Name: サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶアストロサイトネットワークの組織解析法。ImageJFIJIを用いて脳構造内の細胞数・サイズ・位置を定量化し、ベクトル解析で異方性を評価するバイアス最小化プロトコルを解説。神経科学研究の再現性向上に貢献します。

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この作品はカナダ協会の健康研究、助成/賞数によって資金を供給: 14392。

<ol><li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li>
<li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+calcium%3A+homeostasis+and+signaling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li>
<li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">How do glial cells contribute to motor control?</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li>
<li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Review%22%5BJournal%5D)">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional%2C+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499(2015).</li>
<li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemichannels%3A+new+pathways+for+gliotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li>
<li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitters+travel+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li>
<li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li>
<li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li>
<li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li>
<li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li>
<li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Science%22%5BJournal%5D)">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li>
<li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li>
<li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li>
<li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells%3A+properties%2C+pharmacology%2C+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88(2013).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca%282%29%28%2B%29+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8(2012).</li>
<li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+hemichannels+in+astrocytes%3A+a+novel+mechanism+of+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li>
<li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li>
<li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling%2C+without+dye+coupling%2C+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li>
<li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li>
<li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li>
<li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus%2C+Neocortex%2C+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li>
<li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li>
</ol>

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電気生理学的方法があり、アストロ サイト23,24間結合機能を評価することができます。ただし、これらのメソッドは、アストロ サイト ネットワークの解剖学的配置に関する情報を提供できません。研究の数はすでに「色素- またはトレーサー カップリング」、ようここで発生することのみの一部電気生理学的方法25,26,27, 示唆によって検出されたセルを結合を示している、この方法で検出された細胞の数を過小評価します。それにもかかわらず、これはまだ結合を視覚化するための最良の方法です。ギャップ接合20に浸透して 1 1.2 KDa より小さい分子トレーサーを使用する場合は、大きい色素結合が得られます。蛍光グルコース誘導体 (2-NBDG) または (Alexa 染料かルシファー黄色) のような蛍光マーカ...

