Name: の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイエンテロコッカス属。およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学ぶ二重デジタルPCRアッセイでEnterococcus属とHF183マーカーを同時定量し、レクリエーション用水の糞便汚染を正確に評価する方法。この技術は標準曲線不要でバイアスを低減し、水質モニタリングの効率を向上させます。

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1.アッセイ混合物の準備<ol><li> TE pH8の緩衝液中の全ての分子グレードの水でプライマーおよびプローブ[エンテロF1A、エンテロR1、GPL813TQ 12のために100マイクロモル/ Lのストック濃度を作ります。 HF183-1、BthetR1、BthetP1 3]。 注：2のターゲットのためのプローブは、蛍光材料/機器のリストに示されているように異なる蛍光体7で標識されています。 </li><li>反応計画ごとに、混合することにより、マスターミックスを調製する、12μlのデジタルPCRミックス（2回の在庫、材料/機器のリストを参照してください）​​、0.216μlの各フォワードおよびリバースプライマー、0.06各蛍光プローブ、および5.016μlのヌクレアーゼを含まない水μL（最終濃度：900 nMの各プライマー、250nMの各プローブ）。上下ピペット少なくとも10倍溶液に気泡を導入しない注意しながら混合します。 </li><li> 6μlのDNAテンプレートに混合正規のPCRチューブあるいはプレートにピペット（ステップ1.2から）18μlのマスターミックスは、（説明previouとして抽出しますずるい13）の液滴生成のためのアッセイ混合物を作るために。重複してサンプルを実行している場合は、ピペットマスターミックス36μlの各ウェルに12μlのDNAテンプレート。プレート上の対応する複製ウェルは空のままにしておきます。ポジティブコントロール（ マテリアル/機器のリストを参照）、鋳型なしのコントロール（NTC）（ すなわち 、テンプレートとして使用される分子グレードの水で）が挙げられます。 注：ポジティブコントロールは、アッセイが正しく実行されており、NTCは、プレート内には汚染がないことを確認し、データ分析の後の蛍光ベースラインを設定する必要があることを確認する必要があります。初めてのユーザーは、希釈されていないと希釈された両方のDNAサンプルを使用することをお勧めします。 </li></ol> 2.液滴の生成およびPCRプレートのセットアップ<ol><li>マルチチャンネルピペットを用いてダウンし、約15回ピペッティングすることによりアッセイ混合物を混ぜます。ピペットチップは、混合物内の余分な泡を避けるために液体内に留まることを確認してください。 </li><li>イン（8ウエルを含む）ERTカートリッジ1白カートリッジホルダへとカートリッジホルダシャットをクリックします。カートリッジ1は、しっかりと所定の位置になりましたし、液滴を発生させながらホルダーから外れることはできません。マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに気泡を導入することなく、「サンプル」とマークカートリッジの中間位置にアッセイ混合物の20μLを移します。 </li><li>ピペットは、カートリッジの左側面に液滴生成油の70μl中（ &#39;・オイル &quot;と記されました）。 </li><li>ガスケットはガスケットがフラットと4によって均等に保持されることを確認することでカバーカートリッジは、カートリッジの縁に向かって刻み。カートリッジを開き、配置する液滴発生器の緑色の点灯ボタンを押します。ジェネレータを閉じるために、再度緑色の点灯ボタンを押します。 注：ドアが閉じると、ボタンが淡色表示され、ドアを再び開くことはできませんし、液滴の生成は、すぐに約1分間継続を開始します。 </li><li> 8つ以上の反応をしている場合は、2番目にカートリッジ2を配置白色カートリッジホルダ液滴発生が全セットアップ時間を節約するために進行中にカートリッジ1と同様に調製。 </li><li>薄暗い点灯ボタンは、液滴の生成が完了したことを示す緑色に点灯したときに液滴発生器のドアを開きます。 、カートリッジ1を含む白色カートリッジホルダを取り外して脇に置き、及び液滴発生器にカートリッジ2を配置します。 </li><li>カートリッジ1からガスケットを取り外し、廃棄します。静かに熱サイクル用（室温に保持）最終PCRプレートにカートリッジ（ &#39;ドロップレット &quot;と記された）の第3列から生成された液滴の総容量（約40μl）を転送します。 注意：新しく生成された液滴を破損する可能性がアクションとして白カートリッジホルダをunclickないでください。液滴が最終プレートに転送された後にのみ、カートリッジホルダを開きます。 </li><li>繰り返して、追加のサンプルについての2.1から2.7を繰り返します。 </li><li>全ての液滴が最終PCRプレートにあるとき、穿孔を配置箔は、プレートの上部にカバーし、プレートシーラーの上に置きます。シーラーで180℃、プレス「プレイ」にシーラーを設定し、10秒間のシールをしましょう​​。 </li></ol> 3.サーマルサイクリングと液滴読書<ol><li>サーマルサイクラーに密封されたプレートを置き、ステップ2.7で使用される最終的なPCRプレート、および2.0℃/秒の温度ランピング速度と互換性1。 </li><li>次のように熱プログラムを実行します：10分保持に続いて94℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で10分間、および60℃で60秒、オプションの98°C（で：最終保持を4でか15゜C）。 </li><li>サイクルの完了時に、各ウェル中の各液滴の蛍光を自動測定する液滴リーダーにプレートを転送します。また、液滴の読み取り前まで4℃で3日間プレートを保存。液滴が読書を進める前に、室温であることを確認します。 <ol><li>セットアップに液滴読みを添付ソフトウェアを開きます。に「サンプル、 &#39;&#39;アッセイ1 &#39;と&#39;アッセイ2」：空の96ウェルプレートの概略を含むデフォルトの「セットアップ」メニューには、二重の3セクションを含むメニューを開くために十分A1をクリックしました</li><li> 「サンプル」セクションで、「名前」を押して入力するか、またはマークされた右側のボックスチェックラベルされたボックスにサンプルIDを入力し、[適用を」。次に、「実験」の標識ドロップダウンメニューをクリックして、「RED」（まれなイベント検出）を選択し、[Enter]をクリックします。 </li><li> 「検定1」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば 、 腸球菌）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル不明1 &#39;を選択し、[Enter]をクリックします。 </li><li> 「検定2」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば HF183）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにメニューANドロップダウンをクリックします「チャンネル2不明」を選択し、[Enter]をクリックしますdが。 3.3.4へのステップ3.3.2からすべての情報は今もA1に存在しています。 </li><li>液滴を含む後続のすべてのウェルに名前を付けます。合計セットアップ時間を節約するために、同時に複数のウェルを選択するには、「Shiftキー」や「Ctrlキーを、]をクリックします。 </li><li>ときプレートのデジタル描写はメニューの右下の物理的なプレートは、を押して「OK」を反映しています。プレートの概略図の上部に表示される新しいメニューで、[テンプレート]セクションの下の[名前を付けて保存」と名前を選択し、プレートを保存します。 </li><li>画面の左側には「ファイル名を指定して実行」をクリックし、ポップアウト」実行オプション」ウィンドウで、適切な色素セットを選択します。データ収集が開始し、ソフトウェアでリアルタイムに表示されます。 </li></ol></li></ol> 4.データ分析とレポーティング<ol><li>リーダーが終了し、ボックスには、「完全なファイル名を指定して実行」を知らせる表示された場合、「OK」をクリックします。 注意：ソフトウェアは、ソフトウェアの「分析」セクションの下に、最終的なデータファイルが表示されます。このビューでは、ソフトウェアは、「2D振幅」のデータプロットに選択したすべてのプレートのウェルとデフォルト値を持っています。 </li><li>正と負の液滴間の分離を確認してください。 NTCウェル内のすべての液滴中の蛍光がベースライン近くにあることを確認してください。 </li><li>ラベルの付いたボタンをクリックして「イベント」。提示されたヒストグラムの右側にある「合計」という名前のボックスとウェルあたりに受け入れ液滴の合計数を表示するには、一番下にある「シングル」という名前のボックスをクリックします。 Ctrlキーを押しながら除外されるだけでなく（複数可）をクリックして、&lt;万液滴7を含む任意のウェルを除外します。 </li><li>両方のターゲットのNTCウェルにおける負の液滴の上に約1標準偏差（500から700蛍光単位）で蛍光しきい値を設定するには、「1D振幅」と表記ボタンをクリックします。画面アンの非常に左に2つの閾値のボタンを示す「自動分析」DER、それを介して実行しているピンク色の固体の水平ラインを持って右側にあるアイコンを選択します。 </li><li>振幅の各グラフの下の「設定されたしきい値」の左にあるボックスをクリックし、適切な蛍光閾値の値を入力します。 μlの反応あたりのコピーで標的濃度は、その後、自動的に計算されます。 注意：しきい値が異なるターゲットのために同一である必要はありません。 </li><li> 1D振幅画面上の左上隅にある[エクスポート]ボタンをクリックして、.csvファイルに結果をエクスポートします。 .csvファイルでは、μlのDNA鋳型あたりのターゲットのコピーにμlの反応ごとターゲットのコピー（ エンテロコッカス属の23S遺伝子。またはHF183マーカー）からそれを変換するために、4によってエクスポートされた目標濃度を掛けます。 </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。マスターミックスは、従来の定量PCRマスターミックスよりも粘性であるため、まず、アッセイ混合物の混合が困難な場合があります。単純なボルテックスは、次に、アッセイ混合物中で、その後、液滴にDNA鋳型の不均一な分布をもたらす不十分な混合をもたらすことができます。プロトコールに記載ミキシング・バイ・ピペット操作技術は、正確なDPCRの定量化を確実にするために従わなければなりません。第二に、液滴が均一な形状及びサイズで生成されることを保証することが重要です。 1つのカートリッジの液滴の生成を完了する液滴発生器にかかる時間が通常よりも短い場合の機会に留意すること。これは、次善の液滴の生成を指示することができます。必要に応じて、各カートリッジの液滴発生時間は、トラブルシューティングのために記録することができます。第三に、せん断することなく、最終的なPCRプレートにカートリッジから生成された液滴の全体の40μLを転送することが重要です液滴および定量化のための十分な液滴を持っていない避けます。以下の技術は、転送のために使用することができる：1）40μlにマルチチャンネルピペットを設定し、45°の角度で「ド...

