮抗薬、抗ソーバジン30で前処理で刺激し、（無治療、NT）、未処理のままにした-30、1μM、アゴニスト処理前30分）。 </li><li>次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗HAで処理した。 CRF-R2はアレクサ594 nmの抱合抗マウス抗体（IgG 1）抗体を用いて可視化した。 DAPIを核分裂段階を可視化するために使用されていました。 </li><li>実験者の主観性を制限するために、実験条件は、画像が取得され、分析された後まで知られていなかった。 </li><li>我々は、画像を取得しましたプラン·アポクロマート63x/1.4油DIC目的とヴェルディ-V5レーザーとミラ900-Fのレーザーシステムで構成コヒーレント統合された二光子レーザーシステムに接続されたZeiss LSM 510 META共焦点顕微鏡を用いて固定したHEK293細胞からだ。 </li><li>データ収集プロセスの間に、細胞は両外側の細胞外受容体に核膜からのデータを含めるようにマルチスペクトルセクショニング、488 nm、および790 nmの（〜350 nmの2PH例）およびzパーティショニング（0.5μm刻み）によって区画された四肢。 </li><li>蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを使用して処理され、立方ボクセルから成る3Dモデルは形態学的分析のために作成されました。 その後、Imaris XTモジュールは、GPCRの拡張の座標点を決定するために、MATLABのコンピュータプログラム言語とのインタフェースImarisに利用されました。 アカウントセルラーばらつきを考慮するために、我々は蛍光画像鐸を取得し、分析22細胞からEN：アゴニスト治療（n = 7）の前に無治療（NT）（n = 7）で、アゴニスト（CRF）の治療（n = 8）および拮抗薬による前治療（AS-30）（ 図2） 。 <ol><li>関心領域（ROI）は、アクティブ分裂の段階ではなく、他の細胞に接近していない一つのセルを含める必要があります。このように、分析は1つの核とレセプターの拡張子を持つ細胞が他の細胞の近接によって乱されていないが含まれます。 </li><li>細胞の3D構造は、第1 Imaris（v.7.1.1）を使ってマルチスペクトル蛍光データから再構築されました。 </li><li> Imarisによって設計されたアルゴリズムに続いて、第一面のレンダリングは核膜を表すために利用された。 ROI内の複数の核がある場合Imarisあるかどうかを判別します。 </li><li>次にスポット作成のアルゴリズムは、CRF-R2の拡張子を検索するために利用された。それがバックグラウンドノイズとの不規則な強度を補償するため、スポットの検出を利用したアモルファス状の細胞の複雑なネットワーク。 </li><li> CRF-R2の蛍光検出の各ユニットの含有を最大化するために、スポット &#39;直径はガウシアンフィルタを用いて測定された強度の形で明確な情報を推定する画像内の最小単位である0.2μm以下に設定した。スポットフィルタリングがスポット自動作成プロセスに組み込まれました。ソフトウェアは、しかし、ユーザにパラメータを定義するには、フィルタを使用するための柔軟性を与える。 </li><li>データの切り捨てを回避するために、データ·セットは、32ビットの小数に、8ビット（符号なし）固定点から変換された。 </li><li>ボクセル強度データは、MATLABとのインタフェースImaris XTのモジュールを使用して座標データを発見するために交換し、各スポットの正確な空間的位置は、基準点（ 図3）のように核膜を用いた距離変換を実行することによって決定された。 </li></ol></li><li>得られたデータは、sのためのグラフィカル形式で定量化し、提示することができるtatistical分析。群間の比較は、二元配置ANOVAとBonferroniの事後テストを用いて行った。データは平均±SDとして提示されます。違いは、* p &lt;0.05で有意であると見なされている。計算は、GraphPad Prism 5.02（ 図4）を用いて行った。 </li></ol> 2。代表的な結果我々のアプローチの力を発揮するために、我々は細胞の変化を定量化しているGタンパク質共役受容体（GPCR）と副腎皮質刺激ホルモン放出因子、トランスフェクトしたHEK293細胞での内因性リガンドとレセプターのCRF-2（CRF-R2）の相互作用から生じる。 我々は、CRF-R2受容体は細胞（ 図2Aおよびムービー1）の膜の有限地域から原形質膜とプロジェクトに配置されていることを示している。従来の2次元解析を用いて、それは我々が受容体の接着poを分析する場合にのみ、外CRF-R2受容体のこの部分集合を検出することが可能であるガラス上のintはカバーしています。その結果、私たちは、Z-スタック型マルチスペクトルデータ（ 図5）から派生した他の情報が失われます。 形質膜からスポットまでの距離の減少によって示されるように、細胞はCRFで処理されると、細胞外受容体は大幅に削減されます。彼らはまた、主に有限の場所から離散した位置（ 図2Bと映画2）の数に再配布されます。 レセプター膜分布にCRFの効果は、CRF-R2の特異的アンタゴニスト、antisavagine 30（AS-30）を用いた前処理により防止と私たちは、CRF-R2の拡張子は（ 図2Cおよびムービー3）変更しないことを見つけることです。 スポットの遠位分布は、5μmのスペクトル色分けされた間隔でプロット核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。無治療と拮抗pretreatmんENT（AS-30、1μM、30分）アゴニスト治療の前には（CRF、1μM、30分）、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）が徐々に無治療と比較したCRF-R2の含有ボクセル、0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（の数を減らし**はp &lt; 0.01）、&gt; 15μm以下（*** P &lt;0.005）、またはAS-30治療、0から10ミクロン（ナノ秒）、11から15ミクロン（** p &lt;0.01）とに比べて&gt; 15ミクロン（*** P &lt;0.005）（ 図4）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> 図1。現在利用可能な技術と蛍光画像を分析する彼らの限界の図は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt;図2アゴニストおよびアンタゴニスト処理前と処理後のHA-CRF-R2を使用して、HEK293トランスフェクトされた細胞の3次元マルチスペクトル蛍光画像。マージされたイメージを示す抗HAを使用して、HA-CRF-R2は、プローブおよびAlexa 488標識抗マウス抗体（IgG 1）二次抗体を用いて可視化し、DAPIで核を可視化するために使用されていました。画像は、共焦点レーザー走査（CLS）に顕微鏡を用いて取得した。スケールバーは5μm。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> 図3：HA-CRF-R2を使用して、HEK293、トランスフェクトされた細胞の3次元モデルがImarisソフトウェアを使用して、CLSの画像から再構築。小胞に変換GPCRの拡張を記述する核とスポット作成の表面レンダリング。蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを用いて処理した。その後、Imaris XTは、MATLABとのインタフェースImarisに利用されました。ボクセル強度に交換しましたスポット座標。スポットスペクトル色分け（青0から5ミクロン、緑、6-10ミクロン、11から15μmの黄色と赤&gt; 15μm）の距離形核膜を表しています。スケールは5μm。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> 図4スポットの遠位分布のグラフィック表現が5μm間隔でコード化されたスペクトル色にプロットは核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。アゴニスト処理前の拮抗（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）と無治療と前処理は、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。治療なし0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（**はpと比較した場合、アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）は、徐々に数CRF-R2を含むボクセルの距離が短縮され&lt;0.01）、&gt; 15μm以下（*** P &lt;0.005）、またはAS-30 0から10μmの治療（ns）で、11月15日<html>ミクロン（** p &lt;0.01）および&gt; 15ミクロン（*** P &lt;0.005）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> 図5：HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の二次元形態計測分析の限界。核の中心を示す細胞の中央平面部（ガラスカバースリップ上の3-4μmで）はDAPIおよびHA-CRF-R2を用いて可視化抗-HAを使用してプローブとAlexa 488nmの結合抗マウス抗体（IgG 1）二次を用いて可視化受容体の付着点が劇的に異なっていながら、抗体とCLSで取得したが、（A）は無治療（NT）と（B）のアゴニスト（CRF、1μM、30分）の間に違いを見せていない。 映画は1。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の&quot;サーパス&quot;モードでは、無治療で3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。/ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;ムービーを見るにはここをクリックしてください。 映画は2。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞、アゴニスト処理、CRF（CRF、1μM、30分）の&quot;サーパス&quot;モードで3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリックしてください。</a> ムービーのHA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の&quot;サーパス&quot;モードで3。自由に回転する3D、アゴニスト処理前の拮抗薬を用いた前処理（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価する。 5〜20μmであるからスケールバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリックしてください。</a>

