高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

この手順の全体的な目標は、ホスホイノシチドの機能と調節を理解するために、さまざまな遺伝的および環境条件下で細胞内の各ホスホイノシチド種の量を測定することです。ホスホイノシチド脂質は、遊走、複製、メモリ輸送などの細胞機能を制御します。この方法は、ホスホイノシチドに影響を与える遺伝的および環境的条件を特定し、その調節と機能に関する知識を増やします。

この技術の主な利点は、細胞内のすべてのホスホイノシチドを正確かつ同時に測定できることです。この方法は、酵母のホスホイノシチドの調節に関する洞察を得ることができますが、培養された哺乳類細胞にも適用できます。この方法に不慣れな方は、ラベリング、処理、分析に多くのステップが必要なため、苦労するでしょう。

まず、放射性ラベルなしで練習することをお勧めします。まず、酵母株SEY6210の20ミリリットルの液体培養物を、摂氏30度の完全合成培地で、丸太相の途中で絶えず振とうしながら培養します。次に、酵母細胞の合計10〜14ODを12ミリリットルの丸底遠心チューブに移し、Gの800倍で5分間遠心分離します。

メディウムをデカントします。そして、ペレットを2ミリリットルのイノシトールフリー培地に再懸濁します。細胞を再度遠心分離します。

次に、ペレットを440マイクロリットルのイノシトールフリー培地に再懸濁します。細胞を室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、60マイクロリットルのトリチウムで標識されたミオイノシトールを加え、絶えず振とうしながら摂氏30度でさらに1〜3時間細胞を増殖させます。

細胞懸濁液を、500マイクロリットルの9%過塩素酸と200マイクロリットルの酸洗浄ガラスビーズを含む微量遠心チューブに移します。チューブを反転させて混合し、氷上で5分間インキュベートします。その後、チューブを最高速度で10分間ボルテックスします。

次に、ガラスビーズが誤嚥されないように、ゲルローディングチップを使用してライセートを新しい微量遠心チューブに移します。次に、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを完全に分散するまで1ミリリットルの氷冷した100ミリモルEDTAで超音波処理し、再度遠心分離します。

遠心分離後、ラジオ標識ペレットが入ったチューブからEDTAを吸引します。50マイクロリットルの水を加え、超音波処理してペレットを再懸濁します。テキストプロトコルに従って新鮮な脱アシル化試薬を調製します。

次に、500マイクロリットルの脱アシル化試薬をチューブに加え、超音波処理して混合します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏53度の加熱ブロックに50分間移します。

その後、サンプルを真空遠心分離機に入れ、最低3時間乾燥させます。300マイクロリットルの水で超音波処理してペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。その後、サンプルを真空遠心分離機で最低3時間完全に乾燥させます。

乾燥後、チューブに450マイクロリットルの水を加え、ペレットが完全に分散するまで超音波処理してペレットを再懸濁します。テキストプロトコルに従って新鮮な抽出試薬を調製します。300マイクロリットルの抽出試薬を加え、最高速度で5分間ボルテックスします。

チューブをGの18000倍で2分間遠心分離し、底部の水層を新しいチューブに慎重にピペットで移します。次に、最終的な水性画分を真空遠心分離により最低3時間乾燥させます。その後、50マイクロリットルの水で超音波処理してペレットを完全に分散させ、サンプルを摂氏20度で保存します。

最後に、6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルに2マイクロリットルから4ミリリットルのシンチレーション液を添加して、サンプルの放射能を測定します。窓が開いている液体シンチレーションカウンターを使用して、バイアルのCPMを記録します。トリチウム標識グリセロイノシチドの分離のためのHPLCシステムをセットアップするには、まず、テキストプロトコルに従ってバッファーAとB、およびクロマトグラフィーカラムを調製します。

