Name: マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学ぶマウス着床前胚におけるタンパク質発現の定量分析法。共焦点顕微鏡を用いた単一細胞分解能のイメージングにより、リネージュ仕様と細胞集団内の異質性を解析できます。この手法は発生生物学研究に有用です。

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著者は、データの取り扱い、分析、表現に関する意見をいただいたStefano Di Talia、Alberto Puliafito、Venkatraman Seshan、Panagiotis Xenopoulos、免疫蛍光プロトコルと抗体検査の設計を支援してくださったBerenika Plusa、そして原稿とこのプロトコルの開発についてコメントを提供してくださったHadjantonakis研究室のメンバーに感謝します。当研究室での研究は、国立衛生研究所R01-HD052115およびR01-DK084391、およびNYSTEM N13G-236の支援を受けています。

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

現在のプロトコルは、着床前段階のマウス胚の全マウント免疫蛍光の定量的な分析を実行する方法について説明します。堅牢な免疫蛍光プロトコル22は、高解像度、ホールマウント共焦点イメージングによっておよびソフトウェア4の仕立て片を用いて画像分割が続いています。免疫蛍光プロトコルの選択は重要ではないが、我々は、高速で信頼性が高いことが、我々がテストした抗体の多くは強いシグナルを提供するために、ここに22を提示されている1つを見つけます。他のプロトコルが続くことがあり、そのアプリケーションは同等の実験で一貫して提供します。多くの要因は、個々の実験の結果に影響を与える、と実験の間の直接の比較は必ずしも可能ではありませんが、我々は繰り返し間の整合性のために努力し、十分な技術的反復を実行すると、大幅に変動を減少させることを発見しました。そのため、一度最適化された、固定およびimmunolabelinG試薬およびプロトコル、ならびに撮像条件は、同等の実験の間に一定に保たれるべきです。 多くのエラー（ すなわち 、オーバ...

マウスの着床前胚は、細胞の運命の仕様および哺乳動物におけるデノボ上皮の研究のための出現とin vivoでの多能性の維持だけでなく、モデルを研究するためのパラダイムです。そして2胚体外系統、栄養外胚葉（TE）と - ほとんどの体細胞組織と生殖細胞を生じさせる - 哺乳類の発生の着床前段階は胚盤胞、すなわち多能性胚盤葉上層を構成する3つの細胞系統の確立に専念しています原始内胚葉（PRE）（ 図1A）1,2。このプロトコルは、（1）収穫に手順を説明し、着床前段階のマウス胚を固定し、（2）目的のタンパク質を標識するために免疫蛍光を行う、（3）のzセクショニング機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて全マウントイメージングを行い、（4）共焦点画像とその後の定量的画像分析の核セグメンテーションを行います。このパイプラインは、トンを可能にします彼は、 その場での細胞の亜集団を特徴づけるために、セルIDの割り当てのためのタンパク質レベルの測定に公正。データ解析（ 図1B）に胚コレクションから、（一般的に10マウス胚まで）単一のごみのために4日-このプロトコルはわずか3で行うことができます。いくつかの同腹仔の同時分析は、このように、プロトコルの全体の長さを延長する、画像化およびデータ分析の時間負担を増加させます。 着床前段階のマウス胚は、その小さなサイズとステレオタイプの形態3与えられた、実験的に扱いやすいシステムであり、単一セルの解像度を持つ細胞プロセスのトト撮影に適しています。胚の統計学的に関連する多数の公平な、システムレベルの分析を行うために、自動化され、定量分析パイプラインが望ましいです。しかし、胚盤胞の内部細胞塊（ICM）（高核密度に起因<st栄&gt;図1A、図2D）、従来の画像分割プラットフォームは、自動化または半自動化されたワークフローを確立するために十分な精度が得られません。一方、マニュアルセグメンテーションは、正確な一方で、細胞や胚の大コホートの処理を許可していません。また、セルアイデンティティの再現性、公平な決意するのに適している - 発達段階を研究する際に特に重要であるマーカーのパターン式は完全に（ 例えば 、人口全体のバイナリディストリビューションを示さない）解決しません。最近開発され、最小限のユーザ入力4-8を必要としつつ、高精度を実現マウス着床前段階の胚およびマウス胚性幹細胞（ESC）に合わせた画像分割方法を検証しています。 ここで紹介する解析パイプラインは、MATLABベースの画像分割ツールモジュラー対話型原子力セグメンテーション（MINS）4を中心に展開。 MINS Pユーザは、グラフィカル・ユーザー・インターフェース（GUI）（ 表1）4 を使用して 、画像特性の最小数を確立した後、共焦点のZスタックの大きなバッチの教師なし核セグメンテーションをerforms。このパイプラインは、野生型、実験的に処理し、遺伝的に改変された胚とのESC 5-7の両方でタンパク質の発現および細胞局在化の高スループットデータの生成のために効率的であることが証明されました。現在のプロトコルでは、我々は、着床前段階の胚の画像のセグメンテーションにMINSのアプリケーションを記述します。 ESCの上MINS性能の例については4.7を参照してください。空間的な蛍光強度の測定は、セル識別情報の公正な決意胚（ 図中の遺伝子発現ドメイン及び細胞位置の三次元マップの生成を可能にする一方、自動化された核のセグメント化ステップが大きく、セル識別プロセスの時間の負担を軽減1C </strong&gt;）。また、このワークフローの拡張性は、実験的に処理された胚の大コホートを通じて個々リットルの分析、または異なる遺伝的背景5,6の胚にそれが適用になります。 MINSは（ソフトウェアは、MATLABのライセンスが必要）http://katlab-tools.orgで自由に利用可能です。 今日までに開発なしのアプローチは、マウスの着床前胚におけるタンパク質発現および細胞局在化に対するこのような綿密なデータの生成を可能にしません。すべての試みはこれまでに、これらのタイプのデータを定量化で9月19日 （いずれか完全に手動で、またはソフトウェアアシスト）胚における異なる集団のために細胞数のマニュアル決意および定量に制限されています。 （MINSソフトウェアを組み込んだ）このアプローチは、に合わせ、マウスの着床前胚およびESCの上でテストされています。それにもかかわらず、高核密度を有する他のシステムでは、その性能は、まだテストされていないが、同等であると予想されます。