それらは伝統的な培養ベースの方法に比べてより速く、より柔軟かつ特異的であるため、定量的PCR（定量PCR）法が広く娯楽水質監視及び微生物源追跡用途に使用されてきました。その結果、定量PCRは、 エンテロコッカス属などの一般的な糞便指標の急速な水のモニタリング結果を達成するために推奨されている。改訂USEPAレクリエーション水質基準1で。多くのqPCRアッセイはまた、環境水2に糞便汚染の発生源を特定するために開発および検証されてきました。これらの中でも、HF183マーカーアッセイは、最も頻繁に人間関連糞便汚染3を識別するために使用される一つです。 彼らは定量化のための標準曲線に依存しているためしかし、定量PCRの結果は、多くの場合、バイアスすることができます。定量PCRはスタンから、その定量化サイクル（CQ）を補間することによって、サンプル中の標的の未知の濃度を定量化CQと直列に希釈した標準のセットの対数量との間の線形関係を記述する準の曲線。信頼性と一貫性標準物質の欠如は、したがって、大幅に定量PCRの結果にバイアスをかけることができます。研究は、定量PCRの結果は、異なるベンダー4と同じベンダ5から規格の異なるバッチを使用して、2倍から標準を使用して約半分のログによって異なっていることを示しました。 デジタルPCR（DPCR）技術は、均一なナノリットルまたはピコリットルの反応6の数千または数百万へのバルク定量PCRを分割することによって生成されたミニチュアPCRの大量に陽性の頻度をカウントすることにより、未知試料を定量化します。パーティションは油中水型液滴（ すなわち 、この記事）、またはチップ上の小室であるかどうかは、それぞれ（ すなわち 、この記事）液滴デジタルPCRまたはチャンバデジタルPCR、と呼ばれています。より高い試料濃度は、標的DNAの存在をもたらしますパーティションの高い割合で（したがって、正PCR）、ポアソン分布で近似関係。このように、バイナリ結果（正または負PCR）が記録され、正の液滴の周波数は、定量PCRのような標準曲線のための必要性を排除し、直接ポアソン近似を介して未知試料の濃度を計算するために使用されます。 デジタルPCR定量のこのバイナリ性質は定量PCR 7の上に付加的な利点を提供します。遅延増幅がまだ正のPCRを得ることができるので、DPCR定量は、増幅効率を低下させる阻害に対してよりロバストです。定量PCR 8-10と比較して、DPCRの高精度化につながる、定量PCRである同様に、DPCRの定量化は、Cqの値の変動による影響を受けません。 また、分割処理を効果的amplificatio中（基質競合を最小化する、各小滴中の標的DNAの存在の非常に少量を保証します定量PCR（ すなわちアッセイは、同時に2つのDNA標的を測定）の二重化を実現するための共通の障害となっている別のDNA標的）のn個。このように、二重またはシンプレックスで実行が（ つまり、一つのターゲットは、単一のアッセイで測定された）かどうかDPCRは、両方のターゲット7,11のほとんど区別できなく定量化を生成します。 この記事で説明したデジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）の目標は、一般的な糞便指標腸球菌属の同時直接定量を得ることである。そして改善された精度、再現性および阻害に対するロバスト性を有するヒト、糞便関連HF183マーカーは、その定量PCRと比較します対応。このアッセイは、正常な環境淡水、海水、および種々の糞便物質7の糞便汚染を定量するために使用されているだけでなく、水と廃水の任意の他のタイプに適用することができます。このアッセイは、原因それに堆積物や土壌を分析するための非常に有望ですsの阻害に対する高い耐性が、は更なる試験があるため、サンプルのこれらのタイプの中の阻害剤混合物の複雑さが要求されます。

