Name: 高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T14:00:01.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ 高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーション法を用いて、放射性標識により細胞内のホスホイノシチドを正確に定量する方法です。酵母や培養哺乳類細胞における脂質シグナリングの調節機構解明に応用できます。

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C.Y.H. は、オンタリオ州政府からのオンタリオ大学院奨学金によって支援されました。この記事は、R.J.B.がNatural Sciences and Engineering Research Council、Canada Research Chairs Program、およびRyerson Universityから資金提供を受けて作成されました。

注：テキストは、以下に詳細に酵母でPtdInsPsを測定する方法について説明します。これは、3 H- ミオ -イノシトールの 、脂質を抽出し、脱アシル化及び脱アシル化PtdInsPsを分別し、定量化するためのHPLC溶出プロトコルで標識する酵母細胞のための実験の詳細を提供します。最適化と長いHPLC溶出プロファイルを必要とする哺乳動物細胞におけるPtdInsPsのラベリング、脱アシル化、解像度および定量に注意してください。我々は議論中の側面のいくつかを議論してもこれらの詳細は、他の場所で見つけることができます。全体的に、脂質を抽出しアシル基を除去すると、酵母から水溶性GRO-InsPsを抽出する方法が与えられ、 図1に示されています。 酵母におけるラベル付けとの解析法PtdInsPs 1.プロトコル<ol><li> 細胞培養および放射性標識 <ol><li>定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD 600）での光学密度のメディア。 注：これは3 H- ミオ -イノシトールの取り込みに影響を与える可能性があるとして、YPDメディアを使用しないでください。この培養サイズは2-3のHPLCの実行のために十分な材料を提供する必要があります。 </li><li> 12ミリリットル丸底チューブ中で5分間800×gで遠心分離することによって（OD 600 = 1で1mlの文化が〜1×10 7個の細胞が含まれていることに注意してください）酵母細胞の10〜14 ODの合計をペレット化。イノシトールを含まない培地（IFM）の2mlで再懸濁（IFM組成については表1を参照）。 </li><li>遠心分離を繰り返し、メディアを吸引除去します。 IFMの440μlのペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>各試料に3 H- ミオ -イノシトール（1μL=1μCiの）の60μlを添加して、振盪しながら1〜3時間、30℃の成長温度でインキュベートします。 注意：3 H- ミオ -イノシトールのは、放射性メイトであります適切なトレーニングの後に処理されるべきであるリアル。また、3 H含有材料と接触するすべての消耗品が適切に配置されるべきであり、放射性廃棄物として指定されました。 注：成長温度を変化させることができる限り、全ての株が、同じ温度で成長され比較されるように、必要に応じ。 </li><li> 9％過塩素酸500μlのを含むマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液（500μl）を転送し、酸200μlのガラスビーズを洗浄しました。反転によって混合し、5分間氷上でインキュベートします。 </li><li> 10分間最高速度でサンプルをボルテックスし、ガラスビーズを回避するために、ゲルローディングチップを使用して、新しいマイクロ遠心チューブに溶解物を移します。 </li><li> 4℃で10分間12,000×gで試料をペレット化し、上清を吸引します。 </li><li>氷冷100 mMのEDTA、1mlのバス超音波処理によってペレットを再懸濁。以前のように再びペレット化します。 </li></ol></li><li> 脱アシル化および抽出 <oL&gt; <li>たてのメタノールを2.3ミリリットル、40％のメチルアミンの1.3ミリリットル、1-ブタノールと水の0.80ミリリットルの0.55ミリリットルを組み合わせることにより、脱アシル化試薬5.0mlのを準備します。混合するために反転します。 </li><li> EDTAを吸引し、50μlの水にペレットを超音波処理します。 </li><li>脱アシル化試薬の500μlを添加して、混合する超音波処理。室温で20分間インキュベートします。 </li><li>ヒートブロック中で53℃で50分間熱脂質。 3時間またはO / Nを介して真空遠心分離によって完全にサンプルを乾燥させます。 <ol><li>化学トラップは空気が入るの蒸気を防ぐために、真空遠心分離機と真空ポンプとの間に設置されていることを確認します。 </li></ol></li><li>風呂超音波処理によって水300μlのペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 3時間またはO / Nのための真空遠心分離によりサンプルを乾燥させます。もう一度この手順を繰り返します。 </li><li>水450μlのペレットを超音波処理。これは、抽出時の水相です。 </li><li>たてextractioの10ミリリットルを準備1-ブタノールの8.0 mlの、エチルエーテル、ギ酸エチル0.40 mlの1.6 mlで添加することにより、n個の試薬。混合するために反転します。 </li><li>水相に抽出試薬を300μlを追加します。 5分間トップスピードでボルテックス混合物を、2分間、最高速度（18,000 XG）で遠心分離して層を分離します。 </li><li>トップ有機層、インターフェース、およびペレットを避けながら、新しいマイクロチューブに底部の水層を収集します。新鮮な抽出試薬で二回以上の水性相の抽出を繰り返します。 </li><li>完全真空遠心分離によって収集し、水層を乾燥させます。風呂超音波処理によって水50μlにペレットを分散させます。 </li><li> 6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルにシンチレーション液4mlのに各2μlのサンプルを追加します。