Name: オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶオリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを用いた細菌の多重検出法。Bio-Plex機器を使用し、臨床・環境試料中の微生物の存在と豊度を迅速かつ半定量的にプロファイリングする手法です。

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我々は、アッセイの開発とこの原稿について批判的なコメントのヘルプはアルベルトセヴェリーニとヴァネッサGoleskiに感謝。この作品は、カナダの公衆衛生局と産業研究支援プログラム（カナダ国立研究評議会）によって賄われていた。追加のサポートは、サスカチュワン州の出版基金の大学から得た。

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<li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li>
<li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li>
<li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480%3A+Application+in+viral+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li>
<li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PCR.+Methods.+Appl%22%5BJournal%5D)">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li>
<li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cpnDB%3A+A+Chaperonin+Sequence+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li>
<li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li>
<li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

信号発生の特異性は非常に重要であり、あなたが本当に観測される信号は、その生物から生成されたアンプリコンの検出を反映していることを確信している必要があります。このようなPrimerPlex（プレミアBiosoft）などのソフトウェアは、効率的にハイブリダイズするプローブを設計するために役立ちますが、非対象種にクロスハイブリダイズしない場合があります。このプロトコルで説明されているようにユニバーサルPCRプライマーが使用されている場合、それは生成されたアンプリコンがサンプル中に存在する生物のすべてを表すことを覚えておくことが重要です。それはcpnDB、cpn60 UTシーケンス16のデータベースにプローブ設計ソフトウェアによって提案された配列を比較することにより、クロスハイブリダイゼーションの可能性のための潜在的なプローブを分析することが重要であり、複数の生物に一致するプローブは、可能であれば避けるべきです。 。さらに、潜在的に特異的なプローブが特定された時、我々は検証をプローブするアプローチを採用しているこれで複雑な、人工的なTEmplateが関心13の細菌に関連付けられている...

<table border="1"><tbody><tr><td> オリゴヌクレオチド名 </td><td> 会社 </td><td> シーケンス1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen社、IDT、または他の</td><td> ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O、ホスホロチオエート- C、E、ホスホロチオエート- G、F、ホスホロチオエート- A、I、イノシン、Y、CまたはT、R、またはG、K、TまたはG、S、CまたはG </td></tr></tbody></table>ユニバーサルcpn60 PCRのための修飾オリゴヌクレオチドの表1。シーケンス。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1 - エチル-3 - （3 - dimethylamiopropyl）カルボジイミド塩酸（EDC） </td><td>ピアース</td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光ポリスチレンビーズ：MicroPlexミクロスフェア（ルミネックス）、またはバイオプレックスCOOHビーズ（Bio - Rad社） </td><td>ルミネックスまたはBio - Rad社</td><td> Bio - Rad社：xxxはビーズ識別子に対応する171 - 506xxx </td><td>磁気ビーズは、オリゴヌクレオチド結合のために利用可能になりつつあると特定の利点を提供することがあります。これらの著者が試行されていません。 </td></tr><tr><td>キャプチャーオリゴヌクレオチド（5&#39;アミノC12改） </td><td> Invitrogen社、IDT、または他の</td><td>様々な</td><td>脱塩の純度レベルは許容範囲です。膣スワブを特徴付けるために使用される捕獲プローブの配列は、このプロトコルは13基となる原稿に記載されています。 </td></tr><tr><td> T7エクソヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン- R -フィコエリスリン（SA - PE） </td><td>インビトロジェン</td><td> S - 866 </td><td>高純度SA - PEを取得するために注意が必要なのは、このカタログの数は推奨されます</td></tr><tr><td>サーモウェル、96ウェルPCRプレート</td><td>フィッシャー</td><td> CS006509 </td><td> 96ウェルサーモサイクラーとBioPlexマシンの両方に適合</td></tr><tr><td>サーモシールマット</td><td>フィッシャー</td><td> CS006555 </td><td>再使用することができます。石けん水で洗浄は、よくすすぎ、および乾燥</td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td>シグマ</td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td>バイオプレックスまたはルミネックス楽器</td><td> Bio - Rad社またはルミネックス</td><td> Bio - Rad社：171-000201 </td><td></td></tr><tr><td>プローブ設計のためのPrimerPlexソフトウェア</td><td>プレミアBiosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td>ルミネックスプローブドのために提案他のソフトウェアプラットフォームを使用することができますが、署名</td></tr></tbody></table> 表2。特異的な試薬と装置。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントは </td><td> μL/アッセイ </td><td> μl/100アッセイ </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 10 × PCR緩衝液（Invitrogen） </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 50mMのMgCl 2の （Invitrogen社） </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2.5mMの</td></tr><tr><td>の10mMのdNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0.2mMの各</td></tr><tr><td> H279BP、25μM </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nMの</td></tr><tr><td> H1612BP、25μM </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nMの</td></tr><tr><td> H280、25μM </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nMの</td></tr><tr><td> H1613、25μM </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nMの</td></tr><tr><td>水</td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td>合計</td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。改良cpn60 UTプライマー（表1）を持つPCR用混合物を推奨。アッセイは、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン社）0.5μlの（2.5U）を5μl用に設定されています。通常、大容量を準備（100アッセイ用などに十分な）と-20℃で保存されています

