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蛍光標識された星状細胞を含む免疫染色マウス脳切片を取ります。星状細胞の細胞質は赤色の蛍光を発し、核は青色の蛍光を発します。
スライドを適切な対物レンズの下の共焦点顕微鏡のステージに置きます。
取得ソフトウェアを使用して、焦点を調整し、星状細胞の細胞質と核を標識する蛍光色素を選択します。
ライブイメージングを開始し、イメージングパラメータを最適化して、取得した画像のノイズを低減します。
取得パラメータで、高品質の2次元画像をキャプチャするための低速スキャンモードを選択します。
星状細胞の最上位置をZスタックの開始点として識別し、最も低い位置を終点として識別します。
セルの深さ全体をカバーするスライスの数を定義します。
スライスをマージして、アストロサイトの3次元画像を生成します。
共焦点顕微鏡検査を開始するには、スライドを顕微鏡ステージに置き、63倍対物レンズを選択します。取得ソフトウェアを開いた後、[取得]タブの[スマートセットアップ]をクリックし、適切な蛍光色素を選択します。ここでは、DAPIとAlexa Fluor 555を使用します。
次に、「ベストシグナル」をクリックし、次に「適用」をクリックします。次に、[露出の設定]をクリックして、コンピューターが最適な露出パラメータを決定できるようにします。
画像を最適化するには、[チャンネル] ウィンドウを開き、画像を [ライブ] に切り替えます。必要に応じてフォーカスを調整します。次に、1 AU をクリックしてピンホールを最適化します。最適な強度が得られるようにゲインを調整します。
最後に、デジタルゲインを2から3の間に設定します。この最適化の後、ライブ画像を停止し、取得モードウィンドウを開きます。X x Y をクリックしてフレーム サイズを調整し、1024 x 1024 を選択します。また、遅い速度を選択してください。
次に、[平均化] タブを開き、4 以上の数値を選択します。次に、 スナップ ボタンをクリックして、キャプチャした 2D 画像を保存します。3D イメージングを設定するには、[スマート セットアップ] タブを開き、[Z スタック] 項目にマークを付けると、スタック ウィンドウが開きます。
Zスタックの最初と最後の位置を設定するには、もう一度[ライブ]をクリックして、アストロサイトの最上位置にフォーカスを調整します。[最初に設定]をクリックします。次に、焦点を星状細胞の最も低い位置に調整し、[最後に設定]をクリックします。次に、ライブビューを停止します。
次に、[最適] をクリックして間隔を選択し、スライスの数を設定します。ここで、間隔は1.01マイクロメートルです。最後に、「実験の開始」をクリックし、スキャンが完了したら画像を保存します。
