の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイエンテロコッカス属。およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

このデュプレックスデジタルPCRアッセイの全体的な目標は、水中の一般的な糞便汚染とヒトに関連する糞便汚染を同時に定量化することです。このアッセイは、一般的な糞便指標、すなわち腸球菌、さらに重要なことには人間の糞便関連HF183マーカーが水域にどれだけあるかなど、レクリエーションの水質管理における重要な質問に答えるのに役立ちます。

このアッセイの主な利点は、1回の反応で2つのターゲットを定量化し、qPCRと比較して、標準曲線を実行する必要がなくなり、したがって関連するバイアスとばらつきがなくなることです。手順を実演するのは、シニアリサーチテクニシャンのメレディス・レイスです。この手順を開始するには、まず、プロトコールテキストに記載されているように、Molecular Grade WaterのすべてのプライマーとTEPH 8 Bufferのプローブについて、1リットルあたり100マイクロモルのストック濃度を調製します。

次に、適量のDigital PCR Mix、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、蛍光プローブ、およびNuclease-Free Waterを混合して、Master Mixを調製します。溶液に気泡が入らないように注意しながら、少なくとも10回ピペットで上下させて混合します。dPCR Master Mixは従来のqPCR Master Mixよりも粘性が高いため、均質な溶液を作るためにはピペッティング技術による混合を使用する必要があります。

これにより、下流での正確なdPCR定量が可能になります。サンプルを二重に実行するための液滴生成用アッセイ混合物を作成するには、マスターミックスの36マイクロリットルを通常のPCRプレートにピペットで移します。36マイクロリットルのマスターミックスのそれぞれに、12マイクロリットルのDNAテンプレートを混合し、プレート上の対応する複製ウェルを空にします。

アッセイが適切に実行されていることを確認するためのポジティブコントロールを含めます。テンプレートコントロールやNTCを一切使用しないことで、プレート内に汚染がないことを確認し、後でデータ解析のために蛍光ベースラインを設定します。液滴発生器を設定する前に、マルチチャンネルピペットを使用してアッセイ混合物を約15回上下にピペットで混合します。

混合物内でアクセス気泡が発生しないように、ピペットチップが液体内に留まることを確認してください。次に、8ウェルの入ったカートリッジ1を白いカートリッジホルダーに挿入し、カートリッジホルダーをカチッと閉めます。カートリッジ1はしっかりと固定され、液滴が発生してもホルダーから外れることはありません。

マルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルのアッセイ混合物を、気泡を生じさせることなく、カートリッジでマークされたサンプルの中央位置に静かに移します。液滴生成オイルの70マイクロリットルでカートリッジの左側にオイルをピペットで固定します。カートリッジをガスケットで覆い、ガスケットが平らで、カートリッジの端に向かって 4 つのティックで均等に保持されていることを確認します。

液滴発生器の緑色に点灯したボタンを押してドアを開き、カートリッジを置きます。もう一度ボタンを押すと、発電機が閉じます。ドアが閉まると、緑色のボタンが暗くなり、ドアを再度開くことができなくなります。

液滴生成はすぐに開始され、約1分間続きます。液滴生成の進行中に、カートリッジ2を2つ目の白いカートリッジホルダーに入れ、カートリッジ1と同じ方法で準備します。液滴生成が完了すると、薄暗いボタンが緑色に変わります。

液滴発生器のドアを開き、カートリッジホルダーが入っている白いカートリッジホルダーを取り外して脇に置きます。カートリッジ 2 を液滴発生器に入れます。カートリッジ1からガスケットを取り外して廃棄します。

白いカートリッジホルダーをクリックしないと、新しく生成された液滴が破損する可能性があるため、クリックしないでください。40マイクロリットルに設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、チップをカートリッジのマーク付き液滴の3列目に45度の角度で挿入し、すべての液滴をゆっくりとピペットで持ち上げます。ピペットチップをウェル壁の約半分まで当て、液滴をゆっくりと排出することにより、それらを最終PCRプレートに移します。

同様に、カートリッジ 2 の Droplet Generation が完了したら、カートリッジ 2 からガスケットを取り外し、生成された Droplet を最終的な PCR プレートに移します。プレートの上に穴あきホイルカバーを置き、プレートシーラーの上に置きます。シーラーを摂氏180度に設定し、シーラーの再生を押して、10秒間シールします。

この手順を開始するには、密封された最終PCRプレートをサーモサイクラーに入れます。最終PCRプレートと互換性があり、毎秒2°Cの温度上昇速度のサーモサイクラーを使用してください。次のサーマルプログラムを摂氏95度で10分間実行し、次に摂氏94度で30秒、摂氏60度で60秒のサイクルを40サイクル実行し、その後、摂氏98度で10分間保持します。

サイクリングが完了したら、プレートを液滴リーダーに移し、各ウェルの各液滴中の蛍光を自動的に測定します。液滴の読み取りに進む前に、液滴が室温にあることを確認してください。付属のソフトウェアを開いて、Droplet Readingをセットアップすることから始めます。

