Name: Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶ FUCCIを用いた3Dメラノーマスフェロイドの細胞周期解析とフローサイトメトリーによる細胞分離法。腫瘍微小環境における細胞挙動のリアルタイム可視化とがん研究への応用。

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技術支援を提供してくださったDanae SharpさんとSheena Daignaultさんに感謝します。FUCCIコンストラクトを提供してくださった理化学研究所の宮脇淳先生、細胞株を提供してくださったフィラデルフィアのウィスター研究所のMeenhard Herlyn博士とPatricia Braffordさん、センテナリー研究所のイメージング&フローサイトメトリー施設の素晴らしい技術サポートに感謝いたします。Volocityソフトウェアの技術サポートを提供してくださったChris Johnson氏とAndrew Barlow博士に感謝します。N.K.H.は、オーストラリアのメラノーマ・皮膚がん研究所のキャメロン・フェローです。K.A.B.は、ニューサウスウェールズ州がん研究所(13/ECF/1-39)のフェローです。W.W.は、ニューサウスウェールズ州がん研究所(11/CDF/3-39)のフェローです。この研究は、プロジェクト助成金RG 09-08およびRG 13-06(Cancer Council New South Wales)、570778および1051996(Priority-driven cooperative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation)、08/RFG/1-27(Cancer Institute New South Wales)、およびAPP1003637およびAPP1084893(National Health and Medical Research Council)によって支援されました。

<ol><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Melanoma+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare%22%5BJournal%5D)">Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo.</a> Healthcare. 2, 27-46 (2014).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Reid, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+multicellular+tumor+spheroid+models+for+high-content+imaging+and+screening+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+chemical+genomics+and+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery.</a> Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth%2C+invasion%2C+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+cell+%26+melanoma+research%22%5BJournal%5D)">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).</li>
<li>Lucas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NOXA+and+MCL-1+as+a+strategy+for+sensitizing+melanoma+cells+to+the+BH3-mimetic+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+model+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology+%3A+journal+of+immunopathology%2C+molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid model in tumor biology.</a> Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tumour+heterogeneity+in+melanoma+therapy%3A+how+do+we+address+this+in+a+novel+model+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Manag%22%5BJournal%5D)">Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system?</a> Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncology%2Fhematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulated+expression+of+zonula+occludens+protein-1+in+human+melanoma+associates+with+N-cadherin+and+contributes+to+invasion+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion.</a> The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).</li>
<li>Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glutamine+transport+to+suppress+melanoma+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer.+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth.</a> International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell division. 6, 22(2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+deep+imaging+of+live+cellular+spheroids+with+light-sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy.</a> Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).</li>
<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

パーキンエルマーは出版費用を負担しました。

半自動画像解析は、回転楕円体の内側G1逮捕領域を同定し、そして外層の増殖。この方法は、これらの異なる領域で（免疫蛍光により）、細胞周期が、マーカー発現しないだけの変化を識別するために、光学部を使用して、ライブスフェロイドに、または一定の回転楕円体のセクションで使用され、細胞死、または細胞の形態であってもよいです。異なる回転楕円体領域内の細胞の運動性も定量化することができる - 細胞追跡画像解析ステップと一緒にライブ共焦点タイムラプスイメージングが追加された場合。画像解析には重要では高品質Z-切片の共焦点画像は、高解像度画像は、細胞のより良好な同定を可能にする、得られることです。画像解析の一つの制限は、核があまりに密集している場合、または赤色および緑色強度のあまり変化があった場合に正しくすべてのセルを見つけることができないことです。 （G1初期における）FUCCI陰性細胞は、この画像解析法、赤のみ（G1）で発見することができません黄色の（初期のS期）と緑（S / G2 / M）。ここで説明する画像ベースの分析法のもう一つの欠点は、アカウントにスフェロイドのフル3Dの性質を取らないということです。 Volocityソフトウェアは、zスタック...

