Name: 単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぼう、リン酸化タンパク質の単一細胞解析法。シグナル蛍光セルバーコードとリン・フローサイトメトリーを用いて、細胞シグナル伝達異常やバイオマーカー探索、薬理動態評価を効率的に行う手法です。

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この仕事は教授 Kjetil Taskén のラボで実施された、ノルウェーのがん社会と Stiftelsen クリスチャン ゲルハルト ・ Jebsen によって支持されました。原稿の批判的読解のヨハネス ・ Landskron とマリアンヌ Enger を認めた

血液サンプルは、すべてのドナーから次の書面によるインフォームド コンセントを受信しました。研究は、医療と健康研究倫理の南東ノルウェーの地域委員会によって承認された、人間の血液の研究はヘルシンキ宣言8に従って行われました。
注:手順 1-3 は、ティッシュ文化フードの無菌条件下で行わなければなりません。
1. 末梢血単核球 (PBMCs) CLL 患者の血液サンプルからの分離
注意: ヒトの血液バイオ セーフティ レベル 2 の規則に従って処理されます。
<ol><li>1:1 リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈 (PBS: 136.9 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10.1 mM ナ2HPO4 x 2 H2O、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) と 50 mL チューブ (30 mL/チューブ) に移転。</li>
	<li>10 mL のピペットを使用してチューブの底に層の密度勾配媒体 (例えばLymphoprep) 10 mL の慎重に。</li>
	<li>800 x g で 4 ° C で 20 分間遠心PBMCs は密度勾配中のレイヤーの上に表示されます。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して、2 つの新しい 50 mL チューブにセルを転送します。PBS (チューブいっぱい) で 2 回洗浄します。</li>
	<li>350 x g で 15 分間破棄上澄みで遠心し、3 mL の PBS に再懸濁します。</li>
	<li>最寄りのメソッドを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>350 x g で 5 分間破棄で細胞培養上清を遠心分離機します。注:3.2 1.8 の手順は省略可能です。ステップ 3.3 に直接進むため不可能です。</li>
	<li>10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を添加したウシ胎児血清 (FBS) で細胞を再懸濁します、クライオ チューブを使用して適切な因数でフリーズします。 注:DMSO は、細胞に有毒です。セルは FBS/DMSO と混合されて一度高速動作します。細胞は液体窒素で長期保存をすることができます。</li>
</ol>2. 細胞の融解
<ol><li>すぐに雪解けの 37 ° C の水浴のセル。 注:DMSO は、細胞に有毒です。DMSO への露出を制限するために高速動作します。</li>
	<li>冷たいロズウェル パーク記念研究所媒体 (補足 GlutaMAX で RPMI 1640 参照テーブルの材料) の 10 mL で一度セルを洗います。</li>
	<li>300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>ピルビン酸ナトリウム、MEM 非必須アミノ酸とペニシリン/ストレプトマイシン (指示に従って 1 倍希釈に追加)、10% 添加 RPMI 1640 培地で細胞を再懸濁します FBS。小細胞培養用フラスコにセルを転送し、5% CO2、調整する細胞を許可する 1 時間の 37 ° C の定温器に残します。</li>
</ol>3. 細胞の調製
<ol><li>最寄りのメソッドを使用して実行可能なセルを数えます。</li>
