Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

この方法の全体的な目標は、2D細胞培養と比較して、ステロイド内の細胞周期の状態と位置に関して、多細胞ステロイドから細胞を同定、特徴付け、および単離することです。3D OIDモデルは、スフェロをフローサイトメトリーおよびイメージング技術と組み合わせることで、腫瘍の構造とその微小環境を模倣し、生体内のがんの生物学を再現します。この方法は、腫瘍の微小環境が薬物感受性、細胞の運動性、増殖をどのように変化させるかなど、がん領域の主要な質問に答えることができます。

この方法の主な利点は、細胞周期のリアルタイム可視化を可能にし、特定のステロイド領域からの生細胞の精製を可能にすることです 手順がシャープに行われることを実証し、私たちの研究室からの研究助手は、ハンクのバランス塩溶液またはHBSSの100ミリリットルで1.5%arosを電子レンジで加熱することにより、3Dステロイド形成の準備を開始しますまたは3〜5分間断続的にフラスコを渦巻いて確保しますアロスが完全に溶解していること。その後すぐに、平底の96ウェル組織培養プレートの各ウェルに100マイクロリットルのアロス溶液をピペットで移します。プレートを室温で1時間インキュベートし、アロスが固まるまで待ちます。

次に、FCIコンストラクトを発現するメラノーマ細胞の80%コンフルエンス細胞培養を細胞培養インキュベーターから取り出します。細胞を10ミリリットルのHBSSで洗浄します。1.5ミリリットルの0.05%EDTAを加え、細胞を摂氏37度で約2分間インキュベートします。

細胞が剥離したら、10ミリリットルの細胞培養液に懸濁します。中程度。血液、サイトメーター、倒立顕微鏡を使用して手動で細胞をカウントし、細胞培養培地でミリリットルあたり25, 000細胞に希釈します。次いで、200マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットでピペットで移し、96ウェルのアロスプレートの各ウェルを覆う。

プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%で約3日間インキュベートし、細胞スフェロイドを形成します。インキュベーション後、Forex対物レンズと位相コントラストフィルターを使用して、倒立顕微鏡でスフェロイドを画像化します。スフェロイドは、細胞ステロイドを切片化およびイメージング用に調製するために、コンパクトでほぼ球形の細胞凝集体として現れる必要があります。

1ミリリットルのピペットを使用して、それらをファルコンチューブに移動します。次に、ステロイドが円錐形の底に落ち着くのを待ちます。次に、培地のバイサクションを取り出し、スフェロイドを10%中性緩衝ホルミンに室温で少なくとも2時間インキュベートして固定します。

その後、SPは、細胞の切片化およびイメージング後、数日間、摂氏4度のHBSSに保存できます。Spheは画像解析ソフトウェアを開き、定量のみの構成を選択します。次に、新しいライブラリを作成し、生データファイルをライブラリにドラッグして、スフェロイド共焦点画像ファイルをインポートします。

次に、[測定]タブに移動し、プロトコルウィンドウ内でコマンドを正しい順序でドラッグアンドドロップして、画像解析プロトコルを構築します。緑のチャネルでオブジェクトを検索するには、検索セクションからプロトコルウィンドウにオブジェクト検索コマンドをドラッグアンドドロップし、適切なチャネルを選択します。処理中にある open コマンドを追加し、セルを分離するための別の touching objects コマンドを追加します。

最後に、フィルタリングセクションから、サイズごとにオブジェクトを追加および除外します。50 マイクロメートル未満のオブジェクトに対して、小さな非セルラー オブジェクトを除外するコマンド。次に、新しい find objects コマンドをプロトコル ウィンドウにドラッグ アンド ドロップします。

同じ手順に従って、赤いチャンネルを選択し、後続のすべてのコマンドを適用します。オブジェクトが見つかったら、hide channel コマンドまたは show channel コマンドを使用して、赤と緑のオブジェクトが赤と緑の原子核に対応していることを視覚的に確認します。必要に応じて、[測定] をクリックし、[フィードバック オプション] をクリックして、オブジェクト マスクの外観を変更します。