開いているウィンドウを使用して、液体シンチレーションにより各サンプルにおける（CPM）でカウント数を決定します。 </li><li> HPLCの準備が整うまで-20℃でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li> の分離HPLCによる3 H-グリセロinositides <ol><li>脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、と超純水1Lをフィルタリングすることにより、緩衝液Aを準備します。 </li><li>水に、1Mリン酸アンモニウム二塩基（APS、MW 132.06）の1 L溶液を作ることによってバッファBを準備し、リン酸でpHを3.8に調整します。脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、とリン酸アンモニウムをフィルタリングします。 </li><li>バネ付き250μlの小容量インサートを2ミリリットルバイアルを艤装によって注射バイアルを組み立てます。千万インプレッションをロードし、55μlの総体積のために水を追加します。水55μlのブランクバイアルを準備します。 </li><li> PTFE /シリコンセプタムを装備し、スクリューキャップ付きバイアルに蓋（バイアルの内側に面した赤側）。ブランクバイアルから始まる、HPLCの自動サンプリングトレイに各バイアルを置きます。 </li><li> 、バッファの流れを制御し、HPLCと関連ソフトウェアを使用して、バッファおよびコントロールサンプルinjectiを脱ガスに。シンチラント流量を調節するために、オンラインフローシンチレータおよびその関連ソフトウェアを使用して、3 H-減衰信号を監視します。 <ol><li> X 4.6ミリメートル250ミリメートルの寸法のSAX液体クロマトグラフィーカラムを使用し、HPLCに5μmのシリカ樹脂を含みます。汚染物質の注入を防止するために、カラムガードカラムを装い。 </li><li>フローシンチレータに3 H-互換500μlのフローセルをインストールします。 注：分画はChemStationソフトウェアによって、または他の市販のHPLCシステムを用いて制御のAgilent 1200無限シリーズHPLCシステムを用いて行うことができます。 HPLCの溶離液の流れシンチレーションは、ローラ・ソフトウェアまたは他の市販の流れシンチレータまたは互換性のあるソフトウェアによって制御β-RAMフローシンチレータで行うことができます。 </li></ol></li><li> 100％緩衝液Aと1.0 ml /分の流速で四級ポンプを初期化します</li><li> HPLCで平衡プロファイルを設定5分間の1％緩衝液B、5分間の1-100％のB、5分間100％B、5用100-1％のB：緩衝液AおよびBの勾配（この「プロトコル平衡」と呼ぶ ）を制御します分で、20分間、1％B。 400バール、1.0 ml /分の流速、および30分の実行時の圧力限界を設定します。 </li><li>緩衝液AおよびBの勾配を制御するために、HPLCで溶出プロフィール（ 図2）を設定し （この「プロトコルA」と呼ぶ ）：5分間1％のB、40分間の1〜20％のB、20〜100％ 10分、5分間100％B、20分100-1％のB、10分間で1％BのB。 400バール、1.0 ml /分の流速、および90分の実行時に圧力限界を設定します。 </li><li> 2.5ミリリットル/分、8.57秒の滞留時間のシンチレーション液の流速で、60分間実行する（この「プロトコル検出」と呼ぶ ）の流れシンチレータで検出プロトコルを設定します。 </li><li>プログラムEに続いて「プロトコル平衡 」に水を空白で開始するHPLCで自動注入シーケンス、「プロトコルA」の放射性標識サンプルをACH。準備ができたらシーケンスを初期化します。 </li><li>ランが平衡プロトコルに入れたまま、と全てのサンプルを測定するためのフローシンチレータのバッチを作成する「プロトコル検出を 。」開始するフローシンチレータをトリガしながら、それぞれの新しい試料の注入は、HPLC の 「プロトコルA」を初期化する」 を検出プロトコル 。 &quot; </li><li>すべてのランの完了時、HPLC、カラムをフラッシュし、1.0 ml /分の流速で30分間、100％緩衝液Aを用いてシンチレータを流します。 </li></ol></li><li> データ分析 <ol><li>ローラ・ソフトウェアまたはクロマトグラフィースペクトルを定量化することができる任意の他のソフトウェアを使用してください。このセクションで説明する手順は、図3に示されています。 </li><li> 「ファイル」、「開く」をクリックしてファイルを開いて、各サンプルの生データファイルを選択します。 </li><li> 「クロマトグラム」タブで、ZO時間分解能を維持しながら、より小さなピーク（約1000カウント[Y軸]）のそれぞれを伸ばすことでOM。必要に応じて、それぞれの個々のピークに拡大します。 </li><li> 「ROIを追加」ツールを使用して、分析のための各ピークを強調表示します。 18分にGRO-Ins3P、10分で親グロイン、29分とグロインでのGRO-Ins4P 20分で、グロイン（3,5）P 2（4,5：溶出時間によってピークを同定32分で）、P 2。 </li><li> 「地域・テーブル」タブで、各ピークの「面積（カウント）」を記録します。時間と「終了（MM：SS）」は、各ピークの時間：「（SS mm）の起動」を注意してください。 </li><li>バックグラウンド除去のために、同じ時間に及ぶピークに隣接する領域を強調表示します。対応するピークからのカウント数を減算します。 </li><li> （「合計のPtdInsの％」と表記）親グロインに対する各ピークの面積を正規化します。その後、N」として表現（制御条件に対して、各実験条件での各ピークを正規化倍増加）」を制御するために比較されます。 注：各ピークの正規化は、全カウントに対しても行うことができますが、親のグロインは、結果が似ている傾向にある他のすべてのPtdInsPsよりもはるかに豊富であるため。 </li><li> 「CSV（カンマ区切り） &quot;ファイル形式を&quot; ...として保存」、「ファイル」を押して、クロマトグラフ用のデータをエクスポートし、選択します。スプレッドシート上のデータをプロットし、必要に応じて提示します。 </li></ol></li></ol>