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<li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.c+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li>
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<li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li>
<li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、CRFの治療は、その形態やCRF-R2の位置に大きな変化を誘導することを示した。 CRF-R2の変化は選択的アンタゴニスト処理により抑制された。我々は、受容体の変更が検出されなかった、標準的な2Dマルチスペクトル技術を用いて測定することができないことを示した。複雑な3D映像を勉強する能力が形態学的分析のための生物学的パラメーターの複雑さを取り入れることが重要です。我々は、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントとの事前に定義された形状はなく細胞の3次元測定を行うことができました。ユーザーによる変更が可能な自動化された方法の私達のスイートは、細胞動態に関する情報を抽出するために、その環境内の個々のアモルファス状の細胞内の分子動態を定量化することを可能にします。このツールは、阻害剤の存在下で細胞経路と細胞形態の変化に関する薬理化合物の効果についての予測を行い、細胞の生存に関する情報を提供するために助けることができます。 当社の3D定量法の利点は、それが広範な生物学メカニズムの専門知識が、コンピュータコードに精通していない、と研究者は、コンピュータのアプリケーションと顕微鏡技術...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ヒト胚腎臓（HEK293） </td><td>アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクション</td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488（IgG2bで） </td><td>インビトロジェン</td><td> -11001 </td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗HA.11抗体（IgG 1） </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td>シグマ</td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30（AS-30） </td><td>シグマ</td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

