三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

この手順の全体的な目的は、3次元共焦点蛍光画像から得られた不定形細胞の形態変化を分析および定量化するための自動化された手法を提供することです。これは、まず、アゴニスト処理細胞、アンタゴニスト処理後のアゴニスト処理細胞、および無処理細胞を含む化学刺激実験を行い、続いて免疫蛍光分析のための細胞調製を行うことで達成されます。

第2ステップでは、マルチスペクトル3次元蛍光画像を取得します。次に、ameris neuroscience、ameris XT、およびMATLABコンピュータソフトウェアを用いて、3次元形態計測分析を行います。最終ステップとして、3次元形態計測分析によって可視化された単一細胞の表現型の変化を分析し、定量化します。

最終的に、このソフトウェアプラットフォームは、受容体の活性化後に生じる細胞形状の変化を定量化するために使用され、創薬における追加のツールとなります。一般的に、研究者は生物学的システムに関する標準的な専門知識を有していますが、コンピュータアプリケーションには習熟していない場合があります。本プロトコルのI 60モジュールでは、この手順を開始する前に、可視化とコンピュータ言語の間の隔たりを埋めます。

書面の手順に従い、ヒト胚性腎細胞にヘマグルチニンタグ付きの副腎皮質刺激放出因子受容体2（CRF R2）をトランスフェクトします。CRF R2はGタンパク質共役受容体（GPCR）です。トランスフェクションの翌日に、カバーガラスを火炎滅菌し、6ウェルプレートに入れます。

5 mgの凍結乾燥ポリリジンが入ったバイアルに10 mLのPBSを加え、混合します。次に、溶解したポリリジンの5 mLを500 mLのPBSで希釈し、その混合液を各カバーガラスに2 mLずつ加えます。カバーガラスを載せたプレートを室温で20分間放置します。20分後、2 mLのPBSを加えてから除去することでカバーガラスを洗浄し、この工程を2回繰り返します。

10% FBSを含むDMEMを2 mL添加した後、カバーガラス上に細胞を2〜5滴滴下します。細胞は、コンフルエンシーが60%に達するのに必要な濃度に調整してください。翌日、

翌日、細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。アゴニスト処理に向けて、細胞のコンフルエンシーが60%であることを確認してください。培地を、1 µMの濃度でCRF R2内因性リガンドであるcorticotropin releasing factorを添加した2 mLの培地に交換し、指定した細胞を刺激します。

拮抗剤による前処理を行うため、細胞を37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。培地を、1 µMの濃度で選択的CFR2拮抗剤anti salvaging 30を添加した2 mLの培地に交換します。細胞を37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。

アンタゴニスト処理後、アゴニストであるCRFで細胞を刺激し、未処理細胞については37 °Cで30分間インキュベートします。処理後、培地を2 mLの新鮮な培地で交換します。

各ウェルの培地を2 mLの新鮮な培地に交換し、37 °Cで60分間インキュベートした後、1,000倍に希釈したanti HHAを添加します。培地を吸引し、各ウェルに2 mLの固定液を加えます。固定液を吸引した後、プレートを室温で20分間インキュベートします。

細胞をトリス緩衝生理食塩水（TBSC）で3回洗浄します。各カバーガラスの上にブロッキング溶液を100 µL添加し、室温で30分間インキュベートします。その後、ウェルから既存のブロッキング溶液を吸引し、新鮮な二次抗体カクテルを各カバーガラスに100 µL添加します。暗所で室温にて45分間インキュベートした後、ウェルの側壁から緩やかに溶液を添加および除去する方法で、TBSCを用いて4回洗浄します。最後に、洗浄溶液を入れたままの状態にします。

針と曲尖鑷子を用いて、カバーガラスを1枚ずつ取り出します。Vector Shield封入剤を1滴滴下したスライドガラス上に、カバーガラスの細胞面を下にして配置し、爪用ポリッシュで固定して15～20分間乾燥させます。CFR2を可視化するためにAlexa 488 nm共役マウス抗体を、核の有糸分裂期を可視化するためにDAPIを使用します。固定した細胞を蛍光顕微鏡に載せ、実験的な主観性を排除するため、画像の取得および解析が完了するまで実験条件を伏せた状態で画像を撮影します。

