マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。

このプロトコールの全体的な目標は、マウス着床前胚のタンパク質レベルをin situで定量することです。そのため、この方法により、シングルセル解像度の共焦点顕微鏡画像のハイスループット解析を半自動化された方法で行うことができます。この方法は、核密度が高い場合や、細胞集団内の不均一性を研究したい場合に、共焦点画像上のタンパク質濃度を定量化するために使用できます。

まず、ガラスパスツールピペットで直火を使用して、先端に毛細管の端を描きます。ピペットの遠端をキャピラリーにそっとこすりつけて、鈍い端を作りながらピペットを壊します。妊娠した雌マウスを所望の胚発生日に犠牲にした後、テキストプロトコルに従って腹部内臓を露出させ、子宮の位置を特定します。

頸部の端を保持し、子宮頸部を切り取り、ゆっくりと引き上げて両方の子宮角を伸ばします。子宮壁を突き刺さないように注意しながら、脂肪を切り取ります。卵管の上、卵巣の下を切って子宮全体を放出し、ペトリ皿の上に置きます。

次に、子宮をPBSで覆い、子宮頸部の両側の近位端を切り取って両方の子宮角を分離します。次に、それらを接続する峡部の下を切ることにより、各卵管を子宮から分離します。解剖顕微鏡下で、皮下注射針付きの1mLシリンジを使用して、子宮頸部の開口部から各角に0.5〜1mLの培地を強制的に通すことにより、胚盤胞を子宮から操作培地に流します。

フラッシング後、胚盤胞が皿の底に沈むまで最大1〜2分待ちます。次に、胚盤胞の位置を特定し、毛細血管端を備えた口制御ガラスパスツールピペットを使用して、胚盤胞を収集し、新しい培地の滴に移します。胚盤胞をすすぎた後、酸性チロード溶液を使用して透明帯を取り除き、胚を短時間洗浄します。

帯が見えなくなったらすぐに、胚盤胞を操作媒体に戻します。胚盤胞を室温のPBSで洗浄し、室温で10分間PBS中の4%PFAに移して固定します。固定後、胚盤胞をPBSに戻し、摂氏4度で保存します。

テキストプロトコルに従ってイムノフローレッセンスを行った後、細かい口のピペットを使用して、35mmのガラス底皿のガラス表面にPBSまたは核染色液を微量に滴下し、それらを鉱物油で覆います。胚をマイクロドロップに置き、一貫した方法で、できればICMキャビティへのアクセスがガラス表面と平行になるように配置してから、顕微鏡ホルダーに皿をセットします。共焦点イメージングを行うには、蛍光色素を漂白することなく、強力なS/N比を実現できる最小のレーザー出力を使用します。

ゲインとオフセットを調整して、サンプルを露出オーバーにすることなく最も広いダイナミックレンジを取得します。グレースケール範囲のほとんどまたは全体をキャプチャすると、画像間の強度のわずかな違いを検出しやすくなります。テキストプロトコルで概説されている追加の詳細に従って、Z軸全体にわたって胚を画像化します。

MATLAB ベースのセグメンテーション ツールである Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS) のグラフィック ユーザー インターフェイスに従って、顕微鏡で生成された生データの共焦点画像または Z スタック全体を読み込みます。各ステップの結果を表示するには、対応する「表示」ボタンをクリックします。ボタンの上にある黄色のタグは、処理中の操作を示します。

緑色のタグは、操作が完了したことを示します。セグメンテーションに進む前に、検出ステップの結果を評価します。満足できない場合は、検出パラメータを変更して再実行してください。

バッチモードの「実行」メニューから「ファイルの追加」をクリックし、処理するすべてのファイルを一度にロードします。[バッチモード実行の開始]をクリックし、ソフトウェアがファイルを処理する時間を確保します。セグメンテーション出力は、元のファイルと同じディレクトリに保存されます。

アポトーシス小胞や、無傷の核ではないが、MINSによってそのように特定された可能性のある他の要素などの偽陽性を特定します。誤検出の対応するレコードを starstatistics から削除します。csv ファイル。

元の starstatistics. csv ファイルは後で参照できるように保持し、そのコピーのみを編集します。核が過剰にセグメント化され、2つ以上の核として提示されている場合は、強度レベルを平均化してレコードを統合するか、そのセルのレコードの1つを保持し、残りを破棄します。

セグメンテーションで解決するには、MINS が 2 つ以上の核間の境界を検出できず、それらを 1 つの核としてセグメント化したイベント、または核を完全に検出できなかったイベントを特定します。ImageJ を使用して、セグメント化されていないセルの各チャネルの平均グレーレベルを測定します。次に、フリーハンド選択ツールを使用して、DNAチャネル上の下核またはセグメント化されていない核の内側セクションを見つけ、セグメント化されていない核の下またはセグメント化されていない核の周囲を概説します。

次に、Control M」を押すか、「分析」メニューに移動して「測定」これにより、輪郭が描かれた領域の平均グレー値が記録され、新しいウィンドウに表示されます。DNAチャネルで選択したのと同じアウトライン領域を使用して、目的の各蛍光チャネルの測定を繰り返します。結果は、測定結果ウィンドウで前の結果に逆転されます。

次に、取得した測定値を使用して、starstatistics. csvファイル内のエラーのあるレコードを置き換えます。核のセグメント化が不十分な場合は、その行を複製し、新しいセルごとに異なるセルIDを割り当て、ImageJで取得した値を対応する列の下に導入します。

この場合、両方のセルは空間座標を共有します。分裂核を分析で個別に考慮する場合は、手動でスコアリングし、その情報をデータファイルに追加します。追加の画像処理手順については、テキストプロトコルを参照してください。

この図は、空洞が拡大したさまざまな段階での無傷の胚盤胞の例を示しています。ここでは、CDX2、GATA4、GATA6、NANOG、OCT4など、多くの核タンパク質に対する優れた抗体の例を示しています。このサンプルは、高いS/N比を示す細胞質タンパク質DAB2で標識されました。

このパネルでは、サンプルを10分間だけ固定したGATA4のSiningが不良な例を示しています。この特定の抗GATA4抗体は、強力なシグナルを提供するために一晩の固定が必要です。これらの胚は、NAが1.30、作動距離が0.21mmの40倍油浸対物レンズで画像化されました。

下のパネルは、胚が進行するほど核密度が高くなり、セグメンテーションエラーの可能性が高くなります。これらの画像は、アポトーシス核を生細胞として検出する、セグメンテーションを過剰に行う、セグメンテーションを過小に行うなど、MINSが犯す可能性のあるエラーを示しています。この一連の Z スライスは、2 つのセルが 1 つとして識別されたセグメンテーション不足イベントを示しています。

一度習得すれば、このプロトコルは最初から最後まで3〜4日で実施でき、1日あたり2〜4時間の時間負担がかかります。この手順を実行する際には、実験条件、つまり免疫蛍光プロトコルとイメージングパラメータと非常に一貫性を保つことを覚えておくことが重要です。この技術は、開発後、マウス発生生物学の研究者が単一細胞における遺伝子およびタンパク質発現のin situ定量解析を行う道を開きました。

この動画をご覧いただければ、定量的なin situ発現解析に適した画像データの取得方法についてご理解いただけると思います。