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<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+Ptdlns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (6), 847-858 (1998).</li>
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<li>Sarkes, D., Rameh, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+HPLC-Based+Approach+Makes+Possible+the+Spatial+Characterization+of+Cellular+PtdIns5P+and+Other+Phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides.</a> Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).</li>
<li>Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+between+PIKfyve-synthesized+PtdIns5P+and+PtdIns%283%2C5%29P2+by+means+of+the+PIKfyve+inhibitor+YM201636%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cel.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636.</a> Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).</li>
<li>D'Souza, K., Epand, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+phosphatidylinositols+with+specific+acyl+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).</li>
<li>Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-phosphate+5-kinase+isoforms+exhibit+acyl+chain+selectivity+for+both+substrate+and+lipid+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator.</a> J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).</li>
<li>Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+phosphoinositides+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid.+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact phosphoinositides in biological samples.</a> J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この記事では、酵母からHPLC結合フローシンチレーションによりPtdnsPsの細胞レベルを定量化するために必要な実験プロトコルの詳細について説明します。方法論は、脂質処理、水溶性3 H-GRO-InsPs、HPLC分画と分析を抽出した3 H- ミオ -イノシトールとPtdInsPsの代謝標識を可能にします。 PtdInsについて示されているように、この方法を用いて、種々の条件下での細胞におけるPtdInsPsの相対的レベルは、定量することができる（3,5）は、野生型、vac14の D及びD atg18酵母細胞におけるP 2（ 図4）。 結果を最適化および/またはトラブルシューティングするために行うことができます重要なステップや修正がいくつかあります。 PtdInsPsの信頼できる定量化を達成するための最も重要なパラメータの一つは、全放射能の信号レベルです。一般的に、HPLCに3から5000000カウントを注入することは、多くの場合...