<table><tbody><tr><td>胚コレクション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラグチェック用鈍いプローブ</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>組み立て済み吸引器チューブ &マウスピース</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>長めのゴムチューブ</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>ミリポア</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>ミリポア</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>酸性チロード液</td><td>ミリポア</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>免疫蛍光</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td></td><td>ΣH0146</td><td></td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td>Concentration</td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R&D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>サンタクルス</td><td>sc-9053</td><td>1:100、10分固定</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>サンタクルス</td><td>sc-1237</td><td>1:100、O/N 固定</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R&D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min to O/N fixation</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies Life</td><td>Technologies</td><td>Various</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer running 64-bit Windows OS</td><td></td><td>n/a</td><td>Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (software)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (ソフトウェア)</td><td>無料</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

このプロトコルは、系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のインサイチュ分析で定量、単セルを実行するための方法を提供 マウスの着床前胚インチ胚コレクション、免疫蛍光、共焦点顕微鏡で画像化し、画像分割および分析のために必要な手順が記載されています。この方法は、複数の核マーカーの発現と空間胚内のすべてのセルの（XYZ）座標の定量を可能にします。それはMINS、特に着床前胚および胚性幹細胞（ESC）のコロニーの共焦点画像の解析のために開発された画像セグメンテーションのソフトウェアツールを利用しています。 MINSはX、YおよびZ次元を横切る教師なし核セグメンテーションを行い、最小限のユーザ入力で、すべてのチャンネルについて、三次元空間内のセルの位置情報、ならびに核蛍光レベルを生成します。このプロトコルは、画像の解析のために最適化されているが着床前段階のマウス胚の、容易に良好な信号対雑音比を示す任意の他のサンプルの分析に適合し、ここで、高核密度は、画像分割（ 例えば 、胚性幹細胞（ESCの発現解析に障害をもたらすことができます）コロニーを、培養物中の細胞を分化、他の種または段階の胚、 等 ）。

すべての細胞およびそれらの相対的な位置を分析することができるように、データの解釈とプレゼンテーションを容易にするために、ケアは、収集および操作中の胚を傷つけないように注意すべきである。図2A - 。Dは、拡張キャビティと異なる段階で無傷の胚盤胞の例を示しています。発生する損傷べき結果を分析し、解釈する際に、余分な注意が必要です。 このプロトコルを使用して生成されたデータの品質と信頼性は、固定の品質に、目的のタンパク質を検出するために使用される抗体の信号対雑音比に依存します。常に新鮮な固定液を使用して、一連の実験を開始する前に、適切な陽性および陰性対照で、新しい抗体をテストする。 図2Aは、核タンパク質の数のための良好な抗体の例を示している。 図2Bは examplを示しています細胞質タンパク質（DAB2）のための良好な抗体の電子。 図2...