蛍光画像を測定するための最も一般的なソフトウェア分析ツールは、2次元（2D）のデータポイントの包含と除外のためのマニュアル設定に依存するデータ、分析の解釈と所見をサポートするためにコンピュータ支援パターン認識のためのものです。それは、細胞ダイナミクスの複雑さをキャプチャし、生物系内の細胞の可塑性の基礎を理解することができるようにするために、3次元（3D）データセットから構成され、蛍光像を測定することができるようにすることがますます重要になってきている。洗練された顕微鏡の楽器は、マルチスペクトル蛍光画像の取得と、収集した2D画像の3D表現を提供する共焦点スタックから画像を再構成する強力な解析ソフトウェアを介して3次元蛍光画像の可視化を許可されています。先進的なデザインをベース立体学法は、原送信の近似や仮定から進展している複雑な組織切片でも2リットルモデルベースの立体学1。顕微鏡でこれらの科学的進歩にもかかわらず、必要性が完全に細胞形態、タンパク質の局在化と受容体の輸送の複雑な変化の分析と定量化を可能にするために本質的な3Dデータを活用して自動化された分析方法のために残してあります。 蛍光画像を定量化することが可能な現在の技術は、メタモーフ（Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール）とマニュアル分析を提供する画像J（NIH）を含む。 Imaris（アンドール·テクノロジー、ベルファスト、北アイルランド）ソフトウェアは、ボリューム·イメージに入れたり、3Dオブジェクトを作成するには、2Dスライスのシリーズで描くことができる測定ポイントの手動作成を可能にする機能MeasurementProを提供します。このメソッドは、2つのオブジェクト間のラインの距離を測定したり、関心のある領域を囲むポリゴンを作成するためにシングルクリックポイント測定に便利ですが、それはCOMPLに適用することは困難である旧セルラーネットワーク構造。フィラメントトレーサー（アンドール）ただし、このモジュールはそのような樹状突起、軸索と棘（構造木のような）で構成されている神経細胞のように定義された構造を測定するために開発されたフィラメント状の3D神経を自動的に検出します。このモジュールは、巧妙に非神経細胞3への形態学的測定を行うために利用されているが、出力データではなくアモルファス状の細胞モデルというより定義されたセルの形状に依存するソフトウェアを使用して拡張セルラーネットワークの情報を提供します。アモルファス状の細胞を分析し、生物学的なアプリケーションへのソフトウェアは、より適切な意思の問題を克服するために、ImarisはImaris Cellを開発しました。これは、細胞内小器官との間の関係を計算するために開発されたEidgenössische工科音楽大学との科学的なプロジェクトだった。ソフトウェアは、セルごとに1つの原子核を強制することにより、生物学的な制約の検出を可能にしますが、およびセグメント細胞に細胞膜を使用して、それが理想的には空隙なしで細胞表面を作成するため、連続していない蛍光データを分析するために利用することはできません。我々の知る限り、現時点では3Dの蛍光画像から地形情報を提供するには、ユーザーによる変更が可能な自動化されたアプローチは、未定義の形状（ 図1）の細胞空間情報を達成することが開発されていない。 我々は、MATLAB（マットワークス株式会社）にインターフェースImarisコアソフトウェアモジュールとImaris XTを使用して分析プラットフォームを開発しました。これらのツールは、事前定義された形状とすることなく、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントを持つ細胞の三次元計測を可能にします。さらに、この方法は、コンピュータのアプリケーションに精通している生物学的システムの専門知識を拡張しますが、していない研究者は、細胞動態の形態学的変化の定量を行うことができます。