ホスホイノシチド(PtdInsPs)は、シグナル伝達、膜輸送、遺伝子発現など、さまざまな細胞機能の調節を助ける重要なシグナル伝達リン脂質であり、細胞分裂、オルガネラ同一性、代謝活性などの高次細胞の振る舞いを調節します1-3。親リン脂質であるホスファチジルイノシトール(PtdIns)のイノシトールヘッドグループの3、4、および/または5位のリン酸化に由来するPtdInsPには7つの種があります。重要なことに、7つのPtdInsPは不均等に分布しており、各PtdInsP種の局所濃度は、それらが異なるタンパク質エフェクターのセットに結合する特定の細胞内部位で増加または減少する可能性があり、これにより、各PtdInsPがその宿主膜の同一性と機能を制御することができます3,4。さらに、各PtdInsPのレベルは、PtdInsPによって生成される信号強度に大きな影響を与える可能性があるため、厳密に制御する必要があります。各PtdInsPの局在とレベルは、各PtdInsPの合成と代謝回転を媒介する多数の脂質キナーゼ、ホスファターゼ、およびホスホリパーゼの標的化と活性に依存します3,4。したがって、PtdInsP調節機構の誤った制御は細胞機能を混乱させ、癌や変性疾患などの疾患につながる可能性があります2,5,6。PtdInsPとその制御機構の役割と機能を完全に理解するために、PtdInsPを追跡および定量するための顕微鏡ベースおよび生化学ベースの技術が開発されました。
多くの場合、PtdInsPsは特定のタンパク質ドメイン7-9を介してタンパク質エフェクターに結合します。これらのタンパク質モジュールは、タンパク質全体とは別に発現した場合、多くの場合、適切なフォールドおよび脂質認識特性を保持します。これにより、特定のPtdInsP結合タンパク質ドメインを緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光タンパク質(FP)に融合させることにより、顕微鏡によるPtdInsPの細胞内検出が可能になりました。実際、多くの研究がFP融合PtdInsP結合タンパク質モジュールを使用して、生細胞イメージングによって特定のPtdInsP種の局在と動態を同定しています1,10。例えば、GFPに融合したホスホリパーゼC δ1(PLCδ1)のプレクストリン相同性(PH)ドメインは、原形質膜上のホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸[PtdIns(4,5)P2]を特異的に認識しますが、初期エンドソーム抗原1(EEA1)のFYVEドメインのタンデムコピーは、エンドソーム10-13上のホスファチジルイノシトール-3-リン酸(PtdIns3P)を追跡するために使用されています.全体として、顕微鏡法に基づく技術は、PtdInsPの局在とダイナミクスを視覚化するのに最適ですが、PtdInsP結合ドメインが標的PtdInsP分子種以外の他の因子とも相互作用する可能性があることや、FPプローブの細胞質蛍光より下の変化を検出できないことなど、いくつかの注意点があります。
各PtdInsP14-16のレベルを特徴付け、定量化するために、薄層クロマトグラフィー、質量分析、放射性同位元素標識などの生化学的手法も使用することができます。これらの方法では、PtdInsPの細胞レベルを検出するために脂質を単離する必要があります。質量分析は、脂質抽出物からリン脂質を特徴付けるために使用でき、PtdInsPs14,17のアシル鎖組成を決定するために非常に貴重です。しかし、質量分析はほとんどが半定量的であり、同じ分子量のPtdInsP分子種を分離し、同時に定量することは依然として困難です14,17。これに対し、PtdInsPsの放射性同位元素標識とそれに続く高速液体クロマトグラフィー(HPLC)結合フローシンチレーションは、PtdInsPs18の7種すべての分離と同時定量に有用です。強陰イオン交換(SAX)カラムを備えたHPLCを使用すると、分子量、電荷、形状に基づく分離が実現するため、同じ分子量と電荷でも脱アシル化されたPtdInsPs(Gro-InsPs)が分画されます。HPLC溶離液をフローシンチレータに結合すると、元の親グリセロールイノシトール(Gro-Ins)18に対して、各Gro-InsPs分子種について放射性ベースのシグナルピークが生成されます。これは最終的に、細胞内のPtdInsPsの相対レベルに対応します。
PtdInsPの放射性標識とHPLC結合フローシンチレーションは、PtdIns16,19,20の~0.1-0.3%しか構成しないPtdInsPであるホスファチジルイノシトール3,5-ビスリン酸[PtdIns(3,5)P2]の調節と機能を調査するための有用なツールです。PtdIns(3,5)P2の合成は、酵母ではFab1と呼ばれるPtdIns3P 5-キナーゼによって、哺乳類ではPIKfyveによって行われる21。この反応は、酵母ではFig4、哺乳類ではmFig4/Sac3と呼ばれるPtdIns(3,5)P2 5-ホスファターゼによって打ち消されます22-24。興味深いことに、PIKfyve/Fab1とmFig4/Fig4/Sac3はどちらも単一の複合体に存在し、酵母のVac14または哺乳類のmVac14/ArPIKfyveという足場アダプタータンパク質によって制御されています25,26。VAC14欠失酵母細胞では、Fab1は効率的に機能せず、PtdIns(3,5)P2レベル27,28が90%減少します。一方、Atg18は、液胞分裂を制御する可能性のあるPtdIns(3,5)P2エフェクタータンパク質である29。Atg18は、その遺伝子であるATG18の欠失によりPtdIns(3,5)P2レベル29,30が10〜20倍に増加するため、PtdIns(3,5)P2の負の調節因子でもあります。全体として、PtdIns(3,5)P2のレベルの変化は、酵母液胞および哺乳類リソソームの機能に深刻な影響を及ぼし、その結果、膜輸送、ファゴソーム成熟、オートファジーおよびイオン輸送などのプロセスに影響を与える6,19,21,31。
この記事では、野生型、vac14Δ、およびatg18Δ酵母株のPtdIns(3,5)P2の相対レベルを検出するために、酵母中の3H-ミオイノシトールによるPtdInsPの放射性同位体標識のプロセスについて説明します。これを例にとると、個々のPtdInsPの分離に対するHPLCの分離能と、微量の3H-ミオイノシトールを検出するためのフローシンチレーションの感度を示します。また、哺乳類細胞から3つのH標識PtdInsPを標識して分離するための方法論を最適化する方法についても詳しく説明します。これらの細胞は7つのPtdInsP種すべてを持っているため、サンプルはより複雑になる傾向があります。

