アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

この手順の目的は、アデノウイルス感染細胞内で形成される複製コンパートメントを濃縮した非核分画を得ることで、その組成、超微細構造、および関連する活性を詳細に研究することです。この手法は、ウイルスゲノムの複製と発現を制御する分子メカニズムの研究など、DNAウイルス学分野における重要な課題の解決に寄与します。これらのメカニズムは、ウイルスと宿主細胞の相互作用を調節するために複製コンパートメントに依存しています。本技術の主な利点は、速度勾配に基づいた簡便な手順で、核内で複製するDNAウイルスが感染細胞を制御することを可能にするメカニズムの研究に適した、セルフリーシステムを構築できることです。

本アッセイを実施するために、まず、付随するテキストプロトコルに従って、アデノウイルス5型（Ad5）およびヒト前頭皮線維芽細胞（HFF）を準備します。100 mm組織培養ディッシュあたり10⁷個のHFFに対し、1 mLのDMEMを用いて、MOI 30 FFU/cellで感染させます。細胞を37 °C、5% CO₂の加湿細胞培養インキュベーター内で2時間インキュベートします。この際、ウイルス接種液が細胞全体に均一に分散するように、15分ごとにディッシュを注意深く揺らしてください。インキュベーション後、培地を除去し、新鮮なDMEMを添加します。

10% FBSを添加し、セルスクレイパーを用いて細胞を16、24、または36時間インキュベートします。感染細胞およびコントロール細胞を感染後に緩やかに回収し、滅菌された遠心チューブに細胞懸濁液を回収して氷上に置きます。 Neubauerchamberを用いて細胞数をカウントし、その後、細胞を4°Cで220 ×g、5分間遠心分離します。

次に、細胞ペレットを5 mLの氷冷PBSに再懸濁し、5 mLの氷冷PBSで3回遠心洗浄します。細胞を溶解させるため、洗浄上清は廃棄してください。細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む700 µLの氷冷低張バッファーに再懸濁し、氷上で3時間静置して細胞を膨潤させます。タイプAのテフロン製ペッスルを用い、10〜20回のストロークで細胞をホモジナイズします。

細胞溶解の状態を確認するため、20ストロークごとに定期的に顕微鏡で溶解物を観察します。すべての細胞が完全に破砕されるまで、この工程を約80ストローク繰り返します。次に、ホモジネートを4 °C、300 ×gで5分間遠心分離します。

核の残渣から細胞碎片を除去するため、上清を細胞質分画としてチューブに入れ、-20 °Cで保存します。ペレットを750 µLの0.25 Mショ糖溶液（溶液1）に懸濁させます。遠心チューブに750 µLの0.35 Mショ糖溶液（溶液2）を入れ、再懸濁したホモジネートを溶液2の上に慎重に重層させます。ショ糖クッションを4 °C、1400 ×gで5分間遠心分離し、その後、上清を捨てます。

ペレットを750 µLの溶液2に再懸濁して溶解させます。核懸濁液を、4 °C以下に維持した超音波バスで、5分間のパルスを2回繰り返してソニケーションします。パルス間に明視野顕微鏡で核の溶解状態を確認し、核が完全に溶解するまでさらにソニケーションを行います。

次に、0.88 Mのスクロース溶液3を750 µL分注して遠心チューブに入れます。核ライセート溶液を溶液3の上に重層します。ライセートを4 °C、3000 ×gで10分間遠心分離します。得られた1.5 mLの上清は核質画分であり、-70 °Cで保存します。

次に、ペレットを700 µLの溶液2に再懸濁させます。これはホスト核の85 replication compartment fraction（RCF）であり、同様に-70 °Cで保存されます。免疫蛍光解析を開始するには、RCFを5 µL取り、生理食塩水コートガラススライド上に滴下します。

液滴を室温で自然乾燥させます。次に、スポットの隣に500 µLのPBSを滴下し、スライドを傾けてPBSをスポット上に流します。その後、スライドからPBSを排液します。

次に、5%牛血清アルブミンを含むPBS 500 µLを用いて、室温で2時間、サンプルスポットをブロッキングします。過剰なブロッキング溶液を除去するため、サンプルに直接ピペッティングしないように注意しながら、スライド上のサンプルスポットにPBS 500 µLを緩やかに加えます。この洗浄操作を3回繰り返します。

次に、ウイルスE2A DNA結合タンパク質に対する希釈一次抗体を20 µL、サンプルスポットに添加します。蒸発を防ぐためスライドをカバーし、加湿チャンバー内にて室温で2時間インキュベートします。その後、0.02% Tween 20含有PBSを用いて、サンプルを優しく3回洗浄します。

これらの洗浄後、サンプルに直接ピペッティングすることを避けてください。20 µLのfluoro four結合マウス二次抗体をサンプルに直接滴下し、4 °Cで1時間インキュベートします。加湿チャンバー内で、スライドに0.02% Tween 20を含むPBS 500 µLを添加します。この際も、サンプルへの直接的なピペッティングは避けてください。

次に、2 µLの封入剤を加え、サンプルの上にカバーガラスを反転させて被せます。カバーガラスの側面をマニキュアで封止します。使用したフルオロフォアに特異的な目的の波長で、63倍の対物レンズを用いて蛍光顕微鏡でスライドを観察します。ここでは、アデノウイルスE2A DNA結合タンパク質（DBP）の免疫蛍光染色の結果を示します。

DBPを含む構造は核内ウイルス複製コンパートメント（RC）であり、E2A DBPがRC内に局在し、緑色に表示されていることに注目してください。さらに、感染後24時間および36時間におけるRC画分（RCF）と核質画分（NPL）をPCRで比較することにより、RCFにおけるウイルスDNAの濃縮が確認されました。ウイルスDNAはRCFに選択的に見られ、NPLには認められませんでした。

RCFにおけるアデノウイルスMNAの追加的証拠のための付随テキスト。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、感染細胞の回収からRCFの単離までを6分で完了させることができます。この手順を行う際は、常にサンプルを氷上で保持し、均質化、核の単離、超音波処理、および核内分画の単離の各ステップを明視野顕微鏡でモニターすることが重要です。以下の手順に従ってください。

ウイルス複製コンパートメントに関連するウイルス遺伝子発現の調節や、これらの粒子の超微細構造を研究するために、RT-PCRや透過型電子顕微鏡などの他の手法を用いることができます。この技術は、DNA腫瘍ウイルス学分野の研究者が、細胞周期の調節を変化させ、ヒト細胞内でのウイルス複製を促進する分子メカニズムを探索するための道を開く可能性があります。このビデオを視聴することで、これらのウイルス誘導構造の形態学的、機能的、および組成的な研究を行うために、感染細胞の核からウイルス複製コンパートメントを単離する方法を十分に理解できるはずです。

SAN指示薬を取り扱う際は危険が伴うため、この手順を実施する際は、耳栓の着用などの予防策を必ず講じてください。