多くの研究は、亜細胞やシナプス レベルでニューロン ・ グリア対話がシナプス伝達と神経機能への影響を持つことができますどのように説明しています。アストロ サイトが周囲の神経細胞の活動に敏感であることは周知します。実際には、グルタミン酸、GABA、アセチルコリン、ATP (以前公開されたレビュー2,3,4参照) を含む多くの神経伝達物質の受容体があります。その見返りに、アストロ サイト処理 ensheath シナプス要素と影響神経活動の両方あると櫛谷サイトで細胞外のイオンの恒常性を調節し、いくつかの要因やグルタミン酸、D-セリン、ATP などの送信機を解放して5,6,7。
アストロ サイトのカップリングは空間的に調整され、エリアが明確な解剖学的特徴の神経細胞の分割に対応する証拠と、アストロ サイトのネットワーク レベルで神経機能を調節することがまた考えが出現しました。(感覚的表現と地域) のような区画は、アストロ サイトが他のアストロ サイトの近くにあるものだけではなく、同じ機能を提供するカップルのことを示します。横の優れたオリーブの例えば、最もアストロ サイト ネットワークは、8, 純音に反応軸を直交指向バレル皮質または olfactoty の糸球体におけるアストロ サイトの間の通信はバレルまたは糸球体内で非常に強いに対し隣接するもの9,10間弱い。両方のケースでアストロ サイトのネットワーク、glomerule またはバレルの9,10の中心に向かって指向です。
我々 は最近、アストロ サイトの活性が細胞外 Ca2 +の濃度を減少させることによってニューロンの興奮を調節することを示した ([Ca2 +]e)、S100β、Ca2 +のリリースでおそらく-結合蛋白質11。という事実に起因する核 (NVsnpr、咀嚼運動の生成に重要な役割を果たすと考えられて)、三叉神経主感覚の背の部分で三叉神経プレベッツィンガー ニューロンの人口で示したこの効果をこれらのニューロンのリズミカルな発射は、永続的な Na+現在 [Ca2 +]e11,12の低下によって促進されてによって異なります。これらのニューロンにリズミカルな発射は、その入力の刺激または [Ca2 +]eの人工の減少によって「生理」誘発されることができます。アストロ サイトの結合するリズミカルなニューロン1必要がある示した。これはアストロ サイトのネットワークが神経活動を同期および調整できる限局性の機能ドメインを形成する可能性が発生します。この仮説を評価するために、我々 はまず厳格な NVsnpr 内のこれらのネットワークの組織を文書化する方法を開発する必要です。
アストロ サイトのネットワークに関する先行研究は主細胞数と密度と範囲の面で結合の程度を説明しています。バレル皮質9、海馬13,14,の 2 つの軸 (x と y) に沿ってネットワークのサイズを比較することでアストロ サイトのネットワークの形状と色素結合の方向を評価する試みを行った主15、視床16、外側優れたオリーブ8、嗅糸球体の10、および皮質14の barreloid フィールド。ここで説明する方法は、ネットワーク内のラベル付きセルの公平な数と覆っている面積の推定に有効にします。また、ネットワーク内の結合の結晶配向を定義し、配向は中心核のまたは別の方向に向かっているかどうかを評価するツールを開発しています。以前使用していた方法と比較すると、このプロトコルは組織と知られている明確な解剖学的を持たない背側三叉神経主知覚核のような構造でアストロ サイトのネットワークの向きを記述する手段を提供します。区画。上記の研究でネットワーク指向はすでに記載されて構造自体の形状に関係として記述されます (e.g、海馬と皮質の糸球体でレイヤーの視床、大脳皮質での樽で barreloid。嗅球など)。また、ベクトル解析は、異なる条件下で明らかに向きを結合の比較できます。核内ネットワークの位置によるとこれらのパラメーターが変更されたかどうかを分析するため、核の境界に関して各ネットワークを交換する方法を開発しました。これらのツールは、結合セルの調査ネットワークの他の領域に簡単に適応できます。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td>ズ<td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーケミカル</td>ズ<td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td>フィ<td>ッシャーケミカルズ</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</sub</td><td>>フィッシャーケミカル</td><td>ズM65-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>ズS233-500</td><td></td></tr><tr><td>C6H12O6 無水デキストロース</td><td>フィッシャーケミカル</td>ズ <td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 二水和</td><td>シグマ</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコン酸カリウム塩</td><td>ΣG45001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 anhydrous</td><td>シグマ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ATPトリス塩</サブ></td><td>シグマ</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>GTP<サブ>トリス塩</サブ></td><td>シグマ</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>バイオシチン</td><td>シグマ</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>カルベノキソロン二ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>C4790</td><td></td></tr><tr><td>アビジン-ビオチン複合体 : ABC キット</td><td>Vestor laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-alexa 594</td><td>Molecular Probes</td><td>S11227</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemicals</td><td>X5-1</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤 1 : Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>トルエン系合成樹脂封入剤 : パーマウント</td><td>フィッシャーケミカルズ</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>スライド乾燥ベンチ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>11-474-470</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-544A</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドカラーフロスト</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Fisherchemicals</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス FluoView FV 1000 共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40X 水浸レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>20X 水浸レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLUMPLFL20XW</td><td></td></tr><tr><td>4X 水浸レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLFLUOR4X/340</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>MP 225</td><td></td></tr><tr><td>カメラ CCD</td><td></td><td>ソニーCX-ST50</td><td></td></tr><tr><td>黒と白のモニター</td><td></td><td>ソニーSSM-125</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>分子デバイス</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>軸索機器</td><td>Mulitclamp 700A</td><td></td></tr><tr><td>電気生理学取得ソフトウェア</td><td>Molecular devices</td><td>pClamp 8</td><td></td></tr><tr><td>電気生理学解析ソフトウェア</td><td>Molecular devices</td><td>Clampfit 8</td><td></td></tr><tr><td>イメージング解析ソフトウェア</td><td>ImageJFIJI</td><td>オープンソースソフトウェア。プラグインパッケージを含むFIJIバージョン。</td><td></td></tr><tr><td>ベクター画像エディタ</td><td>Adobe</td><td>Illustrator CS4</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシートアプリケーション</td><td>Microsoft Office</td><td>Excel 2010</td><td></td></tr></tbody></table>

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

アストロ サイトがシナプスおよび単一セルのレベルでだけでなく、ネットワーク レベルでも神経機能を調節することがますます明らかになった。アストロ サイトは、強く、ギャップ結合を介して互いに接続しているし、これらの接合点を介して結合はダイナミックで、厳しく規制されています。新興コンセプトはアストロ サイト機能を特化し、彼らが関連付けられている神経回路の機能に適応です。したがってより良いコミュニケーションを支配して、結合ルールを記述してその機能を理解するため、アストロ サイトのネットワークの様々 なパラメーターを測定する方法が必要です。
ここでは、画像解析ソフトを使用して (例えば.、ImageJFIJI)、色素結合によるアストロ サイトのネットワークの共焦点画像を分析する手法について述べる。これらのメソッドにより 1) 自動および公平な細胞の検出ラベル、2) 3) 色素ネットワーク内で拡散し、4) 対象地域内ネットワークの再配置の優先配向の計算ネットワークのサイズの計算.
この分析は、特定の領域のアストロ サイトのネットワークを特徴づける、さまざまな機能に関連するさまざまな分野のネットワークを比較または結合に対して異なる効果をさまざまな条件下で得られたネットワークを比較に使用できます。これらの観察は、重要な機能を考慮する可能性があります。例えば、どこ我々 は以前アストロ サイトのカップリングはニューロンのリズミカルな破裂1に強壮剤からの発火パターンを切り替える機能のために不可欠に、三叉神経核のアストロ サイトのネットワークを分析します。サイズ、閉じ込め、この核におけるアストロ サイトのネットワークの優先配向を測定することによってそれらを囲む機能ドメインについての仮説を構築できます。いくつかの研究は、いくつかの名前の視覚野と視床のバレル皮質、側方の優れたオリーブ、嗅糸球体、感覚核を含むいくつかの他の頭脳区域同様の分析から寄与するかもしれないことを提案します。

