Name: 全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ β-ガラクトシダーゼ活性検出法でマウス胚における遺伝子発現パターンを可視化する手法です。パラフィン切片や全胚マウントに適用でき、発生生物学研究で広く利用可能です。

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セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares (CNIC) でその技術支援の病理組織学的サービスに感謝したいと思います。我々 はまた私たちのプロジェクトを支援するためと原稿の彼女の重要な読書の親切の提供する Mt4 mmpLacZマウスの清木元治博士と博士アリシア G. アロヨを感謝します。我々 はこの記事を校正のピーター ・ ボニーを感謝したいと思います。この作品は、C.S.C. に与えられる助成金 (# 2017UEM01) によるエウロペア デ マドリッドによって支えられました。

すべての実験手順は、CNIC (セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares) と、マドリード ・ アウトノマ コムニダード最小限動物の苦しみを確保するための動物実験の倫理委員会によって承認されました。
1. (E12.5 に E8.5) から妊娠のマウス胚のコレクション
<ol><li>頚部転位または CO2吸入のいずれかによって妊娠マウスを犠牲に。最初の日は、膣にプラグは胚と考えられていた観察日 0.5 (E0.5)。</li>
	<li>吸収パッドに仰臥位で動物を置き、70% エタノールでマウスの腹部の皮膚をきれい。 注: 次の手順では不妊は必要はありません。</li>
	<li>ピンチ、マウス歯の鉗子を使用して腹部の皮膚を持ち上げます。</li>
	<li>皮膚と腹壁、手術用のはさみを使用して腹部の正中線に垂直に 2 に 4 cm 切開を行います。</li>
	<li>腹部を公開し、母親からは子宮の内側の曲率に沿って切削血管鉗子、手術用はさみで子宮角を削除します。</li>
	<li>胚の文字列を削除して、10 mL の冷たい 0.01 M リン酸バッファー生理食塩水 pH 7.4 (PBS) を含有した氷のシャーレに転送。</li>
	<li>10 mL の新鮮な氷冷 PBS でシャーレに実体顕微鏡下で子宮からうち胚を慎重に分析します。羊膜の嚢を公開する時計の鉗子で筋肉壁をつかんで、囲まれた胚と卵黄嚢の鉗子の先端を使用して削除する羊膜を引き裂きます。</li>
	<li>(E12.5 に E8.5) から初期の段階で妊娠マウスから littermate 胚を収集 (図 2)。</li>
	<li>カーブタイプ鉗子を使用して 10 mL 冷 1x PBS で新鮮な料理に胚を転送または、(E8.5-E9.5) で非常に小さい胚、胚損傷することがなくサンプルを収集するプラスチック転送ピペットを使用します。</li>
	<li>固定を開始、する前に胚の小片をカットまたは時計の鉗子で (E9.5、E8.5) から最小の胚羊膜由来細胞を取って、遺伝子型遠心チューブに胚サンプルを取得します。 注: LacZ 遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のプライマーによって決まります: 前方、5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´;逆に、5´ CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´。</li>
</ol>2. マウス胚の固定
<ol><li>2 mL の遠心管に 1 mL の 1x PBS を含む丸いベースとそれぞれの胚を転送します。 注: は、ローリング シェーカーを使用する攪拌とこれらのチューブのプロトコルですべての手順を実行します。</li>
	<li>残りの血液を排除するために室温で 1 分 1 × PBS で胚を洗います。チューブ内の液体を変更する使用プラスチック転送ピペット。</li>
	<li>氷の上の 0.125% グルタルアルデヒドの 1 mL の胚を修正します。 注: 固定の時間によって異なります胚のサイズ: E8.5 E9.5 胚、E12.5 胚の 1 h E10.5 胚のため 30 分の 20 分。</li>
	<li>固定を外し、x-gal 染色のサンプルを処理する前に、室温で 10 分間 2 回 1 × PBS で胚を洗います。</li>
</ol>3 マウス胚の全体マウント β-ガラクトシダーゼの組織化学的研究