<table><tbody><tr><td>低結合マイクロチューブ</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>試薬の保管用、サンプル/マスターミックスの生産</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8 バッファー</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>ハードシェル 96 ウェルプレート</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>初期マスターミックスおよびサンプル接種用</td></tr><tr><td>アルミニウムシーリングフィルム</td><td>BioRad</td><td>359-0133</td><td>サンプルプレートをシールするには</td></tr><tr><td>液滴発生器</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>液滴生成オイル</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>カートリッジ</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 カートリッジホルダー</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>ガスケット</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GP-L10F</td><td>タンスフェリング用/マスターミックスからカートリッジ</td></tr><tr><td>まで 200 &#956;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GP-L200F</td><td>液滴を最終液滴に移すため Twin.Tec プレート</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 ウェルプレート</td><td>エッペンドルフ</td><td>951020320</td><td>最終液滴のサーマルサイクリングと読み取り用</td></tr><tr><td>ピアス可能なヒートシール ホイル</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>サーマルサイクリングの前にTwin.Tecプレートをシールするには</td></tr><tr><td>PX1 PCR プレートシーラー</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>CFX96 および C1000</td><td>サーマルサイクラーのみが必要で、光学系は必要ありません</td></tr><tr><td>QX100 ドロップレットリーダー</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>ドロップレットリーダー オイル</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>ドロップレット PCR スーパーミックス&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>つまり原稿のデジタルPCRミックス</td></tr><tr><td>QuantaSoftソフトウェア（v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>ddPCRデータの表示、分析、エクスポート</td></tr><tr><td>エンテロフォワードプライマー(Ent F1A)</td><td>オペロン</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>代替ベンダーが使用可能</td></tr><tr><td>エンテロリバースプライマー(Ent R1)</td><td>オペロン</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>代替ベンダーが使用可能</td></tr><tr><td>エンテロプローブ(GPL813TQ)</td><td>オペロン</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAAタグCTTタグGGC TA-[BHQ1]</td><td>代替ベンダーを使用できますが、蛍光体はFAM</td></tr><tr><td>HF183フォワードプライマー(HF183-1)</td><td>オペロン</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>代替ベンダーが使用可能</td></tr><tr><td>HF183 リバースプライマー (BthetR1)</td><td>オペロン</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGTGT</td><td>代替ベンダーが使用可能</td></tr><tr><td>HF183 プローブ (BthetP1)</td><td>オペロン[</td><td>6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>代替ベンダーが使用可能ですが、蛍光体は HEX である必要があります (VIC を使用する場合は、適切なマトリック補正を選択する必要があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>ポジティブコントロール</td><td></td><td></td><td>E. faecalisゲノムDNAとHF183標準プラスミド(IDTから注文)の混合物。E. faecalisの培養方法や、HF183プラスミドの配列の詳細な方法については、Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)をご覧ください。市販のEnterococcusDNA標準(ATCC 29212Q-FZ)は、ラボで調製されたE. faecalisゲノムDNAの代わりにポジティブコントロールにも使用できます。</td></tr></tbody></table>