我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。

蛍光画像を測定するために利用可能な最も一般的なソフトウェア解析ツールは、2次元（2D）データ用であり、...のための手動設定に依存しています。

この手順の全体的な目的は、3次元共焦点蛍光画像から得られた不定形細胞の形態変化を分析および定量化するための自動化された手法を提供することです。これは、まず、アゴニスト処理細胞、アンタゴニスト処理後のアゴニスト処理細胞、および無処理細胞を含む化学刺激実験を行い、続いて免疫蛍光分析のための細胞調製を行うことで達成されます。第2ステップでは、マルチスペクトル3次元蛍光画像を取得します。次に、ameris neuroscience、ameris XT、およびMATLABコンピュータソフトウェアを用いて、3次元形態計測分析を行います。最終ステップとして、3次元形態計測分析によって可視化された単一細胞の表現型の変化を分析し、定量化します。最終的に、このソフトウェアプラットフォームは、受容体の活性化後に生じる細胞形状の変化を定量化するために使用され、創薬における追加のツールとなります。一般的に、研究者は生物学的システムに関する標準的な専門知識を有していますが、コンピュータアプリケーションには習熟していない場合があります。本プロトコルのI 60モジュールでは、この手順を開始する前に、可視化とコンピュータ言語の間の隔たりを埋めます。書面の手順に従い、ヒト胚性腎細胞にヘマグルチニンタグ付きの副腎皮質刺激放出因子受容体2（CRF R2）をトランスフェクトします。CRF R2はGタンパク質共役受容体（GPCR）です。トランスフェクションの翌日に、カバーガラスを火炎滅菌し、6ウェルプレートに入れます。5 mgの凍結乾燥ポリリジンが入ったバイアルに10 mLのPBSを加え、混合します。次に、溶解したポリリジンの5 mLを500 mLのPBSで希釈し、その混合液を各カバーガラスに2 mLずつ加えます。カバーガラスを載せたプレートを室温で20分間放置します。20分後、2 mLのPBSを加えてから除去することでカバーガラスを洗浄し、この工程を2回繰り返します。10% FBSを含むDMEMを2 mL添加した後、カバーガラス上に細胞を2〜5滴滴下します。細胞は、コンフルエンシーが60%に達するのに必要な濃度に調整してください。翌日、翌日、細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。アゴニスト処理に向けて、細胞のコンフルエンシーが60%であることを確認してください。培地を、1 µMの濃度でCRF R2内因性リガンドであるcorticotropin releasing factorを添加した2 mLの培地に交換し、指定した細胞を刺激します。拮抗剤による前処理を行うため、細胞を37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。培地を、1 µMの濃度で選択的CFR2拮抗剤anti salvaging 30を添加した2 mLの培地に交換します。細胞を37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。アンタゴニスト処理後、アゴニストであるCRFで細胞を刺激し、未処理細胞については37 °Cで30分間インキュベートします。処理後、培地を2 mLの新鮮な培地で交換します。各ウェルの培地を2 mLの新鮮な培地に交換し、37 °Cで60分間インキュベートした後、1,000倍に希釈したanti HHAを添加します。培地を吸引し、各ウェルに2 mLの固定液を加えます。固定液を吸引した後、プレートを室温で20分間インキュベートします。細胞をトリス緩衝生理食塩水（TBSC）で3回洗浄します。各カバーガラスの上にブロッキング溶液を100 µL添加し、室温で30分間インキュベートします。その後、ウェルから既存のブロッキング溶液を吸引し、新鮮な二次抗体カクテルを各カバーガラスに100 µL添加します。暗所で室温にて45分間インキュベートした後、ウェルの側壁から緩やかに溶液を添加および除去する方法で、TBSCを用いて4回洗浄します。最後に、洗浄溶液を入れたままの状態にします。針と曲尖鑷子を用いて、カバーガラスを1枚ずつ取り出します。Vector Shield封入剤を1滴滴下したスライドガラス上に、カバーガラスの細胞面を下にして配置し、爪用ポリッシュで固定して15～20分間乾燥させます。CFR2を可視化するためにAlexa 488 nm共役マウス抗体を、核の有糸分裂期を可視化するためにDAPIを使用します。固定した細胞を蛍光顕微鏡に載せ、実験的な主観性を排除するため、画像の取得および解析が完了するまで実験条件を伏せた状態で画像を撮影します。Zeiss LSM 510 Meta共焦点顕微鏡にCoherent社製統合2光子レーザーシステムを接続し、プランアクロマットオイル浸 objectives（倍率63倍、開口数1.4）を用いて観察しました。