脳の細胞間の結合はなく静的ではなく動的に多くの要因によって規制です。説明する方法は、異なる条件の下で明らかにアストロ サイトのネットワークを分析して NVsnpr の組織を理解するために開発されました。これらの結果は、既に公開された1されています。3 つの異なる条件で NVsnpr の背の部分の単一のアストロ サイトの biocytin 充填を行った: Ca2 +(制御の条件の不在であらゆる刺激)、残りの部分で-無料の条件、および次の電気刺激プロジェクトの核に感覚繊維。図 6A-Cの左側に各条件のアストロ サイトの biocytin 充填実験の設定を示します。
Biocytin ラベル セルのネットワーク コントロール条件で観察し、, 安静時 NVsnpr アストロ サイト間結合セルの基底状...

ここでアストロ サイトのネットワークの組織を評価するためのプロトコルを提案する.この方法では、細胞数、サイズ、領域、および核内の位置などのこれらのネットワークの記述対策を提供するためにバイアスを最小限に抑えます。異方性は、ベクトル解析と評価されます。

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

この方法は、脳構造におけるアストロサイトネットワークの組織に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ラベルセルを数え、定義された構造内で解剖学的組織を文書化する公平な方法を提案することです。ImageJFIJI を開き、目的のファイルを選択し、バイオフォーマットのインポートオプションウィンドウで[OK]をクリックします。最終的な Z スタックに必要な光学スライスのみを含む Z スタックを再定義するには、まず STK および Z プロジェクトを選択し、ツールバーのスタックノブをクリックします。投影タイプ設定で最大強度を選択します。ファイルを保存し、スタック ファイルに名前を付けます。イメージングファイルに複数のチャンネルが含まれている場合は、画像カラーとスプリットチャンネルを使用して、アストロサイクネットワークの画像を持つチャンネルのみを表示します。ピクセル寸法の画像、プロパティ、ピクセルを選択して、画像のピクセル設定を確認します。次に、バックグラウンドのバックグラウンドツールを開いてバックグラウンドを減算し、背景を減算して、バックグラウンドバイオシチンのラベリングを除去します。プレビュー機能を使用して、通常は 50 ピクセルに設定されるローリング ボールの半径を設定します。減算のバックグラウンドステップに従ってさらにノイズリダクションが必要な場合は、プロセス、ノイズを選択し、外れ値を削除します。[外れ値]設定で[明るい]を選択し、プレビュー機能を使用して半径としきい値を設定します。次に示すように、外れ値除去ツールを使用するとデータがぼやける可能性があるため、注意してください。画像、調整、しきい値を使用してしきい値を調整します。デフォルトとBとWモードを選択します。[適用]をクリックします。プロセス、バイナリを選択してバイナリプロセスツールを使用して画像をバイナリ画像に変換し、バイナリを作成します。ファイルを tiff ファイルとして保存し、バイナリ ファイルの名前を付けます。セル数をカウントするには、まず[分析]をクリックして測定タイプを設定し、測定を設定します。次に、中心心のオプションを選択します。バイナリファイルが画面上で開かれていることを確認します。ここでも、解析メニューを開き、今度はパーティクルの解析を選択します。次に、[表示とアウトライン] を選択します。これにより、検出結果を示す新しいファイルが生成されます。検出を絞り込むためにパラメータを最適化します。セルのみを検出するには、30 ~ 6000 のサイズ値を使用し、0 ~ 1 の間の円形を使用します。[OK] をクリックして検出を実行します。2 つのテーブルが表示され、検出されたセルの数を示す集計表と、各セルの X 座標と Y 座標を提供する結果というタイトルのテーブルが表示されます。値をコピーして、スプレッドシート アプリケーションに貼り付けます。このテーブルを名前検出テーブルの下に保存します。検出されたセルのプロットを含むファイルも表示されます。このファイルを tiff ファイルとして名前検出ファイルに保存します。2 つ以上のラベル付きセルのグループが解析パーティクル ツールを使用して単一のセルとして検出された場合は、解析パーティクル ツールを適用する前に、プロセス、バイナリ、および集水域を選択してバイナリ イメージの集水域ツールを使用します。ネットワークの表面領域を測定するには、ImageJ の検出ファイルを使用します。ツールバーでマウスを左クリックしてポリゴン選択ツールを選択します。もう一度左クリックすると、ネットワークの外部周辺にあるすべてのセルを接続する対象領域(ROI)のトレースが開始されます。