空の96ウェルプレートの概略図を含むデフォルトのセットアップメニューで、ウェルA1をダブルクリックして、Sample、Assay 1、Assay 2の3つのセクションを含むメニューを開きます。[サンプル] セクションで、[名前] というラベルのボックスにサンプル ID を入力し、右側の [適用] とマークされたボックスをオンにします。次に、[experiment] というラベルの付いたプルダウン メニューをクリックし、[Rare Event Detection] で [RED] を選択し、[Enter] をクリックします。

アッセイ 1 と表示されているセクションに移動します。Nameセクションで、Assayに入力し、Enterをクリックします。[Type](タイプ)というラベルの付いたボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、[Channel 1 Unknown](チャネル1)を選択して[Enter](Enter)をクリックします。

「アッセイ 2」と表示されているセクションに移動します。Nameセクションで、Assayに入力し、Enterをクリックします。[Type](タイプ)の下のボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、[Channel 2 Unknown](チャネル2不明)を選択して、Enterキーを押します。

前のステップのすべての情報は、液滴を含むすべての後続のウェル A1.Name ウェルに存在するようになりました。合計セットアップ時間を節約するには、シフトまたはコントロールをクリックして、複数のウェルを同時に選択します。プレートのデジタル描写が物理プレートを反映している場合は、メニューの右下にある[OK]を押します。

プレート回路図の上部に表示される新しいメニューの[テンプレート]で、[名前を付けて保存]を選択し、プレートに名前を付けて保存します。画面の左側にある[Run]をクリックし、ポップアウトの[Run Options]ウィンドウで適切なDye Setを選択します。データ収集が開始され、ソフトウェアにリアルタイムで表示されます。

リーダーが終了し、「実行完了」というボックスが表示されたら、「OK」をクリックします。正の液滴と負の液滴の間の分離を確認してください。NTCウェル内のすべての液滴の蛍光灯がベースラインに近いことを確認します。[イベント] というラベルの付いたボタンをクリックします。

下部にある「Single」というボックスをクリックし、表示されたヒストグラムの右側にある「Total」というボックスをクリックして、ウェルごとに受け入れられる液滴の総数を表示します。10, 000 液滴未満のウェルを除外するには、コントロールキーを押したまま、除外するウェルをクリックします。「1D Amplitude」と表示されているボタンをクリックして、蛍光閾値を両方のターゲットのNTCウェル内の負の液滴の約1標準偏差に設定します。

画面の左端にある [Auto Analyze] (自動分析) の下に 2 つのしきい値ボタンが表示され、ピンクの実線が通る右側のアイコンを選択します。各振幅グラフの下にある「Set Threshold」の左側にあるボックスをクリックし、適切な蛍光しきい値を入力します。その後、マイクロリットル反応あたりのコピー単位の目標濃度が自動的に計算されます。

結果をCSVファイルにエクスポートするには、1D Amplitude画面の左上隅にある[エクスポート]ボタンをクリックします。CSVファイルでは、エクスポートされたターゲット濃度を4倍にして、マイクロリットルあたりの反応あたりのターゲットのコピーから、マイクロリットルあたりのターゲットのコピーDNAテンプレートに変換します。この図は、デジタルPCRアッセイのデュプレックスフォーマットとシンプレックスフォーマットを比較したものです。

左右のパネルには、Enterococcus と HF183 Quantification がそれぞれ表示され、デュプレックスとシンプレックスの結果の間の対応する相関係数が表示されます。実線は回帰線を示し、灰色の網掛けは対応する標準誤差を示します。さまざまな種類のサンプルが記号で示されます。

結果は非常に一貫性があり、EnterococcusとHF183が1つの反応で同時に測定されたか、2つの反応で別々に測定されたかを区別できないことがよくあります。デジタルPCRアッセイは、qPCRアッセイが許容する濃度よりも1桁から2桁高い濃度の阻害剤にも耐えることができます。この図は、PCRを阻害するフミン酸の濃度の増加とともにスパイクされた清浄な下水DNA中のHF183マーカーのqPCRおよびデジタルPCR定量を示しています。

阻害剤がない場合に予想されるHF183定量は、2つの水平点線の間の95%信頼のインターフォールドとして定義されます。三角形で示されるデジタルPCRは、1マイクロリットルあたり15ナノグラムの反応でフミン酸濃度まで正確な定量を提供し続けますが、十字で示すqPCRは1マイクロリットルあたり1ナノグラムで過小評価され始め、マイクロリットルあたり5ナノグラムで完全に阻害されます。このビデオを見た後、この経腸HF183デュプレックスドロップレットデジタルPCRアッセイまたは異なるプライマーとプローブを使用して他の同様のアッセイを実行する方法をよく理解しているはずです。

2015年にWater Research誌に掲載されたこのデュプレックスアッセイの開発以来、私たちは一般的な糞便指標細菌、微生物追跡マーカー、および水系病原体を標的とする他の多くのデジタルPCRアッセイを開発し、検証してきました。これらのアッセイは、ターゲットの直接的かつ偏りのない定量を提供し、水質検査分野ではqPCRアッセイの有用な代替手段になりつつあります。