データ収集プロセスにおいて、核膜から細胞外受容体の末端に至るまでのデータが含まれるよう、マルチチャンネルおよびz軸方向のパーティショニングによって細胞を区画化しました。蛍光データは、3D顕微鏡データセットの可視化およびセグメンテーションが可能なAmarisを用いて処理しました。Amarisで設計されたアルゴリズムに従い、まずサーフェスレンダリングを用いて核膜を表現しました。Amarisを用いて、関心領域（ROI）内に複数の核が存在するかどうかを判定します。次に、スポット作成アルゴリズムを利用して、CFR twoの2つの伸長スポットを特定します。非晶形細胞の複雑なネットワークによるバックグラウンドノイズや不規則な強度を補正し、CFR twoの蛍光検出ユニットを最大限に取り込めるようにするため、スポットの直径を画像内での最小単位である0.2 µmに設定します。これにより、測定された強度という形式で個別の情報を外挿することが可能になります。ガウスフィルターを用いて、スポットの自動作成プロセスにスポットフィルタリングを組み込みます。データの飽和を避けるため、データセットを8ビット固定小数点から32ビット浮動小数点に変換します。作成したサーフェスを選択し、核膜を基準点として距離変換を行うことで、核表面の外側にある各スポットの正確な空間的位置を決定します。MATLABとインターフェースされたameris XTモジュールを用いて、ボクセル強度データをスポット座標データに変換します。スポットを選択し、統計タイプで統計コードを選択します。新しく作成されたチャンネルで報告された強度中心を選択してください。表示させたい色を読み込み、解析用のカラーマップ範囲を設定します。数値データは統計タブで可視化し、GraphPad prismを用いてExcelにエクスポートできます。得られたデータを定量化し、統計解析のためにグラフ形式で提示します。二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびBonferroniポストテストを用いて群間比較を行い、データは平均値 ± 標準偏差として提示します。この手法の有用性を示すため、Gタンパク質共役受容体およびコルチコトロピン放出因子受容体2と、その内因性リガンドであるCRFとの相互作用によって生じる細胞変化を解析します。トランスフェクトしたHT K 2 93細胞において、統合画像を用いて定量化を行い、Alexa 4 88結合抗マウス二次抗体および核を可視化するためのDPIを用いて視覚化した。その結果、CRF R two受容体は細胞の細胞膜に位置し、膜の限局的な領域から突出していることが明らかになった。従来の2D解析を用いた場合、ガラスカバー上の受容体接着点を解析したときにのみ、この細胞外CRF R two受容体のサブセットを検出することが可能である。その結果、ZS積層マルチスペクトルデータから得られるその他の情報はすべて失われます。その結果、無処理群とアゴニスト投与群との間に差は認められませんでした。細胞をCRFで処理した場合、受容体の接着点は劇的に変化しますが、スポットから形質膜までの距離が短縮していることからわかるように、細胞外受容体は大幅に減少しています。また、それらは主に限定的な場所から、多数の離散的な場所へと再分布されます。受容体の膜分布に対するCRFの影響は、CR2特異的アンタゴニストによる前処理によって阻止されます。30 30。これらの条件下では、CRFRの2つの伸長領域はCRF処理によって変化しません。5 µmの間隔でスペクトル色分けされたスポットの遠位分布を用いて、核膜からボクセルまでの距離を可視化します。無処理およびアゴニスト処理前のアンタゴニストによる前処理では、GPCRの収縮に有意な差は見られませんでした。アゴニストであるCRFで細胞を処理すると、未処理の場合や、アンタゴニストによる前処理を行った場合と比較して、CFR 2を含むボクセルの数が段階的に減少します。この手法は、定量的イメージング技術の分野の研究者が、数多くの単一細胞の表現型変化を探索・特性解析することを可能にし、この細胞ベースのアッセイを創薬プロセスにおける新たな単一細胞プロファイリングツールとして位置づけました。

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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Cell-ACDCを用いた多次元顕微鏡データの解析

学ぶ三次元蛍光画像を用いた細胞形態変化の自動定量解析法。ImarisとMATLABで不定形細胞の形態変化を解析し、創薬研究における受容体活性化の効果評価に応用する。

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

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