<ol><li>準備 X Gal リンス バッファーとの手順を開始する前に X-gal 染色液 (表 1と表の材料を参照)。ネガティブ コントロールとして酵素反応の野生型 (WT) littermate 胚を使用します。</li>
	<li>(図 2) 室温で 10 分間 X Gal リンス バッファー内胚孵化させなさい。</li>
	<li>光から保護されている 37 ° C で一晩に 2 h から X-gal 染色液に胚を孵化させなさい。胚の背景なしブルー染色の十分な強度を観測するまでは、解剖顕微鏡を介して定期的に発色を監視します。8 と 9 全体染色時の背景を減らすために溶液の pH を保ちます。染色液は、光をオンに開始された場合は、酵素反応を拡張する新鮮な基板の解決で置き換えます。</li>
	<li>室温で 10 分ずつの 2 回 1 mL 1x PBS で微量遠心チューブに胚を洗浄することにより所望の信号を取得する際は、反応を停止します。</li>
	<li>一夜にして 4 ° C で 1 時間 1 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 再、それらを修正するためにステンド グラスの胚を転送します。 注: 胚は 4% に格納できる PFA/4 ° C で長い時間 PBS または区分のためすぐに処理することができます。この最終的な固定ステップは染色パターンの長期的な保全のために重要です。</li>
	<li>室温で 10 分間 2 回 1 mL 1x PBS で胚を洗います。</li>
	<li>オプション 1: は、一連の各ソリューションに室温で 1 時間 (1 × PBS で 20%、40%、60%、80% グリセロール) グリセロールの濃度の増加とソリューション浸漬によって胚をクリアします。 注: 長い時間の 80% のグリセロールで胚を洗う、さらに日がオフになっていて、このステップ (図 2) で 4 ° C で 80% グリセロールに格納するまで。グリセロールまたは 1 倍で 4 ° C で保存胚にチモール アジ化ナトリウム又は結晶の非常に少量を追加する PBS をカビの生育を防ぐためにお勧めします。後、(手順 4) を撮影するため胚全体のマウントを使用できます。</li>
	<li>オプション 2: パラフィン埋め込み、ミクロトーム (図 2) を使用して区分のための胚を処理します。(手順 4 および 5) を区分する前に全体染色胚の表現パターンを文書化します。</li>
</ol>4. マウント胚の写真
<ol><li>ベースを使用したシャーレに移して、全体のマウントを区分する前に胚をステンド グラスの写真を 1x PBS で 1-2% の agarose を固めた。</li>
	<li>脱水と液体を通して撮影しながら反射を防ぐために agarose コーティング料理 10 mL 1x PBS で完全に胚をカバーします。</li>
	<li>鉗子を用いた 1x PBS 中に浸漬胚をオリエンテーションします。古い胚 (E10.5 E12.5)、鉗子を配置し、様々 な角度でそれの内で供試体の位置と写真の中に自由を避けるために agarose の小さな穴を作りします。</li>
	<li>送信 (下ステージ) の光を使用して顕微鏡のステージに皿を置きます。'ダーク フィールド' と '明るいフィールド' 調整写真撮影中に必要な照明を設定して、サンプルの透光性を最適化するために変更します。 注: は、胚の表面での反射を避けるために後の段階の胚の繊維ファイバー照明を使用します。クリアされた胚を撮影するとき手順は同じ 100% グリセロールを含んでシャーレに移して、完全にそれらを浸します。</li>
</ol>5. パラフィン埋め込み、X gal の区分は胚をステンド グラス
<ol><li>パラフィン ワックスを埋め込む<ol>
<li>4 ° C (ステップ 3.5) から胚をステンド グラス X gal を取り外して洗って 1 mL の 1x PBS で 3 回定着剤の過剰を排除します。</li>
		<li>鉗子を使用して組織カセットにそれぞれの胚を転送します。</li>
		<li>ビーカーに胚を含むカセットを配置し、室温で傾斜エタノール シリーズを介してそれらを渡すことによって、脱水: 70% エタノール、1 回 30 分まで。96% のエタノール、それぞれ 30 分の 2 回100% エタノール、30 分の 2 回。 注: 胚は 70% のエタノールの脱水プロセスを開始するまで 4 ° C で不定時間を格納できます。</li>
		<li>室温で 30 分間イソプロパノールで全体のカセットを孵化させなさい。</li>