<table><tbody><tr><td>1-ブタノール</td><td>バイオベーシック</td><td>BC1800</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>リン酸アンモニウム 二塩基性</td><td>バイオショップ</td><td>APD001</td><td>ACS グレード</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>バイオベーシック ADB0060</td><td></td><td>ウルトラピュアグレード</td></tr><tr><td>オートサンプラー</td><td>アジレント</td><td>G1329B</td><td>アジレント 1260 インフィニティ シリーズ</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>シグマ</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Biobasic</td><td>BB0044</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Biobasic</td><td>CT1330</td><td>無水、工業グレード</td></tr><tr><td>パントテン酸カルシウム</td><td>Σ</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II)</td><td>Σ</td><td></td><td>451657 無水</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Biobasic</td><td>GB0219</td><td>無水、バイオテクノロジーグレードの</td></tr><tr><td>ダルベッコの改造イーグルのミディアム</td><td>ライフ</td><td>11995-065</td><td>4.5 g / Lグルコース、110 mg / Lピル酸、L-グルタミン</td></tr><tr><td>ダルベッコのイーグルズミディア</td>ム<td>MPバイオメディカル</td>の修正<td>0916429&nbsp;</td><td>4.5 g / Lグルコース、L-グルアットミンなし、イノシトールなし</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biobasic</td><td>EB0107</td><td>アシッドフリー、超高純度グレードの</td></tr><tr><td>エチルエーテル</td><td>Caledon labs</td><td>1/10/4700</td><td>無水、試薬グレード</td></tr><tr><td>ギ酸エチル</td> シ<td>グマ</td><td>112682</td><td>試薬グレード</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td>米国原産、プレミアム品質、熱不活化</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、透析</td><td>寿命</td><td>26400044</td><td>US起源</td></tr><tr><td>FlowLogic U</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>SG-BXX-05</td><td>フローシンチレーション用シンチレーション液&nbsp;</td></tr><tr><td>葉酸</td><td>バイオベーシック</td><td>FB0466</td><td>USP グレード</td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液</td><td>寿命</td><td>15630080</td><td>1 M 溶液</td></tr><tr><td>イノシトール、Myo-[2-3H(N)]</td><td>パーキン エルマー</td><td>NET114005MC</td><td>9:1 エタノールから水へ</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン</td><td>寿命</td><td>51500056</td><td>100x 溶液</td></tr><tr><td>塩化鉄(III)</td><td>シグマ</td><td>157740</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>ローラ - クロマトグラフィーデータ収集および分析ソフトウェア</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>バージョン 4.2.1.18</td><td>フローシンチレータソフトウェア</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>200&nbsp;mM、溶液、滅菌ろ過、BioXtra、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>無水</td></tr><tr><td>硫酸マンガン</td><td>Biobasic</td><td>MB0334</td><td>一水和物、ACSグレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Caledon labs</td><td>6701-7-40</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>メチルアミン溶液</td><td>Sigma</td><td>426466</td><td>40% (v/v)</td></tr> <tr><td>リン酸</td><td>一カリウムBiobasic</td><td>PB0445</td><td>無水、ACS グレード</td></tr><tr><td>ニコチン酸</td><td>Biobasic</td><td>NB0660</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>OpenLAB CSD ChemStation&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>Rev. C.01.03&nbsp;</td><td>HPLCソフトウェア</td></tr><tr><td>p-アミノ安息香酸(PABA)</td><td>Bioshop</td><td>PAB001.100</td><td>遊離酸</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100X、液体、安定化、滅菌ろ過、細胞培養試験</td></tr>済み <tr><td>過塩素酸</td><td>シグマ244252</td><td></td><td>ACS試薬、70%</td></tr><tr><td>PhenoSpher SAXカラム</td><td>Phenomenex</td><td>00G-315-E0</td><td>5 &micro;m, 80 &Aring;, 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Caledon labs</td><td>1/29/8425</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>バイオベーシック</td><td>PB0440</td><td>ACSグレード</td></tr><tr><td>ヨウ化カリウム</td><td>バイオベーシック</td><td>PB0443</td><td>ACSグレード</td></tr><tr><td>塩酸ピリドキシン</td><td>シグマ</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>クオータナリーポンプ</td><td>アジレント</td><td>G1311C</td><td>アジレント 1260インフィニティシリーズ</td></tr><tr><td>リボフラビン</td><td>バイオショップ</td><td>RIB333.100</td><td>USPグレード</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>バイオベーシック</td><td>DB0483</td><td>バイオテクノロジーグレード</td></tr><tr><td>モリブデン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>243655</td><td></td></tr><tr><td>サーモスタット付きカラムコンパートメント</td><td>アジレント</td><td>G1316A</td><td>アジレント 1260 インフィニティシリーズ</td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>T4625</td><td>試薬グレード;0.02%(W / V)の溶液を作り、懸濁液を形成します。アリコートを混ぜて凍結</td></tr>する <tr><td>ウルティマゴールド</td><td>パーキンエルマー</td><td>6013321</td> 硫酸亜鉛を<td>数える液体シンチレーション用シンチレーションコクテール</td></tr><tr><td></td><td>バイオベーシック</td><td>ZB2906</td>七<td>水和物、試薬グレード</td></tr><tr><td>&ベータ;-RAM 4</td><td>IN/USシステム</td><td>モデル4</td><td>フローシンチレータ - 500 & マイクロ;lフローセル;代替ラジオマティックフローシンチレータアナライザー パーキン・エルマー&nbsp;</td></tr></tbody></table>