Zeiss LSM 510 Meta共焦点顕微鏡にCoherent社製統合2光子レーザーシステムを接続し、プランアクロマットオイル浸 objectives（倍率63倍、開口数1.4）を用いて観察しました。データ収集プロセスにおいて、核膜から細胞外受容体の末端に至るまでのデータが含まれるよう、マルチチャンネルおよびz軸方向のパーティショニングによって細胞を区画化しました。蛍光データは、3D顕微鏡データセットの可視化およびセグメンテーションが可能なAmarisを用いて処理しました。Amarisで設計されたアルゴリズムに従い、まずサーフェスレンダリングを用いて核膜を表現しました。

Amarisを用いて、関心領域（ROI）内に複数の核が存在するかどうかを判定します。次に、スポット作成アルゴリズムを利用して、CFR twoの2つの伸長スポットを特定します。非晶形細胞の複雑なネットワークによるバックグラウンドノイズや不規則な強度を補正し、CFR twoの蛍光検出ユニットを最大限に取り込めるようにするため、スポットの直径を画像内での最小単位である0.2 µmに設定します。

これにより、測定された強度という形式で個別の情報を外挿することが可能になります。ガウスフィルターを用いて、スポットの自動作成プロセスにスポットフィルタリングを組み込みます。データの飽和を避けるため、データセットを8ビット固定小数点から32ビット浮動小数点に変換します。

作成したサーフェスを選択し、核膜を基準点として距離変換を行うことで、核表面の外側にある各スポットの正確な空間的位置を決定します。MATLABとインターフェースされたameris XTモジュールを用いて、ボクセル強度データをスポット座標データに変換します。スポットを選択し、統計タイプで統計コードを選択します。

新しく作成されたチャンネルで報告された強度中心を選択してください。表示させたい色を読み込み、解析用のカラーマップ範囲を設定します。数値データは統計タブで可視化し、GraphPad prismを用いてExcelにエクスポートできます。

得られたデータを定量化し、統計解析のためにグラフ形式で提示します。二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびBonferroniポストテストを用いて群間比較を行い、データは平均値 ± 標準偏差として提示します。この手法の有用性を示すため、Gタンパク質共役受容体およびコルチコトロピン放出因子受容体2と、その内因性リガンドであるCRFとの相互作用によって生じる細胞変化を解析します。

トランスフェクトしたHT K 2 93細胞において、統合画像を用いて定量化を行い、Alexa 4 88結合抗マウス二次抗体および核を可視化するためのDPIを用いて視覚化した。その結果、CRF R two受容体は細胞の細胞膜に位置し、膜の限局的な領域から突出していることが明らかになった。従来の2D解析を用いた場合、ガラスカバー上の受容体接着点を解析したときにのみ、この細胞外CRF R two受容体のサブセットを検出することが可能である。

その結果、ZS積層マルチスペクトルデータから得られるその他の情報はすべて失われます。その結果、無処理群とアゴニスト投与群との間に差は認められませんでした。細胞をCRFで処理した場合、受容体の接着点は劇的に変化しますが、スポットから形質膜までの距離が短縮していることからわかるように、細胞外受容体は大幅に減少しています。

また、それらは主に限定的な場所から、多数の離散的な場所へと再分布されます。受容体の膜分布に対するCRFの影響は、CR2特異的アンタゴニストによる前処理によって阻止されます。30 30。

これらの条件下では、CRFRの2つの伸長領域はCRF処理によって変化しません。5 µmの間隔でスペクトル色分けされたスポットの遠位分布を用いて、核膜からボクセルまでの距離を可視化します。無処理およびアゴニスト処理前のアンタゴニストによる前処理では、GPCRの収縮に有意な差は見られませんでした。

アゴニストであるCRFで細胞を処理すると、未処理の場合や、アンタゴニストによる前処理を行った場合と比較して、CFR 2を含むボクセルの数が段階的に減少します。この手法は、定量的イメージング技術の分野の研究者が、数多くの単一細胞の表現型変化を探索・特性解析することを可能にし、この細胞ベースのアッセイを創薬プロセスにおける新たな単一細胞プロファイリングツールとして位置づけました。