	<li>50 mL のチューブにセルを転送し、300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>1% 添加 RPMI 1640 培地 (手順 2.2) で細胞を再懸濁します以上 50 x 106セル/mL に FBS。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートの井戸に細胞懸濁液の必要量を転送します。 注:井戸の数は、テストする条件の数に対応します。刺激の時間コースのサンプルは、単一の井戸から描かれています。時間ポイント + デッド ボリュームの 50 μ L あたり 50 μ L のサンプルを計算します。補正コントロール (1 つの無染色サンプル + バーコード色素あたり 1 つのサンプル) のサンプルを保存します。</li>
	<li>96 ウェル プレートを予熱の 37 ° C の水浴に転送します。10 分間細胞を休ませます。</li>
</ol>4. 刺激と細胞の固定
注:研究室のベンチ (すなわち、ない滅菌) に 4-8 の手順を実行します。
注意: バッファーの修正の主な成分私は有毒であるパラホルムアルデヒド (吸入および皮膚の接触)。取り扱いに注意。
<ol><li>バッファーの修正の 60 μ L で 96 ウェル V 底プレートを準備サンプルあたりよく当り。37 ° C の水浴のままにします。 注:細胞: 修正プログラム バッファーは 1:1 にする必要があります。37 ° C で蒸発のために、修正プログラム バッファーは当初豊富です。</li>
	<li>必要に応じて、刺激前に薬剤とセルを扱います。</li>
	<li>固定プレートに 50 μ L コントロール サンプルを転送します。上下にピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>必要に応じて、10 μ g/mL 抗 IgM をセルに追加することによって刺激の時間コースを開始します。上下にピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>各時点で、50 μ L のサンプルを固定プレートに転送します。上下にピペッティングで混ぜます。 注:抗 IgM 誘導は通常早期開始シグナル伝達 (分)。</li>
	<li>最後のサンプルが追加された後は、10 分の 37 ° C で固定プレートを残します。</li>
</ol>5. 蛍光セル バーコード (FCB)
注:バーコード化試薬の一覧については表 1を参照してください。
<ol><li>3 固定セルを洗浄して x は PBS (井戸を埋める)。</li>
	<li>500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>バーコード化試薬を用いる 96 ウェル V 底プレートを準備します。ピペット 5 μ L の組み合わせ染色染色マトリックス、例えば図 1 bで、次のすべてのサンプルに必要な数の井戸あたり各バーコードの試薬。各サンプルでお越しの際にも異なるバーコード濃度のユニークな組み合わせ。</li>
	<li>190 μ L の PBS とバーコード プレートに伝達の細胞を再懸濁します。ミックス徹底的。 注:各バーコードの試薬に使用される最終的な濃度が最も高い 1 つの補正サンプルを染色し、1 無染色標本を保存します。</li>
	<li>暗闇の中、室温で 20 分間細胞を残します。</li>
	<li>ステンド グラスのセル 2 を洗う流れ洗う (PBS、1 %fbs、0.09% アジ化ナトリウム) と x (井戸を埋める)。</li>
	<li>500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>セルに流洗浄の 190 μ L を追加し、1 つ 15 mL チューブにバーコードのサンプルを組み合わせた。別の 1.7 mL チューブに各補償制御を転送します。</li>
	<li>500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
</ol>6. 透過をセル細胞内抗原染色
注意: パーマ バッファー III の主な成分は毒性 (吸入および皮膚の接触)、可燃物であるメタノールです。取り扱いに注意。
<ol><li>パーマ バッファー III の 2 mL を 15 mL チューブに転送します。それは使用時に冷たいので、-20 ° C で残します。 注:パーマ バッファーは、実験開始から-20 ° C で残すことができます。</li>
	<li>冷たいパーマ バッファー (15 mL チューブ) でバーコード セル人口の 1.5 mL と 100 μ L 各コントロールに追加補償 (1.7 mL の管) の drop-wise 細胞の凝集を避けるためにボルテックス中。</li>