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

ホスホイノシチド(PtdInsPs)は、特定のエフェクターを動員し、分子の同一性と機能を持つオルガネラを付与する重要なシグナル伝達脂質です。7つのPtdInsPはそれぞれ、その分布と存在量が異なり、特定のキナーゼとホスファターゼによって厳密に制御されています。PtdInsPの存在量は、さまざまなシグナル伝達イベントや調節機構の擾乱に応じて急激に変化する可能性があります。これらのイベントがどのようにPtdInsPの量の変化につながり、その結果としての影響をもたらすかを理解するには、シグナル伝達イベントの前後、または制御状態と異常状態の間のPtdInsPレベルを定量化することが重要です。しかし、存在量と類似性が低いため、各PtdInsPの相対的な量を定量化することは困難な場合があります。この記事では、PtdInsPに組み込まれている3つのH-ミオイノシトールで細胞を代謝的に標識することにより、PtdInsPレベルを定量化する方法について説明します。その後、リン脂質を沈殿させ、脱アシル化します。得られた可溶性の3H-グリセロ-イノシチドをさらに抽出し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離し、フローシンチレーションによって検出します。酵母サンプルの標識と処理、およびHPLCとフローシンチレータの機器のセットアップについて詳しく説明します。アシル鎖含量に関する構造情報は失われますが、この分析法は感度が高く、細胞内の7つのPtdInsPすべてを同時に定量するように最適化できます。

この方法を用いて、酵母PtdInsPsは、代謝的に3 H- ミオ -イノシトールを用いて標識しました。標識後、リン脂質は、リン脂質脱アシル化し、水溶性GRO-InsPs（ 図1）を抽出し、過塩素酸を用いて沈殿させました。この段階では、それはのPtdIns（3,5）P 2のような非常に低存在量PtdInsPsために十分な信号対雑音比を確保するために、液体シンチレーションによって抽出されたGRO-InsPsに関連付けられた総放射活性シグナルを定量化することが重要です。 5から10000000のCPMの合計を注入する必要があります。酵母細胞は、わずか4 PtdInsPsを示すので（ 図2）に記載のように、分解能は1時間の溶出法を用いて達成することができます。 ここでは、野生型、ΔとΔvac14酵...

ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

本手順の全体的な目的は、ホスホイノシチドの機能と調節を理解するために、さまざまな遺伝的および環境的条件下での細胞内における各ホスホイノシチド種の量を測定することです。ホスホイノシチド脂質は、遊走、複製、メモリー・トラフィッキングなどの細胞機能を制御しています。本手法は、ホスホイノシチドに影響を与える遺伝的および環境的条件を特定し、それらの調節と機能に関する知見を深めるものです。この手法の最大の利点は、細胞内のすべてのホスホイノシチドを正確かつ同時に測定できることです。この方法は酵母におけるホスホイノシチドの調節に関する知見を提供しますが、培養哺乳類細胞にも適用可能です。初めてこの手法を行う方は、標識、処理、および分析に多くの工程を要するため、習得に苦労する可能性があります。まずは放射性標識なしで練習することをお勧めします。まず、酵母株SEY6210を完全合成培地を用い、30 °Cで定常的に振盪しながら対数増殖期中期まで20 mLの液体培養を行います。次に、合計10〜14 ODの酵母細胞を12 mLのラウンドボトム遠心チューブに移し、800 ×gで5分間遠心分離します。培地をデカンテーションで除き、ペレットを2 millilitersのイノシトール不含培地で再懸濁させます。その後、細胞を再度遠心分離します。その後、ペレットを 440 µL のイノシトール不含培地で再懸濁します。細胞を室温で 15 分間インキュベートします。インキュベーション後、トリチウム標識 myo-イノシトールを 60 µL 添加し、30 °C で絶えず振盪しながらさらに 1 〜 3 時間培養します。細胞懸濁液を、500 µLの9%過塩素酸と200 µLの酸洗浄済みガラスビーズを含むマイクロ遠心チューブに移します。チューブを繰り返し反転させて混ぜ合わせ、その後、氷上で5分間インキュベートします。続いて、チューブを最大速度で10分間ボルテックスします。その後、ガラスビーズを吸引しないようゲルローディングチップを用いて、ライセートを新しいマイクロ遠心チューブに移します。次に、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを1 mLの氷冷100 mM EDTA中で、完全に分散するまで超音波処理し、再度遠心分離を行います。遠心分離後、放射性標識されたペレットを含むチューブからEDTAを吸引除去します。50 µLの水を加え、超音波処理してペレットを再懸濁させます。テキストのプロトコルに従って、新鮮な脱アシル化試薬を調製します。次に、脱アシル化試薬を500 microlitersチューブに加え、超音波処理して混合します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。続いて、サンプルを加熱ブロックに移し、53 degrees Celsiusで50分間加熱します。その後、サンプルを真空遠心機に入れ、最低3時間乾燥させます。ペレットを300 µLの水中で超音波処理して再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。その後、真空遠心機を用いてサンプルを最低3時間、完全に乾燥させます。乾燥後、チューブに450 µLの水を加え、完全に分散するまでソニケーションしてペレットを再懸濁させます。テキストプロトコルに従って、新鮮な抽出試薬を調製します。抽出試薬を300 µL加え、最大速度で5分間ボルテックスします。チューブを18,000 ×gで2分間遠心分離し、下層の水相を慎重にピペットで新しいチューブに移します。次に、最終的な水相画分を真空遠心濃縮機で最低3時間乾燥させます。その後、50 µLの水中で超音波処理してペレットを完全に分散させ、サンプルを20 °Cで保存します。最後に、2 µLの試料を6 mLポリエチレンシンチレーションバイアルに入れた4 mLのシンチレーション液に添加し、試料の放射能を測定します。オープンウィンドウ設定の液体シンチレーションカウンターを用いて、バイアルのCPMを記録します。トリチウム標識グリセロイノシチドの分離に向けてHPLCシステムをセットアップするには、まずテキストのプロトコルに従って緩衝液AおよびB、ならびにクロマトグラフィーカラムを調製します。次に、サンプルを10 million CPM分、スプリングロード式の250 µLインサートを備えた2 mLインジェクションバイアルに分注し、水を加えて全量を55 µLにします。PTFEシリコンセプタム付きのスクリューキャップでバイアルを密閉し、同様のバイアルに入れた水ブランクとともに、HPLCシステムのオートサンプラートレイにセットします。HPLCシステムのソフトウェアを使用して、溶出プロトコルをプログラムします。バッファーB 1%で5分間、1%から20%で40分間、20%から100%で10分間、100%Bで5分間、100%から1%で20分間、そしてバッファーB 1%で10分間となるように設定します。ポンプ流量を1.0 milliliters per minuteに、圧力上限を400 barに設定し、90分間运行させます。続いて、フローシンチレータの検出プロトコルを設定し、シンチレーション液の流量を2.5 per minute、ドウェル時間を8.57 secondsとして60分間运行させます。次に、HPLCに自動注入シーケンスをプログラムし、まず平衡化プロトコルに従って水ブランクを走行させ、続いて溶出プロトコルに従って放射標識サンプルを走行させます。平衡化プロトコルが完了する前に、溶出プロトコルによってトリガーされる検出プロトコルを用いて、すべてのサンプルを測定するためのバッチシーケンスをフローシンチレーションカウンタで作成します。HPLCデータを解析するには、まずクロマトグラフ定量ソフトウェアを使用して、各サンプルの生データファイルを開きます。