ここで、初期のS期セルに対応する黄色のオブジェクトを見つけるには、結合セクションにあるintersectコマンドを使用して、赤いオブジェクトと緑のオブジェクトと交差するオブジェクトを選択します。ここでも、50 マイクロメートル未満のサイズでオブジェクトを除外します。G 1 相セルを識別するには、結合セクションにある subtract コマンドを使用し、赤いオブジェクトから黄色のオブジェクトを減算して、赤いオブジェクトのみを検索します。

同様に、緑色のオブジェクトから黄色のオブジェクトを差し引いて、SG 2 およびMPH フェーズ セルと相関する緑色のオブジェクトのみを識別するために、専用の赤色オブジェクトと排他的な緑色オブジェクトの両方について調べます。必要に応じて、フィルター セクションから 0.25 より大きい形状係数でフィルター ポピュレーション コマンドを適用して、セルラー以外のオブジェクトを削除します。次に、S回転楕円体アウトラインを見つけます。

検索セクションのオブジェクト検索コマンドを緑または赤のチャネルで使用する。処理セクションから閉じたコマンドを使用して、個々のセルを 1 つのオブジェクトに結合します。次に、オブジェクトに穴を埋めるコマンドを追加して、spheの穴を埋めます。

次に、細かいフィルターを使用して、Spheroオブジェクトからノイズを除去します。回転楕円体のアウトラインの検索を終了します サイズでオブジェクトを除外 30, 000 マイクロメートル未満のオブジェクトを削除するために選択します。すべてのオブジェクトを定義したら、関連するセクションからメジャー距離を追加して、各 OID から S 回転楕円体のアウトラインのエッジまでの距離を決定します。

これは、黄色、赤のみ、および緑の人口のそれぞれで行います。セルから最も近い S 回転楕円体エッジまでの最小距離を視覚化するには、[計測] タブを開き、フィードバック オプションを選択してからリレーションシップを選択します。次に、[距離を表示] を選択します。

最後に、プロトコルを保存して、プロトコルによって作成されたデータを保存します。測定セクションから測定項目を作成します。次に、データを解釈するには、測定項目を選択し、測定セクションの分析タブに移動し、分析メニューの[分析]を選択して、ステロイドエッジから一定の距離で見つかったセルをカウントします。

フィルターを作成するには、分析タブから [フィルター] を選択します。たとえば、球体のエッジからの距離が 100 ミクロン未満のデータのみを表示します。生データをエクスポートするには、[ファイル] タブから [エクスポート] を選択し、データをコンマ区切りまたはタブ制限テキストとして保存します。

このデータは、さらに分析するためにスプレッドシートプログラムで開くことができます。C 8 1 16 1から生成された細胞sphe。Fujiシステムで形質導入したヒト黒色腫細胞を固定し、切片化しました。

細胞周期のSG 2 M期の細胞をマークするAZA greenと、G one phaseの細胞をマークするBerra orangeの共焦点イメージングを行いました。これらの画像が重なっているとき、壊死性コアなどの主要な特徴は期待通りに観察することができます。赤G1の停止細胞は、この壊死性コアの近くで優勢であり、赤と緑の増殖細胞はステロイドの外縁に向かって勾配的に増加するか、酸素と栄養素へのアクセスが最も大きくなります。

半自動画像解析後、フッチ細胞マスクとSスフェロイドのアウトラインを定義することができます。イメージングソフトウェアを使用して、Sスフェロイドの内側または外側の領域の赤細胞と緑色細胞を定量しました。この分析により、G一期停止細胞は内部領域に富み、増殖細胞はステロイドエッジに近いほど優勢であることが示されました。

一度習得すると、この技術は1〜2週間、ステロイドの成長、イメージング、分析を含む時間枠で行うことができます。これらの手順に続いて、ラドをコラーゲンマトリックスに埋め込み、TimeLapse顕微鏡で画像化することができます。その後、タンパク質またはRNA分析を受けることができ、これは、ステロイド内の位置や酸素と栄養素へのアクセスががん細胞の表現型を変えることができるかどうかなどの質問に答えるのに役立ちます。