アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

この手順の全体的な目標は、アデノウイルス感染細胞に形成された複製コンパートメントが豊富な非核画分を取得し、その組成、超構造、および関連する活性の詳細な研究を行うことです。この方法は、ウイルスの宿主細胞の相互作用を制御するために複製コンパートメントに依存するウイルスゲノムの複製と発現を制御する分子メカニズムの研究など、DNAウイルス学分野の重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、核複製DNAウイルスが感染細胞を制御することを可能にするメカニズムの研究に適した無細胞システムを確立するための速度勾配に基づく簡単な手順であることです。

このアッセイを実施するために、まず、添付のテキストプロトコルに記載されているように、アデノウイルス5型またはD5型およびヒト包皮線維芽細胞またはHFFを調製し、100ミリメートル組織培養皿で10〜7番目のHFFに感染を開始し、1皿あたり85の1ミリリットルおよびDMMを使用して、30フォーカス形成単位または細胞あたりFFUのMOIで細胞を加湿細胞培養インキュベーターで2時間インキュベートします摂氏37度と5%の二酸化炭素で。15分ごとに皿を慎重に揺らして、ウイルス接種物が細胞上に均一に分布するようにします。インキュベーション後、培地を取り出し、新しいdmemを追加します。

10%FBSを添加し、セルスクレーパーを使用して細胞を16時間、24時間、または36時間インキュベートします。感染後の感染細胞と制御細胞を穏やかに採取し、細胞懸濁液を氷上の滅菌遠心チューブに集めます。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、細胞をGの220倍で摂氏4度で5分間遠心分離します。

次に、細胞ペレットを5ミリリットルの氷冷PBS遠心分離機に再懸濁し、5ミリリットルの氷冷PBSで細胞を3回洗浄し、洗浄上清を廃棄して細胞をシラミ化します。Resusは、プロテアーゼ阻害剤を含む700マイクロリットルの氷冷低張緩衝液に細胞ペレットを懸濁し、細胞を氷上で3時間膨潤させます。タイプAのテフロン乳棒を使用して、10〜20回のダウンストロークで細胞を均質化します。

細胞の溶解を監視するために、20ストロークごとに定期的に顕微鏡でライセートをチェックします。すべての細胞が正常に破裂するまで、このプロセスを約80ストローク繰り返します。次に、ホモジネートをGの300倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清をマイナス20°Cで細胞質画分としてチューブに保管し、核reusから細胞の破片を取り除きます。0.25モルのスクロース溶液の750マイクロリットル、1ピペット、0.35モルのスクロース溶液2の750マイクロリットルのペレットを遠心分離チューブに懸濁し、再懸濁したホモジネートを溶液2の上に慎重に重ねます。ショ糖クッションをGの1400倍、摂氏4度で5分間回転させ、上清を捨てます。

シラミに750マイクロリットルの溶液2でペレットを再懸濁します。核は、超音波浴で核懸濁液を超音波処理し、2回の5分間パルスで摂氏4度以下に維持します。パルス間の明視野顕微鏡下で核溶解を確認し、核が完全に横たわるまでさらに超音波処理します。

次に、750マイクロリットルの0.88モルスクロース溶液3を遠心分離管層にピペットで、核溶解液を溶液3の上に配置します。ライセートをGの3000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。名前が付けられた1.5ミリリットルのSは、摂氏マイナス70度で保存される核プラズマ画分です。

次に、ペレットを700マイクロリットルの溶液2に再懸濁します。これは、宿主核の85複製コンパートメント分画またはRCFであり、これも摂氏マイナス70度で保存されます。免疫蛍光分析を開始するには、生理食塩水でコーティングされたスライドガラスに5マイクロリットルのRCFを滴下します。

液滴を室温で風乾させます。次に、スポットの横にあるドロップに500マイクロリットルのPBSを追加し、スライドを傾けてPBSをスポットに流します。スライドからPBSを排出します。

次に、5%ウシ血清アルブミンを含む500マイクロリットルのPBSでサンプルスポットを室温で2時間ブロックします。余分なブロッキング溶液を除去するには、スライド上にスポットしたサンプルに500マイクロリットルのPBSを、サンプルに直接ピペッティングせずに穏やかに加えます。洗濯を3回行います。

次に、ウイルスのE two A DNA結合タンパク質に対する希釈した一次抗体20マイクロリットルをサンプルスポットに添加します。蒸発を防ぐためにスライドを覆い、室温の加湿チャンバーで2時間インキュベートします。次に、0.02%tween 20を含むPBSでサンプルを3回優しく洗浄します。

これらの洗浄後にサンプルに直接ピペッティングすることは避けてください。20 μLのフルオロ4結合マウス二次抗体をサンプルに直接添加し、摂氏4度で1時間インキュベートします。加湿チャンバー内で、500マイクロリットルのPBSと0.02%Tween 20をスライドに加え、サンプル上で直接ピペッティングしないようにします。

次に、2マイクロリットルの埋込溶液を加え、サンプルの上にカバースリップを反転させます。カバースリップの側面をマニキュアで密封します。アデノウイルスE、2A、DNA結合タンパク質、またはDBPの免疫蛍光の結果である、使用したフルオロ4に特異的な目的の波長で63倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡でスライドをここに示します。

DBPを含む構造は、亜核ウイルスrcであり、E2AのDBPはRC内に局在し、緑色で表示されることに注意してください。さらに、感染後24時間および36時間でRCFと核プラスミックスまたはNPLを比較するPCRによって、RCF中のウイルスDNAの濃縮が確認されました。ウイルスのGNAは、NPLコンサルトではなく、RCFで選択的に発見されました。

RCFにおけるアデノウイルスMNAの追加証拠の添付テキストこの技術を習得すると、感染した細胞が採取されてからRCFが適切に実行されれば、RCFの分離まで6回で行うことができます。この手順を試行する際は、常にサンプルを氷上に保ち、明視野顕微鏡法による均質化核、単離、超音波処理、および亜核分画の単離ステップを監視することを覚えておくことが重要です。この手順に従います。

R-T-P-C-Rや透過型電子顕微鏡などの他の方法を実施して、ウイルス複製コンパートメントに関連するウイルス遺伝子発現の調節やこれらの粒子の超構造を研究することができます。この技術は、DNA腫瘍ウイルス学の分野の研究者が、ヒト細胞における細胞周期調節を変化させ、ウイルス複製を促進する分子メカニズムを探求するための道を開く可能性を秘めています。このビデオを見た後、感染した細胞核からウイルス複製コンパートメントを分離して、これらのウイルス誘導構造の形態学的、機能的、および組成学的研究を行う方法について十分に理解できるはずです。

SANインジケーターの使用は危険な場合があり、この手順を実行するときは、耳の口を装着するなどのパーカッションを常に行う必要があることを忘れないでください。