右クリックしてポリゴンを閉じます。設定した計測ウィンドウを開き、面積オプションを選択します。次に ROI マネージャを開き、[追加] をクリックして ROI マネージャにトレースされたポリゴンを追加します。ROI マネージャでメジャーをクリックして測定を実行します。面積の計測値は表に表示され、ピクセル単位で表されます。この値を、平方マイクロメートルで値を取得するために使用される顕微鏡の変換係数で変換することを忘れないでください。ImageJFIJI でスタックファイルを開き、より強いラベル付け強度を持つパッチされたセルを特定します。次に、スプレッドシート アプリケーションで検出テーブルという名前のファイルを開き、パッチを適用したセルとそれに対応する座標に関連付けられている番号を検索します。パッチされたセルを正確に特定できない場合は、ポリゴンツールを使用して、バイオシチンの堆積物の密度が高い領域を囲み、この位置をパッチされたセルの位置と呼ぶ。以前と同様に ROI マネージャを使用して、パッチが適用されたセルの場所に ROI を描画し、ROI マネージャに追加します。次に、測定を設定し、中心のオプションを選択します。RIO マネージャで、メジャーをクリックして、トレースされた領域の中心座標を取得します。これらの座標をこの特定のネットワークの基準点として使用します。この数式を使用して、パッチを適用したアストロサイトを参照して各セルの座標を計算します。パッチ付きアストロサイトを参照して各セルの座標を表現することは、パッチ付きアストロサイトからベクトルを計算する重要なステップである。この数式を使用して、優先方向の主ベクトルの座標を計算します。ネットワークの優先方向の主ベクトルは、ネットワーク内で構成される各セルについて、以前に計算されたすべてのベクトルの合計です。メイン ベクトルの長さをネットワーク内のセルの数で除算し、パッチを適用したセルを除外するには、値を正規化し、ネットワーク間の比較を有効にします。対象の核内の各ネットワークの位置を決定するには、まずベクターイメージエディタで4つのx画像を開きます。4 つの x イメージのサイズを大きくするには、ディメンション ウィンドウの寸法に 5 を掛けます。ここでは、画像を800 x 800ピクセルでサンプリングし、サンプリング解像度を4000 x 4000ピクセルに変更しました。ファイルを tiff 形式でエクスポートし、サイズが 4 x の名前を付けます。サイズ変更した 4 つの x イメージの左上隅を、Adobe Illustrator ドキュメントの左下隅に合わせます。ソフトウェアは左下隅の参照点からの座標を提供します。ネットワークの 20 x イメージを開きます。バイナリ ファイルまたは検出ファイルは、位置合わせが簡単であるため、使用します。次に、20 x イメージのバイナリ ファイルで不透明度ツールを使用して、サイズ変更された 4 つの x イメージに合わせて配置します。位置合わせが完了したら、ピペット ツールを選択して押さえたままにして、測定ツールが表示されるようにし、左側のツールバーで選択します。測定ツールを使用して、20 x イメージの左上隅をクリックして、20 x 参照点の座標をサイズ変更した 4 つの x イメージ上に取得します。この20×参照座標は、核の模式図上の各ネットワークの位置を表すのに有用である。データを合計するために、核を長方形として正規化します。これを行うには、ポリゴン ツールを使用して、サイズ変更された 4 つの x イメージ内の核を囲みます。次に、ROI マネージャを開き、描画された ROI を追加します。核の境界線が見えない場合は、透明なライトでイメージを使用します。セット測定で、外接する長方形オプションを選択して、描画された核内の最小の長方形を計算します。最後に、measure をクリックし、書き込まれたプロトコルの手順に従って、外接する四角形で表される正規化された核でラベル付きセル座標を表現します。SR101によって標識された三叉主感覚核の側側部分の単一のアストロサイトを全細胞記録に標的とし、0.2%のバイオシチンで満たされた。第5管の電気刺激は三叉主官能核の後部におけるバイオシチン標識を増加させ、結合細胞の数の増加を表す。占星状ネットワークは、三叉主感覚核の後部とその主な向きに閉じ込められたままである。この技術は、定義された構造内で占星ネットワークを位置付けるために開発されたが、任意の構造で標識された細胞の集団の位置を表現するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

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サイズ、形状、および結合のアストロサイトのネットワークの方向性を分析

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