クロマトグラムタブで、時間分解能を維持したままズームインし、小さなピークを拡大します。「add ROI」ツールを使用して、解析対象の各ピークをハイライトし、溶出時間に基づいてピークを同定します。次に、「regions table」タブを使用して、各ピークの位置を確認し、面積を記録します。同時に、各ピークの開始時間と終了時間を記録します。次に、ピークに隣接し、かつピークと同じ時間幅を持つ領域を選択して、各ピークのバックグラウンド除去を行います。表計算ソフトを用いて、その領域のカウント数を対応するピークのカウント数から差し引きます。各ピークの面積を親のグリセロール化イノシトールピークに対して正規化し、親のホスファチジルイノシトールに対するパーセントとして記録します。次に、各実験条件における各ピークをコントロール条件に対して正規化し、コントロールと比較した最終的な倍率増加として表します。［ファイル］をクリックし、［名前を付けて保存］からCSV形式を選択してファイルをエクスポートします。最後に、CSVファイルをスプレッドシートプログラムで開き、データをプロットします。放射標識した酵母ホスホイノシチドの分析はHPLCにより行いました。酵母細胞は4種類のホスホイノシチドのみを生成するため、1時間のダブルグラジエント溶出法で分離が可能です。8分から9分の間に現れるグリセリン化イノシトールのピークが、他のすべてのリン酸化種のシグナルを遮っていた。そのため、放射活性シグナルを積分する前に、他のピークが含まれるトレース部分を拡大する必要がある。このHPLC法を用いて、野生型、ATG18欠損、およびVAC14欠損酵母株におけるホスファチジルイノシトール 3, 5-ビスリン酸の変化を分析した。ATG18欠損変異株が最も多くのホスファチジルイノシトール 3, 5-ビスリン酸を産生し、VAC14欠損変異株が最も少ないことが示されました。習得すれば、適切に実施することでこの手法は4日間で完了させることができます。この手順を行う際は、使用する酵母株や細胞型に応じて、増殖および標識条件を最適化することが重要です。本手順に続き、ホスホイノシチドの検出において、HPLCフローシンチレーションを補完するためにGFP融合バイオセンサーなどの他の手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、放射性標識、抽出、およびHPLC結合フローシンチレーションによるホスホイノシチドの測定方法について十分に理解できたはずです。放射性物質および有機溶媒を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用や適切なトレーニングを受けるなど、常に十分な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。...

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

このビデオでは、定量的フローサイトメトリーを使用して、タンパク質と人工リン脂質小胞との相互作用を示しています。蛍光標識タンパク質が蛍光標識リン脂質小胞に結合すると、平均蛍光強度が増加し、この増加はフローサイトメーターによって検出されます。...

標識タンパク質-リン脂質小胞相互作用を研究するための定量的フローサイトメトリー

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。...

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

ここでは、pH調節に基づく無標識法を用いてタンパク質 - ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。...

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。...

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

ここでは、植物中のイノシトールポリリン酸塩を検出し定量する高感度の方法である[3H]-ミオ-イノシトール標識苗の強力なアニオン交換高速液体クロマトグラフィーについて述べた。...

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸...

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

哺乳類細胞抽出物からのイノシトールピロリン酸の絶対定量のためのキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析の手順が記載されている。...

キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析によるイノシトールピロリン酸の絶対定量(英語)

ここでは、タンパク質と細胞または微小小胞の膜との相互作用を特徴付けるための一連の方法について説明する。...

蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析

学ぶ 高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーション法を用いて、放射性標識により細胞内のホスホイノシチドを正確に定量する方法です。酵母や培養哺乳類細胞における脂質シグナリングの調節機構解明に応用できます。

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

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