多3Dスフェロイドが数十年のための腫瘍モデルとして知られている、しかし、それは彼らが多くの固形癌のためのin vitroモデルとして、より一般的に使用されるようになったことはごく最近です。彼らはますます複雑、高価で時間のかかる生体内モデルで 、シンプルで低コストの2D単層モデル1-6との間の中間のような高スループットの薬物発見スクリーニングにおいて使用されています。 2D培養における研究は、多くの場合、 生体内で複製することができません。癌の多くの種類の回転楕円体モデルは、増殖特性、薬剤感受性、薬剤の浸透、細胞-細胞相互作用、固形腫瘍6-11 においてインビボで見られる酸素や栄養素および壊死の開発の制限された利用可能性を模倣することができます。スフェロイドは、回転楕円体7の周囲に壊死性コア、コアを取り囲む逮捕静止またはG1領域、および増殖細胞を開発しています。これらの領域の開発細胞密度、増殖速度および回転楕円体12の大きさに応じて変えることができます。これらの異なるサブ領域で見られる細胞の異質性は、癌治療抵抗13,14に寄与し得ると仮定されています。したがって、これらの領域内の細胞を分析する能力は、個別の腫瘍薬物応答を理解するために重要です。 緑（あざみグリーン- AG）は、細胞周期15の異なる段階に分解されるCDT1とGemininの蛍光タグ付け、 -蛍光ユビキチン化、細胞周期のインジケータ（FUCCI）システムは、赤（KO Kusabiraオレンジ）に基づいています。従って、細胞核は、初期のS内の黄色、G1の赤とS / G2 / M期で緑に表示されます。ここでは二つの相補的な方法を記載している両方の細胞がG1逮捕中央または外側proliferatinに存在するかどうかを決定するために画像処理ソフトウェアまたは染料拡散フローサイトメトリーアッセイの使用に伴って、細胞周期を特定するためにFUCCIを用いグラムリング、及び回転楕円体の端部から個々の細胞の距離。これらの方法は、我々は回転楕円体の中心にあるおよび/または標的療法の存在下での低酸素領域におけるメラノーマ細胞が長期間G1停止のままにすることが可能であり、再できることを実証した我々の以前の出版物、に開発されましたより有利な条件は7を生じたとき、細胞周期を入力してください。

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>アガロース低融点</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td> 貴族寒天<td>の切片化用</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A5431</td><td></td></tr><tr><td>スフェロイド用アガロー</td>スを作るため <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1356-100</td><td>スフェロイドを作るために</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン/EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン</td><td>シグマ</td><td>HT5014-1CS</td><td>注意:有害で腐食性があります。個人用保護具を使用する、&nbsp;息の煙ではありません(煙の食器棚で開きます)。</td></tr><tr><td>IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コールチャーカップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SIE936</td><td>スフェロイド切片用鋳型</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター アナライザー</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree スター</td><td></td><td>フローサイトメトリーソフトウェア</td></tr><tr><td>バキュームグリース</td><td>シグマ</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>ベクター研究所</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI(商業コンストラクト)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>一過性トランスフェクションのみ</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー 70 &#956;m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>丸底 5 ml チューブ (滅菌)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>丸底 5 ml チューブ (非滅菌)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

3次元(3D)腫瘍スフェロイドは、従来の2次元(2D)細胞培養と比較して、生体内の腫瘍微小環境のより正確なモデルとして癌研究に利用されています。スフェロイドモデルは、細胞間相互作用、低酸素症と栄養不足、薬物浸透の影響を模倣することができます。このモデルの特徴の一つは、G1停止細胞のリングに囲まれた壊死性コアの発達であり、スフェロイドの外層に増殖する細胞があります。がん分野で興味深いのは、スフェロイドのさまざまな領域が薬物療法や遺伝子操作、環境操作にどのように反応するかです。ここでは、蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)システムの使用、および市販のソフトウェアを使用したサイトメトリーおよび画像解析を使用して、メラノーマスフェロイド内の細胞周期状態に対する細胞の細胞周期状態を特徴付ける方法について説明します。これらの方法は、腫瘍スフェロイドのさまざまなサブ領域における細胞周期の状態、遺伝子/タンパク質の発現、または細胞生存率の変化を経時的に、さまざまな条件下で追跡するために使用できます。

腫瘍スフェロイドを生成するいくつかの方法は、このプロトコルは、細胞は、寒天またはアガロース3,7,9上で培養された非接着性成長法を使用して、存在する。 図1は、寒天上の3日後、C8161メラノーマ回転楕円体の一例を示す図です。 C8161スフェロイドは500の直径との定期的なサイズのスフェロイド形成 - 600μmで3日後（= 565、SD = 19、n = 3の平均値）。スフェロイドを形成する他のメラノーマ細胞株が含まれます：WM793、WM983C、WM983B、WM164、1205lu（この細胞株を用いて形成されたスフェロイドが不規則であり、密度の低い19）。 3Dスフェロイドモデル内の個々の細胞の細胞周期を可視化するために、C8161黒色腫細胞はFUCCIシステム7,15で形質導入しました。原因（アガロースの3日後に直径1mmとC8161のためのコラーゲンで24時間成長まで）スフェロイドのサイズが大きいため、切片は、回転楕円体の中心に細胞を可視化するための最良の選択肢です...

蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)と画像解析またはフローサイトメトリーを使用した2つの補完的な方法について説明し、3Dスフェロイドの内側のG1停止領域と外側の増殖領域の細胞を特定し、単離します。

Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

本手法の総合的な目的は、2D細胞培養と比較して、多細胞ステロイドにおける細胞の周期状態およびステロイド内での位置に基づいた細胞の同定、特性評価、および単離を行うことです。3D OIDモデルは、腫瘍の構造とその微小環境を模倣しているため、生体内の癌の生物学的特性を再現します。スフェロイドとフローサイトメトリーおよびイメージング技術を組み合わせることで、本手法は、腫瘍微小環境が薬物感受性、細胞運動性、および増殖をどのように変化させるかなど、癌研究分野における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、細胞周期をリアルタイムで可視化できること、および特定のステロイド領域から生細胞を精製できることであり、これにより手順の実施が可能になります。当研究室のリサーチアシスタントであるA sharpが、手順を行います。100 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）に1.5%のアガロースを加え、電子レンジで3〜5分間加熱して3Dステロイド形成の準備を開始します。アガロースが完全に溶解するように、適宜フラスコを回旋させてください。その後、直ちにアガロース溶液100 µLを平底96ウェル組織培養プレートの各ウェルにピペットで分注します。プレートを室温で1時間インキュベートし、アガロースを凝固させます。次に、FCI構築物を発現しているメラノーマ細胞の80%コンフルエントな細胞培養物を、細胞培養インキュベーターから取り出します。細胞を10 millilitersのHBSSで洗浄します。0.05% EDTAを1.5 milliliters加え、その後、細胞を37 degrees Celsiusで約2分間インキュベートします。細胞が剥離したら、10 millilitersの細胞培養培地で懸濁します。血球計数器と倒立顕微鏡を用いて細胞数を手動でカウントし、細胞培養培地を用いて1 milliliterあたり25, 000 cellsに希釈します。その後、細胞懸濁液200 microlitersをピペットで分注し、96ウェルプレートの各ウェルにオーバーレイします。細胞スフェロイドを形成させるため、プレートを37 °C、5% CO2条件下で約3日間インキュベートします。インキュベート後、Forex対物レンズと位相差フィルターを備えた倒立顕微鏡を用いて、スフェロイドを撮影します。切片作成およびイメージングの準備として、スフェロイドが緻密でほぼ球形の細胞凝集体として観察されることを確認してください。1 mLピペットを用いて、それらをファルコンチューブに移します。その後、ステロイドを円錐形の底に沈殿させます。次に、培地を吸引して除去し、10%中性緩衝ホルマリン中で室温で2時間以上インキュベートして、スフェロイドを固定します。SPは、細胞の切片作成およびイメージング後、HBSS中で4°Cで数日間保存することが可能です。画像解析ソフトウェアを開き、「定量のみ（quantitation only）」の設定を選択します。次に、新しいライブラリを作成し、生データファイルをライブラリにドラッグして、スフェロイドの共焦点画像ファイルをインポートします。次に、「measurements」タブに移動し、プロトコルウィンドウにコマンドを正しい順序でドラッグ＆ドロップして、画像解析プロトコルを作成します。グリーンチャネル内のオブジェクトを検出するには、「finding」セクションから「find objects」コマンドをプロトコルウィンドウにドラッグ＆ドロップし、適切なチャネルを選択します。「processing」にある「open」コマンドを追加し、続いて細胞を分離させるために個別の「touching objects」コマンドを追加します。最後に、「フィルタリング」セクションから、サイズに基づいてオブジェクトを追加または除外します。50 µm未満のオブジェクトを除外するコマンドを設定し、小さな非細胞状オブジェクトを取り除きます。次に、新しい「オブジェクト検索」コマンドをプロトコルウィンドウにドラッグ・アンド・ドロップします。同様の手順に従い、レッドチャンネルを選択して、以降のすべてのコマンドを適用します。オブジェクトが検出されたら、「hide channel（チャンネルを隠す）」または「show channel（チャンネルを表示）」コマンドを使用して、赤色および緑色のオブジェクトがそれぞれ赤色および緑色の核に対応していることを視覚的に確認します。必要に応じて、「measurements（計測）」をクリックし、「feedback options（フィードバックオプション）」からオブジェクトマスクの外観を変更してください。次に、早期S期の細胞に対応する黄色いオブジェクトを検出するため、「Combining」セクションにある「Intersect」コマンドを使用し、「intersect red objects with green objects」を選択します。ここでも、50 µm未満のサイズのオブジェクトを除外してください。G1期の細胞を特定するには、「Combining」セクションにある「Subtract」コマンドを使用し、「subtract yellow object from red objects」を選択して、赤色のみのオブジェクトを抽出します。