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

このプロトコールの全体的な目標は、マウス着床前胚のタンパク質レベルをin situで定量することです。そのため、この方法により、シングルセル解像度の共焦点顕微鏡画像のハイスループット解析を半自動化された方法で行うことができます。この方法は、核密度が高い場合や、細胞集団内の不均一性を研究したい場合に、共焦点画像上のタンパク質濃度を定量化するために使用できます。まず、ガラスパスツールピペットで直火を使用して、先端に毛細管の端を描きます。ピペットの遠端をキャピラリーにそっとこすりつけて、鈍い端を作りながらピペットを壊します。妊娠した雌マウスを所望の胚発生日に犠牲にした後、テキストプロトコルに従って腹部内臓を露出させ、子宮の位置を特定します。頸部の端を保持し、子宮頸部を切り取り、ゆっくりと引き上げて両方の子宮角を伸ばします。子宮壁を突き刺さないように注意しながら、脂肪を切り取ります。卵管の上、卵巣の下を切って子宮全体を放出し、ペトリ皿の上に置きます。次に、子宮をPBSで覆い、子宮頸部の両側の近位端を切り取って両方の子宮角を分離します。次に、それらを接続する峡部の下を切ることにより、各卵管を子宮から分離します。解剖顕微鏡下で、皮下注射針付きの1mLシリンジを使用して、子宮頸部の開口部から各角に0.5〜1mLの培地を強制的に通すことにより、胚盤胞を子宮から操作培地に流します。フラッシング後、胚盤胞が皿の底に沈むまで最大1〜2分待ちます。次に、胚盤胞の位置を特定し、毛細血管端を備えた口制御ガラスパスツールピペットを使用して、胚盤胞を収集し、新しい培地の滴に移します。胚盤胞をすすぎた後、酸性チロード溶液を使用して透明帯を取り除き、胚を短時間洗浄します。帯が見えなくなったらすぐに、胚盤胞を操作媒体に戻します。胚盤胞を室温のPBSで洗浄し、室温で10分間PBS中の4%PFAに移して固定します。固定後、胚盤胞をPBSに戻し、摂氏4度で保存します。テキストプロトコルに従ってイムノフローレッセンスを行った後、細かい口のピペットを使用して、35mmのガラス底皿のガラス表面にPBSまたは核染色液を微量に滴下し、それらを鉱物油で覆います。胚をマイクロドロップに置き、一貫した方法で、できればICMキャビティへのアクセスがガラス表面と平行になるように配置してから、顕微鏡ホルダーに皿をセットします。共焦点イメージングを行うには、蛍光色素を漂白することなく、強力なS/N比を実現できる最小のレーザー出力を使用します。ゲインとオフセットを調整して、サンプルを露出オーバーにすることなく最も広いダイナミックレンジを取得します。グレースケール範囲のほとんどまたは全体をキャプチャすると、画像間の強度のわずかな違いを検出しやすくなります。テキストプロトコルで概説されている追加の詳細に従って、Z軸全体にわたって胚を画像化します。MATLAB ベースのセグメンテーション ツールである Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS) のグラフィック ユーザー インターフェイスに従って、顕微鏡で生成された生データの共焦点画像または Z スタック全体を読み込みます。各ステップの結果を表示するには、対応する「表示」ボタンをクリックします。ボタンの上にある黄色のタグは、処理中の操作を示します。緑色のタグは、操作が完了したことを示します。セグメンテーションに進む前に、検出ステップの結果を評価します。満足できない場合は、検出パラメータを変更して再実行してください。バッチモードの「実行」メニューから「ファイルの追加」をクリックし、処理するすべてのファイルを一度にロードします。[バッチモード実行の開始]をクリックし、ソフトウェアがファイルを処理する時間を確保します。セグメンテーション出力は、元のファイルと同じディレクトリに保存されます。アポトーシス小胞や、無傷の核ではないが、MINSによってそのように特定された可能性のある他の要素などの偽陽性を特定します。誤検出の対応するレコードを starstatistics から削除します。csv ファイル。元の starstatistics. csv ファイルは後で参照できるように保持し、そのコピーのみを編集します。核が過剰にセグメント化され、2つ以上の核として提示されている場合は、強度レベルを平均化してレコードを統合するか、そのセルのレコードの1つを保持し、残りを破棄します。セグメンテーションで解決するには、MINS が 2 つ以上の核間の境界を検出できず、それらを 1 つの核としてセグメント化したイベント、または核を完全に検出できなかったイベントを特定します。ImageJ を使用して、セグメント化されていないセルの各チャネルの平均グレーレベルを測定します。