の同時定量のための二重デジタルpcrアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびwatersにおけるヒトの糞便関連hf183マーカー

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

この原稿は、 エンテロコッカス属の同時定量。と人間の糞便関連HF183のマーカーのための二重デジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）について説明します。 EntHF183二重DPCR（ここに至ってEntHF183 DPCRと呼ぶ）アッセイは、その公開された個々の定量的PCR（定量PCR）カウンターパートと同じプライマーおよびプローブ配列を使用しています。同様に、前のqPCRに実行されるように、同じ水のろ過とDNA抽出手順はDPCRを実行する前に続いています。しかし、二重DPCRアッセイは定量PCRアッセイを上回るいくつかの利点を有します。最も重要なことは、DPCRアッセイは、そのターゲットの直接定量することにより、それ故に関連するバイアスとばらつきを標準曲線を実行しているとする必要がなくなります。定量PCR（ すなわち同時定量） エンテロコッカスとHF183を二重化しながら加えて、多くの場合、試料中にあまり豊富で、ターゲットの深刻な過小評価につながる、DPCRは、両方のターゲットの一貫性の定量化を提供し、研ぎます彼女は同じ反応で個別にまたは同時に定量しました。 DPCRアッセイはまた、qPCRにより許容されるものよりも1〜2桁であるPCRの阻害剤濃度を許容することができます。それは、同時に2つの別々のqPCRアッセイを実行するために必要とせずに、一般的および環境水における人間関連糞便汚染の両方で、正確で再現性の情報を提供するため、これらの利点は、EntHF183 DPCRアッセイは特に魅力的です。定量PCRを超えるその利点にもかかわらず、現在利用可能な機器とDPCRアッセイの上部定量限界は、定量PCRによって達成可能なものよりも大きさの約4桁低いです。このため、希釈は、通常、汚水の流出後に観察されるような標的生物の高濃度の測定のために必要とされます。

良いEntHF183二重DPCRランが受け入れ滴（ 約 10,000-17,000）と負と正の液滴7用の蛍光値との間に比較的大きな差（ 約 5000）の比較的多数をもたらすべきです。液滴の異常に低い数は、可能性が高い液滴生成過程での問題を示しており、万液滴のカットオフは、この記事で使用した液滴DPCRシステムからの経験的データに基づいて提案されています。正と負の液滴間の弱い分離（ すなわち小さい蛍光の差）が抑制または分解プローブ7を示すことができます。 全体的に、定量PCRが規格に関連するバイアスを補正した場合EntHF183二重DPCRアッセイは、シンプレックスのqPCRからのものに非常に匹敵する結果を生じ、全く阻害7はありません。 EntHF183二重DPCRアッセイおよびCORからの結果応答シンプレックスDPCRアッセイは、次の...