同様に、緑色のオブジェクトから黄色のオブジェクトを差し引くことで、SG2およびMPH相の細胞に相当する緑色のみのオブジェクトを特定します。これは、赤色のみのオブジェクトと緑色のみのオブジェクトの両方で行います。必要に応じて、フィルタリングセクションのフィルターポピュレーションコマンドを適用し、形状因子（shape factor）が0.25より大きい非細胞オブジェクトを除去します。その後、Sスフェロイドの外郭を特定します。グリーンまたはレッドのいずれかのチャンネルにおいて、「finding」セクションの「find objects」コマンドを使用します。次に、「processing」セクションの「closed」コマンドを使用して、個々の細胞を1つのオブジェクトに結合します。その後、「fill holes in objects」コマンドを追加し、球体内の穴を埋めます。次に、ファインフィルターを使用してSpheroオブジェクトからノイズを除去します。30,000 µmより小さいオブジェクトを除去するために「サイズによるオブジェクトの除外（exclude objects by size）」を選択し、スフェロイドの輪郭抽出を完了させます。すべてのオブジェクトが定義されたら、関連セクションから「距離の測定（measure distances）」を追加し、各OIDからSスフェロイド輪郭の端までの距離を決定します。この操作を、黄色、赤色のみ、および緑色のみの各集団に対して行います。細胞から最も近いSスフェロイド縁までの最短距離を可視化するには、「measurements」タブを開き、「feedback options」から「relationships」を選択します。次に、「show distances」を選択してください。最後に、プロトコルによって作成されたデータを保存するために、プロトコルを保存します。測定セクションから「make measurement」項目を選択してください。次に、データを解析するために、測定項目を選択し、測定セクションの解析（analysis）タブに移動して、解析メニューの「Analyze」を選択し、ステロイドの端から一定の距離にある細胞をカウントします。解析タブからフィルターを選択し、フィルターを作成します。例えば、球体端からの距離が100 microns未満のデータのみを表示させます。生データをエクスポートするには、ファイルタブからエクスポートを選択し、データをカンマ区切りまたはタブ区切りのテキストとして保存してください。このデータは、詳細な解析のためにスプレッドシートプログラムで開くことができます。C 8 1 16 1から作製された細胞球。Fujiシステムを用いて導入されたヒトメラノーマ細胞を固定し、切片を作成しました。細胞周期のG2/M期にある細胞を標識するAZA greenと、G1期にある細胞を標識するBerra orangeを用いて共焦点イメージングを行いました。これらの画像を重ね合わせると、予想通り壊死コア（necrotic core）などの主要な特徴が観察できます。この壊死コアに近い領域では赤色のG1期停止細胞が優勢であり、酸素や栄養へのアクセスが最も良いステロイドの外縁に向かって、赤色および緑色の増殖細胞が勾配状に増加しています。半自動的な画像解析の後、Fucci細胞マスクとSスフェロイドの外形を定義することができます。イメージングソフトウェアを用いて、Sスフェロイドの内側領域または外側領域における赤色細胞および緑色細胞を定量化しました。この解析により、G1期停止細胞は内側領域に濃縮されており、増殖細胞はスフェロイドの辺縁に近い領域に多く分布していることが示されました。この手法に習熟すれば、ステロイドの育成、イメージング、および解析を含めて1〜2週間で完了させることができます。これらの手順に従って、radsをコラーゲンマトリックスに移植し、タイムラプス顕微鏡でイメージングすることが可能です。その後、タンパク質またはRNA解析を行うことができ、これにより、ステロイド内の位置や酸素および栄養素へのアクセスががん細胞の表現型を変化させるかどうかといった疑問を明らかにすることができます。

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光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

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腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

腫瘍スフェロイドは、腫瘍細胞と微小環境の相互作用および治療応答を評価するためにますます利用されつつある。本プロトコルは、迅速な光学的クリアリングを用いた3D腫瘍スフェロイドの半ハイスループットイメージングのための堅牢かつ簡単な方法を記載する。...

腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

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マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

学ぶ FUCCIを用いた3Dメラノーマスフェロイドの細胞周期解析とフローサイトメトリーによる細胞分離法。腫瘍微小環境における細胞挙動のリアルタイム可視化とがん研究への応用。

Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

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