オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

こんにちは、Agriculture and AgriFood CanadaのTim Dusoです。このビデオでは、バイオプレックス装置を使用して、複雑な臨床サンプルまたは環境サンプル中の特定の微生物の存在と存在量を決定するためのプロトコルを示します。このプロトコールでは、種特異的なオリゴヌクレオチドプローブに化学的に結合した蛍光ポリスチレンビーズを使用します。

ユニバーサルPCRプライマーを使用してサンプルからアンプリコンを生成し、アンプリコンをプローブ結合ビーズにハイブリダイズします。バイオプレックス装置では、2つの信号が生成されます。1つはビーズを同定し、もう1つはハイブリダイゼーションシグナルを定量化します。

この手順の全体的な目標は、関心のある微生物叢のプロファイルを迅速かつ半定量的な方法で決定することです。この手法を適用して膣スワブの細菌プロファイルを決定し、生成されたデータを使用して細菌性膣炎を診断しました。これは、乳酸菌の蔓延が少なくなり、ガードネレラ、ヴァイス、アポイアンバエなどの他の生物が膣スワブで検出可能になる微生物叢の変化を特徴とする臨床状態です。ただし、この手法は、迅速なマルチプレックスアッセイが望ましい他の微生物叢にも適用できることに留意することが重要です。

まず、手順のしくみを説明しましょう。微生物プロファイルは、タンパク質を増幅し、綿棒のDNA抽出物に存在するすべての生物から60の遺伝子シャペロンをコーティングすることによって生成されます。ユニバーサル増幅プライマーの1つは、ビオチンの添加、およびリン酸塩修飾塩基の包含によって修飾されます。

5プライムエンドでは、アンプリコンはTセブンエクソンヌクレアーゼを使用して一本鎖化され、アンチセンス鎖のみを分解します。センス鎖はリン酸化修飾PCRプライマーによって保護されているため、残りの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは蛍光ポリスチレンビーズに共有結合しています。それぞれ異なる生物を検出するプローブを含む独自のビーズ色により、1つのサンプルに最大100の異なるビーズを使用することができます。

膣スワブからの一本鎖PCR産物は、目的のすべての生物のプローブを含むプローブ結合ビーズ混合物にハイブリダイズされます。蛍光レポーターFICOエチンを添加し、連鎖球菌Dinコンジュゲートを介してビオチン化プローブに結合します。最後に、ハイブリダイゼーション混合物をルミネックスまたはバイオプレックス装置で分析し、各ビーズの同一性とハイブリダイゼーションシグナルを個別に調べます。

この解析の結果は、特定の微生物の存在を示しており、ハイブリダイゼーションシグナルの強度はその生物の存在量と相関しています。サンプルでは、BV関連生物の存在を使用してbvを診断できます。グランドステインのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、特定の微生物の存在とその存在量に関する情報が生成されることです。

手順を実演するのは、研究助手のジェニファー・タウンです 私たちの研究室では、約20秒間ボルテックスすることにより、Reはマイクロスフェアを一時停止します。400マイクロリットルのマイクロスフィアを14, 000倍Gで1分間アイノアチューブ遠心分離機に移し、スナットResusを取り外して廃棄します。0.1モルMES pH 4.5の50マイクロリットルでマイクロスフェアを懸濁します。

キャプチャオリゴのアニモを1つマイクロスフェアに加え、ボルテックスで混合します。2.5マイクロリットルの新鮮なEDC溶液をマイクロスフェアに加えます。反応を室温で30分間暗所でインキュベー

以前に調製したEDC溶液を廃棄し、水中で1ミリグラム/ミリリットルのEDCの新しいサンプルを準備します。上記のように、さらに2.5マイクロリットルの新鮮なEDC溶液をマイクロスフィアに加え、5秒間ボルテックスします。再び室温で30分間、暗所でインキュベートします。

