マウス脳組織切片における蛍光標識アストロサイトの免疫染色

蛍光タンパク質を発現する星状細胞のまばらな集団を含む固定マウス脳組織切片を取ります。

自由浮遊部分を界面活性剤を含む緩衝液で処理して、細胞を透過性化します。

非特異的抗体結合を防ぐために、ブロッキングバッファーで切片をインキュベートします。

切片を一次抗体で処理し、抗体が星状細胞の蛍光タンパク質に結合するようにインキュベートします。

バッファーを使用して余分な一次抗体を洗い流します。

次に、一次抗体に結合する蛍光色素タグ付き二次抗体と切片をインキュベートします。

結合していない二次抗体をバッファーで洗い流します。

切片を緩衝液脱イオン水混合物に移し、界面活性剤の残留物を除去します。

緩衝液脱イオン水を含むスライドにセクションを置きます。余分な液体を取り除き、封入剤を追加します。次に、カバーガラスを配置して固定します。

最後に、共焦点顕微鏡を使用して、切片内の標識蛍光タンパク質発現星状細胞を視覚化します。

まず、1ミリリットルの10%Triton Xを50ミリリットルのチューブに加え、チューブを50ミリリットルにTBSで満たして、TBSTの新しい溶液を調製します。ヤギ血清とTBSTを15ミリリットルのチューブに混ぜて、各脳に2ミリリットルのブロッキング溶液と抗体溶液を調製します。

次に、24ウェルプレートにラベルを付けて、異なるサンプルを異なる行、異なる溶液、異なるカラムに配置します。次に、「洗浄 1」、「洗浄 2」、「洗浄 3」とラベル付けされた最初の 3 つのカラムに 1 ミリリットルの TBST を加え、4 番目のカラムに 1 ミリリットルのブロッキング溶液を加えます。

ブンゼンバーナーを使用して、5.75インチのパスツールピペットの端を小さなフックに溶かして、ガラスピックを準備します。次に、ピックを使用して、組織切片を12ウェルプレートから24ウェルプレートの「洗浄1」カラムに移します。次に、ガラスピックを使用して切片を1つのウェルから次のウェルに移し、切片を洗浄1、2、および3ウェルでそれぞれ10分間洗浄し、続いて切片をブロッキング溶液中で1時間インキュベートします。

次に、一次抗体の切片を摂氏4度で振とうしながら2〜3晩インキュベートします。一次抗体のインキュベーション後、洗浄ウェルから1日目のTBSTを吸引します。次に、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、セクションを最初の洗浄ウェルに移動します。

次に、二次抗体の切片を室温で3時間インキュベートします。二次抗体のインキュベーション後、洗浄ウェルから2日目のTBSTを吸引します。次に、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、セクションを最初の洗浄ウェルに移動します。

最後の洗浄では、封入材を摂氏4度から取り出し、室温まで温めます。次に、脱イオン水にTBSの2対1の混合物を調製し、ペトリ皿に加えます。次に、脱イオン水中の2〜1のTBS混合物を800マイクロリットル表面に加えて顕微鏡スライドを調製します。

ウォッシュ3」ウェルからペトリ皿にセクションを移します。次に、細い絵筆を使用して、ペトリ皿からスライド上の液体にセクションを一度に1つずつ移します。次に、絵筆を使用してスライド上で平らになるようにセクションを慎重に配置します。P1000ピペットでスライドから余分な液体を慎重に取り除き、真空吸引します。

スライドから余分な液体をすべて取り除いたら、トランスファーピペットを使用して、すぐに各セクションに1滴の封入剤を追加し、スライドの上にカバーガラスをそっと置きます。封入剤を数分間広げてから、カバーガラスの下から出てくる余分な封入材を真空吸引で取り除きます。その後、カバーガラスの 4 つの端すべてを透明なマニキュアで密封します。