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

細菌性膣炎（BV）はガルドネレラの膣、Atopobium鞘を含む細菌種の数、支配細菌に乳酸菌 -支配、および他の1〜3の&quot;通常の&quot;微生物の変化によって特徴付けられる、定期的な複数菌症 ​​候群です。この条件は、HIV買収4を含む負の健康アウトカム、の範囲に関連付けられており、それが臨床的に5管理が困難になる可能性があります。また、BVの診断は、様々な数値基準6,7に得点されている膣スワブのスメアのグラム染色の使用に依存してきました。この診断は、シンプルで安価な、とよく資源が限られた設定に適していることが、それは主観的な解釈に関連する問題に苦しむことができますし、それが膣細菌8の組成の詳細なプロファイルを与えるものではありません。最近のディープシーケンシングの取り組みが持つ豊かな、多様な膣細菌叢を明らかにしたBV 11,12の分子診断のための潜在的なターゲットの数の同定の結果になっています9,10、通常考えられているそれらの個人、と比較してBVと診断された患者から採取したサンプルの間に明確な違い。これらの研究は、有用な情報を豊富に提供していますが、深いシーケンシングは、まだ臨床の現場での診断法として実用的ではない。我々は最近、急速にルミネックスプラットフォーム13上の検出とオリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いたマルチプレックス形式で膣細菌叢をプロファイリングするための方法を記載している。このメソッドは、現在のグラム染色ベースのメ​​ソッドと同様に、迅速かつ簡単ですが、プローブの設計の研究をシーケンシングに起因する分子の知識を悪用するというさらなる利点を追加します。このメソッドは、したがって、高い特異性と感度のカンプでBVを診断するために使用することができます膣スワブに存在する主要な微生物をプロファイルする方法を提供します半定量的かつ迅速な方法で、種の存在感と豊富で追加情報を提供しながら、グラム染色にared。この多重方式では、よく現在のところ、単一の試料14の5または6つの異なるアッセイに限定されている特定の生物の、現在の定量PCRアッセイの範囲を超えて拡張可能です。重要なのは、メソッドが膣スワブの細菌の検出に限定されるものではなく、容易に迅速に関心のほぼすべての微生物群集をプロファイルに適合させることができます。例えば、我々は最近、廃水処理プラントで使用する診断ツールの開発にこの手法を適用し始めている。