0.02%Tween 20ボルテックスの1ミリリットルを追加してビーズを洗浄し、ビーズの遠心分離機を14、000回G.For 1分間で再懸濁し、上澄み液を除去して廃棄します。0.1%SDS Resusを1ミリリットル加えて、ビーズを再度洗浄します。ビーズを100マイクロリットルのteバッファーに懸濁します。

ヘモサイトメーターでビーズを列挙して、ストック濃度を決定します。各ビーズを最終濃度100ビーズ/マイクロリットルに希釈することにより、マイクロスフィアマスターミックスを調製し、アッセイの所望のプレックスに従って結合ビーズをバッファープールし、マイクロスフィアマスターミックスを暗所で4度で保存する。この混合物は、これらの条件下で保持すると数ヶ月間保存でき、サンプルごとにPCR産物を生成します。

PCRが完了した直後に、ホスホレートとビオチン修飾の5つのプライムプライマーセットを含めます。各PCRチューブに2マイクロリットルのTセブンエキソヌクレアーゼを加え、室温で40分間インキュベートします。このインキュベーションの終わりに、12.5マイクロリットルの0.5モルE-D-T-A-P-H 8.0を混ぜて加えます。

これにより、合計で約64.5マイクロリットルの一本鎖PCR産物が得られます。Resus Bend Microsphereマスターミックスとピペット。アイナーチューブに適量を分注します。

チューブにキャップをし、水浴ソニカで2分間超音波処理します。17マイクロリットルの一本鎖PCR産物をロープロファイル96の適切なウェルに分注します。ウェルプレートは、それぞれに33マイクロリットルの再懸濁超音波処理ビーズ混合物を追加します。

プレートをシリコンカバーでしっかりと覆い、タップします。プレートをサーモサイクラーにそっと入れ、95度で5分間、60度で10分間、60度保持または一時停止します。終了し、プログラムを開始します。

新鮮な連鎖球菌Aden FICO Ethin溶液を作ります。井戸あたり25マイクロリットルが必要です。ストレップとFICOエチンは、茎を1ミリグラム/ミリリットルに希釈して作ります。

リットルあたり50〜20マイクログラムに1回、tmacバッファーの1倍。サーモサイクラーが60度のホールドステップに達したら、蓋を開け、シリコンカバーを取り外し、それぞれに直接連鎖球菌ディンFICOエチン溶液を追加します。シリコンカバーをしっかりと交換し、サーモサイクラーの蓋を閉めて、プログラムを再開します。

プログラムが完了したら、プレートを取り出し、すぐにバイオプレックスマシンに移して読み取ります。プレートは10分以内に読み取る必要があります。プレートを60度で読み取ります。

バイオプレックスがこの温度に予熱されていることを確認してください。これは、時間ゼロにおける単一の個体からの縦方向サンプルの対応するグラム染色とルミネックスプロファイルの結果を示しています。グラム染色はbvの臨床診断と一致しており、これは、ガードナーレリック、vais、Apoian VaeなどのBV関連生物の陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示すFiveplex Luminexアッセイによって裏付けられています。

ラクトバチルス・イナースも、時間が経つにつれて低レベルで検出されます。この個体は、グラム染色で示されるように、BV微生物叢から正常な微生物叢に移行します。これらの同じサンプルのLuminex分析は、Gardnerella Vaginalisの存在量がピークと減少する一方で、ラクトバチルスinersは増加して最終的な時点までに主要な生物になることを示しています。

この方法を使用して微生物叢をプロファイリングすると、特定の生物の存在とその存在量に関する情報が生成されます。この方法はシーケンスベースであるため、プローブの設計はディープシーケンシング分析によって通知され、次世代のシーケンシング法によって同定された微生物は、サンプル内で迅速かつ比較的低コストで追跡できます。このビデオをご覧いただければ、LuminexまたはBio Plex装置を使用してサンプルから微生物プロファイルを生成する方法について十分に理解できたはずです。

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