	<li>-80 ° C に直接セルを転送します。30 分の最小値のままにします。 注:この時点でテストを一時停止するは当然です。パーマ バッファー内セルは-80 ° C で長期保存をすることができます。</li>
</ol>7. 抗体の汚損
注:報告されたリン酸化特異的抗体のリストについては材料の表を参照してください。
<ol><li>-80 ° C から氷のボックスにセルを転送します。</li>
	<li>流れ洗浄で 3 x を洗ってください。 注:細胞ペレットにして過剰に洗浄フローを追加することが重要だなど各補償制御フロー洗ってバーコード細胞集団に、1 mL の 3 mL を加えます。</li>
	<li>500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。</li>
	<li>リン抗体染色あたり 25 μ L の細胞懸濁液を可能にするフロー洗浄のボリュームでバーコードの細胞を再懸濁します。流れ洗浄 200 μ L で補正コントロールを再懸濁します。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートの汚損のための抗体を準備します。最終巻を 50 μ L/ウェルとなります。好評につき、10 μ、15 μ L と細胞懸濁液を 25 μ l 添加の最終巻に流れ洗浄に希釈表面マーカーの最終巻に流れ洗浄で希釈したリン酸化型特異抗体を追加します。 注:抗体希釈液は、実験前に滴定する必要があります。アイソタイプ コントロールが含まれます。</li>
	<li>暗闇の中、室温で 30 分間細胞を残します。</li>
	<li>洗浄染色セル 2 x フロー洗浄 (井戸を埋める)。</li>
	<li>500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>流れ洗浄の 150 μ L で細胞を再懸濁します。</li>
</ol>8. 補正コントロールの準備
<ol><li>抗体の汚損と並行して標識抗体螢の補正コントロールを準備します。ベンダーの指示に従って補償ビーズを使用します。</li>
</ol>9. フローサイトメトリー解析
注:実験は、流れの cytometer で高スループットのサンプラー (HTS) で実行できます。
<ol><li>無染色のコントロールと光電子増倍管 (PMT) 電圧を最適化します。</li>
	<li>補正コントロールを実行し、補償行列を計算します。</li>
	<li>サンプルを実行します。イベント発生率は、装置の仕様に従ってする必要があります。</li>
</ol>10. ゲート戦略およびデータ分析
<ol><li>FlowJo または Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) のような流動フローサイトメトリー解析ソフトを実験から FCS ファイルをインポートします。</li>
	<li>ゲートの戦略<ol>
<li>対SSC のプロットによってリンパ球を選択密度ドット プロットで FSC A。</li>
		<li>リンパ球を表示し、印刷対SSC の FSC - w. によって、シングレットを選択</li>
		<li>セルを SSC の対表面マーカー プロットすることによって入力単一細胞およびゲートを表示します。</li>
		<li>パシフィック ブルー対SSC の密度プロットでセル型人口を表示し、パシフィック ・ ブルー染色に基づいて別の FCB 集団を選択 (図 1A参照)。</li>
		<li>リン抗体チャネル FCB チャネルまたはヒートマップとしてプロット リン酸化イベントを表示する (参照してください図 1 a)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アイソタイプ コントロール対リン信号の MFI (平均蛍光強度) の双曲線逆正弦 (arcsinh) を用いたリン信号を計算 (基底のリン酸化レベルは、図 1を参照)、または刺激対の非刺激細胞 (図 1E参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
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<li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