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。

細菌性膣症（BV）は、乳酸桿菌（Lactobacillus）主体の「正常な」微生物叢の変化を特徴とする、再発性の多微生物症候群である。

こんにちは、カナダ農業・農産食品省のTim Dusoです。このビデオでは、Bio-Plex装置を用いて、複雑な臨床検体または環境試料中に存在する特定の微生物の有無および量を決定するためのプロトコルを実演します。このプロトコルでは、種特異的なオリゴヌクレオチドプローブが化学的に結合した蛍光ポリスチレンビーズを使用します。ユニバーサルPCRプライマーを用いてサンプルからアンプリコンを生成し、そのアンプリコンをプローブ結合ビーズにハイブリダイズさせます。Bio-Plex装置により2つの信号が生成されます。1つはビーズを識別するための信号であり、もう1つはハイブリダイゼーション信号を定量するための信号です。本手順の全体的な目的は、目的の微生物叢のプロファイルを迅速かつ半定量的に決定することです。我々はこの手法を膣 swabsにおける細菌プロファイルの決定に適用し、得られたデータを細菌性膣症の診断に利用しています。細菌性膣症とは、Lactobacillus属の菌が減少し、Gardnerella、vais、およびapoian vaeなどの他の微生物が膣 swabsで検出可能になるという、微生物叢の変化を特徴とする臨床状態です。ただし、この手法は迅速なマルチプレックスアッセイが望まれる他のあらゆる微生物叢にも適用可能である点に留意することが重要です。まず、本手順の仕組みについて説明します。スワブから抽出したDNAに含まれるすべての生物から、タンパク質および遺伝子シャペロンコーティング遺伝子を増幅させることにより、微生物プロファイルを生成します。ユニバーサル増幅プライマーの1つには、ビオチンの添加およびリン酸化修飾塩基の導入という改変が加えられています。5'末端において、T7 exonucleaseを用いてアンプリコンを単鎖にします。このヌクレアーゼはアンチセンス鎖のみを分解します。センス鎖はリン酸化修飾されたPCRプライマーによって保護されているため、残った鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを蛍光ポリスチレンビーズに共有結合させます。各ビーズの色ごとに異なる生物を検出するプローブが含まれているため、1つのサンプルに対して最大100種類の異なるビーズを使用することが可能です。膣スワブから得られた単鎖PCR産物を、目的とするすべての微生物に対するプローブを含むプローブ結合ビーズ混合液でハイブリダイズさせます。次に、ストレプトアビジン複合体を介してビオチン化プローブに結合する蛍光レポーターであるフィコエリスリンを添加します。最後に、このハイブリダイゼーション混合液をLuminexまたはBio-Plex装置で解析し、各ビーズの個別の同定およびハイブリダイゼーションシグナルを検出します。この分析結果は、特定の微生物の存在を示しており、ハイブリダイゼーションシグナルの強度はその微生物の存在量と相関しています。サンプルにおいて、BV関連微生物の存在はbvの診断に利用できます。グラム染色のような既存の手法に対するこの手法の主な利点は、特定の微生物の存在とその存在量に関する情報が得られることです。当研究室のリサーチアシスタントであるJennifer Townが手順を実演します。マイクロスフィアを約20秒間ボルテックスして再懸濁させます。マイクロスフィアを400 µL取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、14,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去して廃棄してください。その後、マイクロスフィアを50 µLの0.1 M MES (pH 4.5) で再懸濁させます。キャプチャーオリゴを1 nmol分マイクロスフィアに加え、ボルテックスで混合します。新鮮なEDC溶液を2.5 µL、マイクロスフィアに加えます。反応液を室温、暗所にて30分間インキュベートします。先に調製したEDC溶液を廃棄し、10 mg/mLのEDC水溶液を新たに調製します。上記と同様に、新鮮なEDC溶液をさらに2.5 µLマイクロスフィアに加え、5秒間ボルテックスします。再度、室温・暗所にて30分間インキュベートします。1 mLの0.02% Tween 20を加え、ボルテックスでビーズを再懸濁させて洗浄し、14,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、廃棄してください。さらに1 mLの0.1% SDSを加えてビーズを再度洗浄します。最後に、100 µLのTEバッファーでビーズを懸濁させます。ヘモサイトメーターを用いてビーズを計数し、ストック濃度を決定します。各ビーズをTEバッファーで希釈し、最終濃度が1 µLあたり100ビーズとなるようにマイクロスフィアマスターミックスを調製します。アッセイの目的のプレックス数に応じて、カップリング済みビーズを混合します。