次に、フリーハンド選択ツールを使用して、DNAチャネル上の下核またはセグメント化されていない核の内側セクションを見つけ、セグメント化されていない核の下またはセグメント化されていない核の周囲を概説します。次に、Control M」を押すか、「分析」メニューに移動して「測定」これにより、輪郭が描かれた領域の平均グレー値が記録され、新しいウィンドウに表示されます。DNAチャネルで選択したのと同じアウトライン領域を使用して、目的の各蛍光チャネルの測定を繰り返します。結果は、測定結果ウィンドウで前の結果に逆転されます。次に、取得した測定値を使用して、starstatistics. csvファイル内のエラーのあるレコードを置き換えます。核のセグメント化が不十分な場合は、その行を複製し、新しいセルごとに異なるセルIDを割り当て、ImageJで取得した値を対応する列の下に導入します。この場合、両方のセルは空間座標を共有します。分裂核を分析で個別に考慮する場合は、手動でスコアリングし、その情報をデータファイルに追加します。追加の画像処理手順については、テキストプロトコルを参照してください。この図は、空洞が拡大したさまざまな段階での無傷の胚盤胞の例を示しています。ここでは、CDX2、GATA4、GATA6、NANOG、OCT4など、多くの核タンパク質に対する優れた抗体の例を示しています。このサンプルは、高いS/N比を示す細胞質タンパク質DAB2で標識されました。このパネルでは、サンプルを10分間だけ固定したGATA4のSiningが不良な例を示しています。この特定の抗GATA4抗体は、強力なシグナルを提供するために一晩の固定が必要です。これらの胚は、NAが1.30、作動距離が0.21mmの40倍油浸対物レンズで画像化されました。下のパネルは、胚が進行するほど核密度が高くなり、セグメンテーションエラーの可能性が高くなります。これらの画像は、アポトーシス核を生細胞として検出する、セグメンテーションを過剰に行う、セグメンテーションを過小に行うなど、MINSが犯す可能性のあるエラーを示しています。この一連の Z スライスは、2 つのセルが 1 つとして識別されたセグメンテーション不足イベントを示しています。一度習得すれば、このプロトコルは最初から最後まで3〜4日で実施でき、1日あたり2〜4時間の時間負担がかかります。この手順を実行する際には、実験条件、つまり免疫蛍光プロトコルとイメージングパラメータと非常に一貫性を保つことを覚えておくことが重要です。この技術は、開発後、マウス発生生物学の研究者が単一細胞における遺伝子およびタンパク質発現のin situ定量解析を行う道を開きました。この動画をご覧いただければ、定量的なin situ発現解析に適した画像データの取得方法についてご理解いただけると思います。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。...

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。...

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詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

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タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。...

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル...

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。...

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

このプロトコルは、初期のエンハンサー転写産物を定量化するための合理化された計算パイプラインを提供します。クロマチンアクセシビリティ、クロマチン特徴、転写データを統合することで、複雑な遺伝子内領域におけるエンハンサー活性の正確な検出と鎖特異的分析を可能にし、広範なバイオインフォマティクスのトレーニングを受けなくても研究者がアクセスできるようにします。...

マウス胚性幹細胞における遺伝子間/遺伝子内エンハンサーRNA定量のための計算パイプライン

学ぶマウス着床前胚におけるタンパク質発現の定量分析法。共焦点顕微鏡を用いた単一細胞分解能のイメージングにより、リネージュ仕様と細胞集団内の異質性を解析できます。この手法は発生生物学研究に有用です。

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

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