著者は、何を開示します。

リン フローサイトメトリーは、単一細胞におけるタンパク質リン酸化レベルを測定する強力な手法です。メソッドは、抗体で染色に依存しているので、リン フローサイトメトリーは抗体の可用性によって制限されます。さらに、信頼性の高い結果を得るために全ての抗体滴定、使用する前に検証します。リン酸化型特異抗体の滴定のための詳しいプロトコルがされている12を他の場所で説明されています。パネルのデザイン、時に信号対雑音比の検討は重要です。提示の例では、全てのリン酸化抗体は Alexa Fluor 647 に共役しました。この蛍光の多い低対とサンプル間の最適な差動リン酸化蛋白質の高レベルを提供します。さらに、リン蛋白質の 1 つだけの色を使用して、他のチャンネルが残ります無料 FCB と表面マーカー染色します。このパネルのデザインは、リンのチャンネルに波及を低減します。同じ fluorophore に活用される全てのリン酸化抗体を持っていることによってデータ分析も簡単になります。
提示プロトコルで固定とセルの透過後すべての抗体染色を行った...

リン フローサイトメトリーを使用して、単一セルの解像度でタンパク質リン酸化レベルを分析します。メソッドの全体的な目標は、指定された条件の下で携帯電話の信号パターンをマップすることです。フローサイトメトリーの多項目の能力を悪用し, 末梢血など異種細胞集団のさまざまなサブセットでいくつかのシグナル伝達経路を同時に分析できます。これらの特徴は、免疫組織化学、酵素免疫測定法 (ELISA)、蛋白質のアレイ、逆相蛋白質配列 (セルシグナル)1など他の抗体に基づく技術上の利点を提供しています。リン フローサイトメトリーの併用蛍光セル バーコード (FCB) を混ぜ合わせた、ステンド グラスおよび単一のサンプル2として分析できるように、個々 のセルのサンプルが蛍光染料の独特な特徴と分類されることを意味することができます。これは抗体の使用量を削減、コントロールと扱われたサンプルの組み合わせによるデータ保全性を向上、習得のスピードを向上します。合計 FCB 人口の小さいサンプルに分割および開始材料の量に応じて、最大 35 の異なるリン酸化型特異抗体で染色できます。大型プロファイル実験は、標準の cytometer ハードウェアで、それにより実行できます。リン フローサイトメトリーは、慢性リンパ性白血病 (CLL)3,4、5、急性骨髄性白血病 (AML) を含むいくつかの血液がんの患者サンプルのシグナルのプロファイルに適用されています。6非ホジキン リンパ腫7。リン フローサイトメトリー、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。
ここでは、CLL 患者サンプル リン フローサイトメトリーによる解析のための最適化されたプロトコルは、(図 1 a) を提供しています。基底の信号特性評価、抗 IgM/B 細胞受容体刺激薬摂動の例のとおりです。FCB マトリックスの詳細な説明が提供されます。プロトコルは他の懸濁液の細胞型に適応できます。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>細胞培養培地への添加物</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>細胞培養培地への添加物</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>細胞培養液への添加物</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>密度勾配培地</td></tr><tr><td>Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>B細胞受容体の刺激用</td></tr><tr><td>BD Phosflow Fix Buffer I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>Fixation buffer</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm Buffer III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>透過化バッファー</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>バーコード試薬</td></tr><tr><td>Pacific Blue Succinimidyl Ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>バーコード試薬</td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>バーコード試薬</td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>Defined by user</td><td></td> <td>Correct species反応性</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ<</td><td>em> ユーザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td> ユーザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル V底プレート</td>によって定義<td> ></td><td></td><<td>フローサイトメーターと互換性</td></tr>あり <tr><td>遠心分離機</td><td> ユーザー</td><td></td><td>エッペンドルフチューブ、ファルコンチューブ、プレート</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td> ユーザー</td><td></td><td>温度調整</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> ユーザー</td><td></td><td>ハイスループットサンプラー(HTS)付き</td>によって定義</tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4075</td><td>Clone: D9E Reference:</>strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, 血液学、101(2):e59-62 Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 参照:</ストロング> Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone: J117-1278 参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, 正常および変換における近位シグナル伝達の調節&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td></td> <td>558129Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; 参考文献: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td></td> <td>558134Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta;(pY142)</td><td>ベクトン・ディキンソン・ファーミンゲン</td><td>558489</td><td>Clone: K25-407.69 Reference: Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>Clone: D2C8 >Reference:</tr><tr><td>I&kappa;B&アルファ;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5743</td><td>Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>Clone: I58-1169 Reference:</ストロング> Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone: 4/LCK-Y505&nbsp; Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget、9(10):9273-9284 Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa;B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring;, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa;B p65 (pS536)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4887</td><td>Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring;, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4552</td><td>Clone: 28B10 参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>Clone: E10 参考文献: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring;, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal 参考文献: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference:</>strong Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma;2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>Clone: J112-906 Reference:</>strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4851</td><td>Clone: D57.2.2E Reference:</>strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9257</td><td>Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>Clone: J141-668.36.58&nbsp; Reference: Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone: 4a&nbsp; Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>Clone: 47/Stat5(pY694) Reference:</>strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>Clone: 18/P-Stat6 参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12081</td><td>Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Sk&aring;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, B細胞受容体シグナル伝達の明確なパターン&hellip;, ブラッド、129(6):759-770</td></tr></tbody></table>