次に、1,000万CPMのサンプルを、バネ仕掛けの250マイクロリットルインサートを取り付けた2ミリリットルの注入バイアルにロードし、水を加えて総容量55マイクロリットルにします。PTFEシリコンセプタムを取り付けたスクリューキャップでバイアルをキャップし、HPLCシステムの自動サンプリングトレイに、同様のバイアルにウォーターブランクを入れます。HPLCシステム上のソフトウェアを使用して、溶出プロトコルをプログラムします。

1 パーセントのバッファ B を 5 分間、1 から 20 パーセントの B を 40 分間、20 から 100 パーセントの B を 10 分間、100 パーセント B を 5 分間、100 から 1 パーセントの B を 20 分間、次に 1 パーセントの B を 10 分間バッファします。ポンプの流量を90分間で毎分1.0ミリリットルに設定し、圧力制限を400バールに設定します。これに続いて、フローシンチレータで検出プロトコルを設定し、シンチレーション流体の流量を毎分2.5秒、滞留時間を8.57秒で60分間実行します。

次に、HPLCで自動注入シーケンスをプログラムし、まず水ブランクで平衡化プロトコルを実行し、続いて放射線標識サンプルを溶出プロトコルで実行します。平衡化プロトコルが完了する前に、フローシンチレータでバッチシーケンスを作成し、溶出プロトコルによってトリガーされる検出プロトコルを使用してすべてのサンプルを測定します。HPLCデータを分析するには、まずクロマトグラフ定量ソフトウェアを使用して、各サンプルの生データファイルを開きます。

[クロマトグラム]タブで、ズームインして、時間分解能を維持しながら小さいピークを引き伸ばします。ROIの追加ツールを使用して、分析用の各ピークを強調表示し、溶出時間に基づいてピークを特定します。regions table タブを使用して、各ピークの面積を見つけて記録します。

同時に、各ピークの開始時間と終了時間に注意してください。次に、ピークに隣接する領域を同じ時間にわたって強調表示することにより、各ピークのバックグラウンド減算を実行します。スプレッドシートソフトウェアを使用して、対応するピークのカウントからその領域のカウント数を減算します。

親のグリセリング化されたイノシトールピークに対して各ピークの面積を正規化し、親のホスファチジルイノシトールの割合として記録します。次に、各実験条件の各ピークをコントロール条件に対して正規化し、エンドフォールドがコントロールと比較して増加すると表します。ファイルをエクスポートするには、[ファイル]、[名前を付けて保存]の順にクリックし、CSV形式を選択します。

最後に、スプレッドシートプログラムでCSVファイルを開いてデータをプロットします。放射性標識酵母ホスホイノシチドの分析は、HPLCによって行われました。酵母細胞はホスホイノシチドを4種類しか生成しないため、1時間のダブルグラジエント溶出法で分離を達成できます。

グリセリング化されたイノシトールのピークは 8 分から 9 分で、他のすべてのリン酸化分子種からのシグナルを覆い隠していました。したがって、放射性信号を積分する前に、トレースの他のピークを含む部分を拡大する必要があります。野生型、ATG18欠失、およびVAC14欠失酵母株を、このHPLC法を用いてホスファチジルイノシトール3,5-ビスリン酸の変化についてアッセイした。

ATG18欠失変異体は、ホスファチジルイノシトール3,5-ビスリン酸を最も多く産生し、VAC14欠失変異体は最も産生が少なかったことが示されました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に行えば4日で習得できます。この手順を試行する際には、特定の酵母株または細胞タイプに基づいて増殖と標識条件を最適化することを忘れないでください。

この手順に続いて、GFP融合バイオセンサーなどの他の方法を使用して、ホスホイノシチドの検出のためのHPLCフローシンチレーションを補完することができます。このビデオを見れば、HPLC結合フローシンチレーションによるホスホイノシチドの無線標識、抽出、測定の方法について十分に理解できるはずです。放射能や有機溶剤の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、個人用保護具の着用や適切なトレーニングなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。