マイクロスフィアマスターミックスは、4°Cの遮光条件下で保存してください。これらの条件で保存すれば、この混合液を数ヶ月間保存することが可能です。その後、各サンプルのPCR産物を生成します。PCR完了直後に、ホスホレートおよびビオチン修飾5'プライマーセットを添加します。各PCRチューブに T7 exonuclease を 2 µL 加え、室温で40分間インキュベートします。このインキュベーションの終了後、0.5 M EDTA (pH 8.0) を 12.5 µL 混合液に加えます。これにより、合計約 64.5 µL の単鎖 PCR 産物が得られます。ピペットを用いて Resus Bend Microsphere マスターミックスを再懸濁させます。適切な量をエッペンドルフチューブに分注してください。チューブにキャップをし、ウォーターバスソニケーターで2分間超音波処理します。低プロファイル96ウェルプレートの適切なウェルに、17 µLの単鎖PCR産物を分注し、それぞれに33 µLの再懸濁済み超音波処理ビーズ混合液を加えます。プレートにシリコンカバーを被せてタッピングします。プレートをサーマルサイクラーに慎重にセットし、95 °Cで5分間、60 °Cで10分間、その後60 °Cで保持（または60 °Cで5分間の一時停止）というプログラムを設定します。終了し、プログラムを開始します。新鮮なstrep Aden FICO Ethin溶液を調製します。1ウェルあたり25 µL必要です。ストック溶液を1 mg/mLに希釈して、strepおよびFICO ethinを調製してください。1x TMACバッファーを用いて、50～20 µg/mLに調整します。サーマルサイクラーが60 °Cの保持ステップに達したら、蓋を開け、シリコンカバーを取り外して、Strep-din-FICO-ethin溶液を各ウェルに直接添加します。シリコンカバーを戻してサーマルサイクラーの蓋を閉め、プログラムを再開します。プログラムが完了したら、プレートを取り出し、速やかにBio-Plexマシンに移して読み取ります。プレートは10分以内に読み取る必要があります。プレートは60°Cで読み取ってください。Bio-Plexがこの温度まで予熱されていることを確認してください。ここでは、単一の個体から採取されたタイムゼロにおける縦断的サンプルの、対応するグラム染色結果とLuminexプロファイルを示しています。グラム染色はBVの臨床診断と一致しており、これはGardnerella vaginalisおよびAtopobium vaginaeを含むBV関連微生物に対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示すFiveplex Luminexアッセイによって裏付けられています。時間の経過とともに、Lactobacillus Inersも低レベルで検出されます。グラム染色で示されるように、この個体はBV微生物叢から正常な微生物叢へと移行しています。これらの同一サンプルをLuminexで解析したところ、Gardnerella Vaginalisの存在量はピークに達した後に減少し、一方でlactobacillus inersが増加して、最終的なタイムポイントまでに優位な微生物となったことが示されました。この方法を用いて微生物相のプロファイリングを行うことで、特定の微生物の存在およびその存在量に関する情報を得ることができます。本手法はシーケンスベースであるため、プローブ設計にディープシーケンシング解析の結果を反映させることができ、次世代シーケンシング法で特定された微生物を、迅速かつ比較的低コストな方法で試料中から追跡することが可能です。このビデオを視聴することで、LuminexまたはBio Plex装置を用いて試料から微生物プロファイルを作成する方法について、十分な理解が得られたことと思います。オリゴヌクレオチドプローブを蛍光ビーズに結合させ、臨床サンプルまたは環境サンプルから一本鎖DNAを生成し、ハイブリダイゼーションを行い、LuminexまたはBio Plex装置で結果を判定する方法について説明しました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。

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3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア...

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶオリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを用いた細菌の多重検出法。Bio-Plex機器を使用し、臨床・環境試料中の微生物の存在と豊度を迅速かつ半定量的にプロファイリングする手法です。

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

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