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

異常な細胞シグナル伝達は、癌の発生と進展に中心的な役割を果たしています。最も新しい目標とされた療法は確かにタンパク質とタンパク質機能に向け、細胞シグナル伝達異常したがって個別の治療オプションを示すバイオ マーカーとして役立つかもしれない。DNA および RNA の解析ではなくタンパク質活性の変化はより効率的に薬剤感受性および抵抗性のメカニズムを評価できます。リン フローサイトメトリーは、細胞レベル、他の抗体に基づくアプローチからこのメソッドを区別する重要な特徴でタンパク質リン酸化イベントを測定する強力な手法です。メソッドは、複数のシグナル伝達タンパク質の同時解析できます。蛍光セル バーコードと組み合わせると、短い時間で標準の cytometer ハードウェアによって大きな - ハイスループット データ セットを取得できます。リン フローサイトメトリーは、基礎生物学の研究と臨床研究、信号解析、バイオ マーカーの探索と薬理学の評価などの両方のアプリケーションを持ってください。ここでは、例として慢性リンパ性白血病細胞を用いて精製した末梢血単核細胞のリン流れ解析のため詳細な実験的プロトコルが提供されます。

図 1 aにリン流れの cytometry のプロトコルの主な手順を示します。提示の例では、CLL 細胞は 4 希釈でパシフィック ・ ブルー バーコード化試薬で染色しました。三次元バーコードは、図 1 bに示すように 3 つのバーコードの染料を組み合わせることで実行できます。個々 のサンプルは、各バーコード試薬対SSC A (図 1) にその後ゲートで、deconvoluted します。バーコード化試薬の詳細については、表 1に表示されます。
ここで説明する手順に従って、リン酸化蛋白質のレベルは B 細胞 CLL 患者と様々 な条件3の下で健常人で特徴付けられました。20 B...

ここでは、細胞レベルでのタンパク質のリン酸化イベントの媒体-高スループット分析のためのプロトコルが表示されます。リン フローサイトメトリーは、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