この原稿は、同時に腸球菌属を定量することができる二重デジタルPCRアッセイ。レクリエーション水域における一般的な人間と関連糞便汚染の指標としてHF183遺伝子マーカーを説明しています。

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

このデュプレックス・デジタルPCRアッセイの全体的な目的は、水中の全般的なおよびヒト由来の糞便汚染を同時に定量化することです。本アッセイは、レクリエーション用水の水質モニタリングにおける重要な課題、すなわち、全般的な糞便指標菌であるEnterococcusおよび、より重要なヒト糞便関連のHF183マーカーが水中にどの程度存在しているかという問いへの回答に役立ちます。このアッセイの主な利点は、1回の反応で2つの標的を定量できることであり、qPCRと比較して標準曲線をに描く必要がなく、それに伴うバイアスやばらつきを排除できる点にあります。本手順の実演は、シニアリサーチテクニシャンのMeredith Raithが行います。この手順を開始するには、まずプロトコルの本文に記載されている通り、すべてのプライマーをMolecular Grade Waterで、プローブをTEPH 8 Bufferで、100 µMのストック濃度で調製してください。次に、Digital PCR mix、フォワードおよびリバースプライマー、蛍光プローブ、およびNuclease-Free Waterを適切な量で混合し、マスターミックスを調製します。溶液中に気泡が混入しないよう注意しながら、ピペッティングを少なくとも10回行い、混合します。dPCRマスターミックスは従来のqPCRマスターミックスよりも粘性が高いため、均一な溶液を作成するにはピペッティングによる混合技術を用いる必要があります。これにより、下流工程での正確なdPCR定量が可能になります。サンプルをデュプリケート（2連）で測定するための液滴生成用アッセイ混合液を調製するには、36 µLのマスターミックスを通常のPCRプレートに分注します。それぞれの36 µLのマスターミックスに、12 µLのDNAテンプレートを混合し、プレート上の対応するレプリケートウェルは空けておきます。アッセイが適切に機能していることを確認するため、ポジティブコントロールを含めてください。プレート内にコンタミネーションがないことを確認し、後のデータ解析で蛍光ベースラインを設定するために、テンプレートなしコントロール（NTC）を含めてください。ドロップレットジェネレーターをセットアップする前に、マルチチャンネルピペットを使用してアッセイ混合液を約15回ピぺッティングし、混合してください。混合物の中に気泡が生じないよう、ピペットチップが常に液中に浸かっていることを確認してください。次に、8つのウェルを含むカートリッジ1を白いカートリッジホルダーに挿入し、ホルダーをカチッと閉じて固定します。これによりカートリッジ1がしっかりと固定され、液滴生成中にホルダーから外れることはありません。マルチチャンネルピペットを使用して、気泡が入らないように注意しながら、Assay Mixture 20 µLをカートリッジの「sample」と記された中央位置に静かに分注します。次に、カートリッジの左側にある「oil」と記された位置に、Droplet Generation oil 70 µLをピペッティングします。ガスケットでカートリッジを覆い、ガスケットが平らに置かれ、カートリッジ縁にある4つの目印によって均等に固定されていることを確認します。Droplet Generatorの緑色に点灯しているボタンを押し、ドアを開けてカートリッジをセットします。再度ボタンを押してジェネレーターを閉じます。ドアが閉じると緑色のボタンが消灯し、ドアを再度開けることはできなくなります。液滴生成が直ちに開始され、約1分間継続します。液滴生成が行われている間に、2つ目のカートリッジを2つ目の白いカートリッジホルダーにセットし、1つ目のカートリッジと同様の手順で準備してください。液滴生成が完了すると、暗くなっていたボタンが緑色に点灯します。Droplet Generatorのドアを開け、カートリッジ1が入った白いカートリッジホルダーを取り出して脇に置きます。カートリッジ2をDroplet Generatorにセットします。カートリッジ1からガスケットを取り外し、廃棄します。新しく生成された液滴が破壊される可能性があるため、白いカートリッジホルダーを外さないでください。40 µLに設定したマルチチャンネルピペットを使用し、カートリッジの「droplets」と表示された3列目にチップを45度の角度で挿入し、すべての液滴をゆっくりと吸引します。ピペットチップをPCRプレートのウェルの壁のほぼ中ほどに当て、液滴をゆっくりと排出することで、最終的なPCRプレートに転送します。同様に、カートリッジ2の液滴生成が完了したら、カートリッジ2からガスケットを取り外し、生成された液滴を最終PCRプレートに転送します。プレートの上にピアサブルフォイルカバーを載せ、プレートシーラーにセットします。シーラーを180 °Cに設定し、シーラーの再生ボタンを押し、10秒間シールします。この手順を開始するために、密封した最終PCRプレートをサーモサイクラーにセットします。最終PCRプレートに対応し、昇温・降温速度が秒間2 °Cのサーモサイクラーを使用してください。以下のサーマルプログラムを実行します：95 °Cで10分間、続いて94 °Cで30秒間および60 °Cで60秒間のサイクルを40回繰り返し、最後に98 °Cで10分間保持します。サイクル完了後、プレートをDroplet Readerに移し、各ウェルの各ドロップレット内の蛍光を自動的に測定します。Droplet Readingを開始する前に、ドロップレットが室温であることを確認してください。