この方法は、シグナル伝達経路が異なる刺激や薬物によってどのように影響を受けるかなど、細胞生物学や免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一セルシグナル伝達解析を中~高スループット方式で実行できることです。補充されたRPMI 16/40培地で細胞を再懸濁した後、必要量の細胞懸濁液を96ウェルVボトムプレートのウェルに移す。プレートを予熱した摂氏37度の水浴に移し、そこで10分間休ませます。その後、新しい96ウェルプレートの各ウェルに固定バッファの60マイクロリットルを1つ追加し、固定プレートを設定します。このプレートを摂氏37度の水浴に入れます。50マイクロリットルのコントロールサンプルをプレートに移し、上下にピペットで混ぜます。必要に応じて、ミリリットルの抗IgMあたり10マイクロリットルを細胞に加え、シミュレーションタイムコースを開始し、上下にピペットで混合します。50マイクロリットルのサンプルを各時点でフィックスプレートに移し、各サンプルを加えるにつれて混合する。最後のサンプルを加えた後、10分間水浴中に固定プレートを残します。まず、細胞をPBSで3回洗浄する。5分間Gの500倍のプレートを遠心し、上清を捨てます。次に、バーコーディング試薬を用いてフレッシュな96ウェルVボトムプレートを調製し、各々のサンプルを染色するのに必要なウェルの数を各ウェルに各バーコード試薬の5マイクロリットルをピペット化して、各サンプルを染色するのに必要なウェルの数を充填する。固定セルプレートでは、各ウェルの細胞を190マイクロリットルのPBSで再懸濁する。次に、各ウェルの細胞をバーコードプレート内の対応するウェルに移し、各ウェルをよく混合する。プレートは暗闇の中で20分間室温で休ませます。5分間Gの500倍のプレートを遠心し、上清を捨てます。この後、フロー洗浄で各ウェルの細胞を2回洗います。その後、細胞の各ウェルに190マイクロリットルのフローウォッシュを加えます。バーコード化されたサンプルをすべて15ミリリットルチューブに結合し、各補償制御を別の1.7ミリリットルチューブに移します。500回Gで5分間遠心分離機を、上清を捨てる。開始するには、パーマバッファー3の2ミリリットルを15ミリリットルチューブに移します。マイナス20度で保管して、使用すると氷が冷たくなります。準備ができたら、セルの凝集を避けるために渦を打ちながら、バーコード化された細胞集団を含む15ミリリットルのチューブに1.5ミリリットルの氷冷パーマバッファーを加えます。同じ方法で各補償制御に氷冷パーマバッファーの100マイクロリットルを追加します。すぐに最低30分間マイナス80度で冷凍庫にセルを移します。抗原染色を開始する準備ができたら、冷凍庫から細胞を取り除き、氷の箱に移します。過剰なフロー洗浄で細胞を3回洗います。5分間500倍Gと摂氏4度で細胞を遠心分離します。上清を捨てて、流量洗浄の中でバーコード化された細胞集団を再中断し、例えばリン酸化抗体染色当たり25マイクロリットルの細胞懸濁液があるということである。200マイクロリットルのフロー洗浄で補償制御を再中断します。染色用の抗体の調製を開始するには、フロー洗浄で希釈した10マイクロリットルのリン酸特異的抗体を、新鮮な96ウェルVボトムプレートの各ウェルに加えます。表面マーカー15マイクロリットルを加え、フローウォッシュで希釈し、各ウェルに25マイクロリットルのセルサスペンションを加え、井戸あたり50マイクロリットルの最終体積を確保します。細胞は暗闇の中で室温で30分間休ませます。この後、染色した細胞を流れ洗いで2回洗います。5分間Gの500倍で遠心分離機。上清を捨て、フロー洗浄の150マイクロリットルで細胞を再中断します。次に、テキストプロトコルで概説されているようにフローサイトメトリー解析を行います。提示されたプロトコルでは、3つのバーコード染料を組み合わせることにより3次元バーコードが行われる。個々のサンプルは、次に各バーコード試薬対側散乱領域の後続の格子によって分解される。B細胞受容体の下流にある20のシグナル伝達分子の基底および刺激誘導リン酸化レベルは、次いで、CLL患者からのB細胞および様々な条件下での正常な制御において特徴づけられる。stat3ホスホチロシン705は、大幅に上昇する規制が見られる。細胞は、B細胞受容体経路を介して誘導されるシグナル伝達収差を同定するために、最大30分間抗IgMで刺激される。変異していないIGVH患者からのCLL細胞は抗IgM刺激に対する感受性を増加させるが、AKT蛍光体セリン473に対して統計的に有意である。次に細胞はPI 3キナーゼデルタ阻害剤イデラリシブに曝され、異常なAKT pS473シグナルが逆転できるかどうかを試験します。ここに示すように、異常レベルは、CLL細胞における異常シグナル伝達を正常化するためにキナーゼ阻害剤を適用できることを示す濃度依存的な方法での治療時に有意に低下する。この手順を試みる前に、バーコード試薬と抗体をティンテリングし、選択した表面マーカーが固定および透過性試薬と互換性があることを確認することが重要です。細胞は、蛍光体分析のために懸濁液である必要があるが、それでもプロトコルは、全体のトリプジネーションのような単一細胞懸濁液を得るために手順に従って異常細胞または組織に適応させることができる。

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