まず、付属のソフトウェアを開き、Droplet Readingの設定を行います。空の96ウェルプレートの概略図が表示されているデフォルトのセットアップメニューで、ウェルA1をダブルクリックして、「Sample」、「Assay 1」、「Assay 2」の3つのセクションを含むメニューを開きます。「Sample」セクションの「Name」とラベル付けされたボックスにサンプルIDを入力し、右側にある「Apply」チェックボックスをオンにします。次に、「experiment」とラベル付けされたドロップダウンメニューをクリックし、「RED」（Rare Event Detection）を選択して「Enter」をクリックします。Assay 1と表示されているセクションに移動します。「Name」セクションの「Assay」欄を入力し、Enterキーを押します。その下の「Type」とラベル付けされたボックスのドロップダウンメニューをクリックし、「Channel 1 Unknown」を選択してEnterキーを押します。Assay 2と表記されたセクションに移動します。「Name」セクションにアッセイ名を入力し、Enterキーを押します。その下の「Type」と表示されたボックスでドロップダウンメニューをクリックし、「Channel 2 Unknown」を選択してEnterキーを押します。これまでのステップのすべての情報がウェルA1に集約されました。液滴が含まれる以降のすべてのウェルに名前を付けます。セットアップ時間を短縮するには、ShiftキーまたはCtrlキーを使用して複数のウェルを同時に選択してください。プレートのデジタル表示が実際のプレートと一致したら、メニュー右下のOKを押してください。プレートの概略図の上部に表示される新しいメニューの「Template」から「Save As」を選択し、プレートに名前を付けて保存します。画面左側の「Run」をクリックし、ポップアップ表示される「Run Options」ウィンドウで適切な「Dye Set」を選択してください。データ収集が開始され、ソフトウェア上にリアルタイムで表示されます。リーダーの読み取りが完了し、「Run Complete」というボックスが表示されたら、OKをクリックします。陽性ドロップレットと陰性ドロップレットの分離状態を確認してください。NTCウェルのすべてのドロップレットにおける蛍光値がベースライン付近にあることを確認します。「Events」と表示されたボタンをクリックしてください。下部にある「Single」という名称のボックスをクリックし、表示されたヒストグラムの右側にある「Total」という名称のボックスをクリックして、ウェルあたりの受理済み液滴の総数を表示します。コントロールキーを押しながら除外したいウェルをクリックし、液滴数が 10,000 個未満のウェルを除外します。「1D Amplitude」と表示されたボタンをクリックし、両方のターゲットについて、NTCウェルの陰性液滴の標準偏差の約1倍に蛍光しきい値を設定します。画面の左端にある「Auto Analyze」の下に2つのしきい値ボタンが表示されています。そのうち、右側にあるピンク色の実線が入ったアイコンを選択してください。各振幅グラフ（Amplitude Graphs）の下にある「Set Threshold」の左側のボックスをクリックし、適切な蛍光しきい値を入力します。これにより、1反応あたりマイクロリットルあたりのコピー数としての標的濃度が自動的に算出されます。1D Amplitude画面の左上隅にあるExportボタンをクリックし、結果をCSVファイルにエクスポートします。CSVファイルにおいて、エクスポートされたターゲット濃度を4倍し、1µL反応あたりのターゲットコピー数から、1µL DNAテンプレートあたりのターゲットコピー数に変換します。この図は、Digital PCRアッセイのデュプレックス形式とシンプレックス形式を比較したものです。左パネルと右パネルは、それぞれEnterococcusおよびHF183の定量結果を示しており、デュプレックス法とシンプレックス法の結果間の相関係数が記載されています。実線は回帰直線を示し、灰色の網掛け部分は対応する標準誤差を示しています。サンプルの種類は記号によって区別されています。EnterococcusとHF183を1つの反応で同時に測定した場合と、2つの反応で別々に測定した場合の結果は非常に一致しており、多くの場合区別がつきません。また、デジタルPCRアッセイは、qPCRに比べて1桁から2桁高い濃度の阻害剤が存在しても許容されます。この図は、PCRを阻害するフミン酸の濃度を増加させて添加した浄化槽汚泥DNAにおける、HF183マーカーのqPCRおよびデジタルPCRによる定量結果を示しています。阻害剤が存在しない場合のHF183定量期待値は、2本の水平点線で囲まれた95%信頼区間として定義されます。三角形で示されるデジタルPCRは、腐植酸濃度が1反応あたり15 ng/µLに達するまで正確な定量を提供し続けますが、十字で示されるqPCRは1 ng/µLで過小評価し始め、5 ng/µLで完全に阻害されます。このビデオを視聴することで、この腸内HF183デュプレックスドロップレットデジタルPCRアッセイ、または異なるプライマーとプローブを用いた同様のアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。2015年にWater Research誌で発表されたこのデュプレックスアッセイの開発以来、我々は一般的な糞便指標細菌、微生物追跡マーカー、および水系病原体を標的とした多くのデジタルPCRアッセイを開発し、検証してきました。これらのアッセイは、標的の直接的かつバイアスのない定量化を可能にし、水質検査分野においてqPCRアッセイに代わる有用な選択肢となりつつあります。

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環境

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

このプロトコルは、水性の検出のための代替手順として、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過試料濃度システムの使用と熱解離について説明します。...

水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623<em&gt;クリプトスポリジウム</em&gt;と<em&gt;ジアルジア属。</em

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。...

デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

大量の農業用水に含まれる食品媒介病原体の統合濃度、濃縮、エンドポイント比色検出を含むプロトコルがここに提示されています。...

比色検出の紙ベース<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;<em&gt;サルモネラ</em&gt;属、および<em&gt;リステリア菌</em&gt;農業大量の水から

ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30%...

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

環境DNAアッセイでは、現場データの収集を開始する前に、厳格な設計、テスト、最適化、検証が必要です。ここでは、環境試料から標的種DNAの検出と定量を行うための、種特異的なプローブベースのqPCRアッセイを設計する各ステップを通じてユーザーを取るプロトコルを提示する。...

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。...

連続フローPCRマイクロ流体チップにおける大 腸菌 の増幅とキャピラリー電気泳動システムによる検出

学ぶ二重デジタルPCRアッセイでEnterococcus属とHF183マーカーを同時定量し、レクリエーション用水の糞便汚染を正確に評価する方法。この技術は標準曲線不要でバイアスを低減し、水質モニタリングの効率を向上させます。

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ

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