		<li>鉗子を使用して、予め温めておいたイソプロパノールを含むトラフを染色ガラスにカセットを転送し、30 分の 60 ° C のオーブンで残します。</li>
		<li>新しいガラス 50% イソプロパノールの混合物を含んでいるトラフを染色でカセットを配置/50% パラフィン ワックスを溶かし、60 ° C のオーブンで 4 h のまま。</li>
		<li>溶融パラフィン ワックス、各 60 ° C で 30 分間の 2 つの変更の胚でカセットを孵化させなさい。</li>
		<li>最終的なパラフィン洗浄の最後に、カセットを開き、顕微鏡下でサンプルを表示する型を埋め込む別組織にそれぞれの胚を転送します。</li>
		<li>60 ° C で溶融パラフィン ワックスで井戸を埋める溶融ワックスを保ち、慎重に金型で胚をオリエンテーション温水鉗子を使用します。 注: サンプルの適切な向きはさまざまな断面で胚の区分のための重要なステップです。</li>
		<li>パラフィンは、金型で立体化、前に、ブロックの上に蓋のないカセットを置き、溶融パラフィン ワックスでそれを埋めます。一晩常温で固化するまで、残りのワックス涼しくてをみましょう。</li>
		<li>パラフィンは完全に固化後、金型から純色のブロックを削除し、14断面まで室温でまたは 4 ° C でのパラフィン ブロックを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パラフィン切片<ol>
<li>ミクロトームの刃の向き、5-7 μ m の厚さを設定します。5.2.2。 クールな氷の上のパラフィン ブロック、キューブまたはピラミッドを作成するそれをトリミングします。</li>
		<li>溶融ワックスの少量を使用してブロックをミクロトーム ホルダーに取り付けます。</li>
		<li>最適な切断用ブロックを向けます。標準的なミクロトームを使用して室温で 5-7 μ m の厚さのスライスにパラフィン ブロックのセクション。</li>
		<li>細かいペイント ブラシを使用して、操作およびスライスを選択するため室温で水浴のセクションに配置します。</li>
		<li>顕微鏡のスライドと風呂の水からのセクションをピックアップし、ストレッチ 42 ° C の水浴へ彼らを移します。</li>
		<li>風呂の水からセクションを削除し、優しく密着顕微鏡スライド上に配置します。</li>
		<li>完全に準拠するためのセクションを許可するように一晩に 37 ° C のオーブンでよくスライドを乾燥、染色中に失われる可能性があります彼らそれ以外の場合。 注: は、染色法を開始するまで 4 ° C でスライドを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deparaffinization と X Gal ステンド パラフィン切片の Counterstaining<ol>
<li>パラフィン ワックスをより流動的に少なくとも 45 分の 60 ° C のオーブンで顕微鏡スライド トレイにスライドを置きます。</li>
		<li>ラックにスライドを転送し、次の手順を実行するガラス皿を染色を使用: 完全なパラフィン除去と組織の水和のための濃度の減少のアルコールを含む染色瓶にラックを水没: イソプロパノールで 5 分間60 ° C;3 分; イソプロパノール100% のエタノールの 2 分;96% のエタノールの 1 分;70% エタノール室温で 1 分。</li>
		<li>アルコール残基がないことを確認する 2 回蒸留水のセクションをすすいでください。</li>
		<li>対比染色 (3 分) の間に通常 5 分間室温 (図 2) の (例えば原子高速赤ソリューション) 染みのついたセクション。 注: この染色のセクションで全体的な組織構造を明らかにすることができます。</li>
		<li>染色後、1 分の蒸留水でスライドを洗浄し、顕微鏡で染色を参照してください。 注: 必要な染色が弱すぎる場合、対比染色に長い時間の間再びセクションします。</li>
		<li>エタノール濃度の増加で次の一連のセクションを脱水: 2 分の 95% エタノールの 2 つの洗浄、2 つは 2 分ごとに、100% エタノールで洗浄し、青の溶解を避けるために色沈殿物、キシレン 1 つだけ簡単に洗浄します。</li>
		<li>スライドを 1 つずつラックから外し、一枚の紙の上に置きます。次マウントと coverslip の各メディアを合成、恒久的なマウントを使用してスライドさせます。 注: キシレン、その蒸気は刺激し、人間の健康に、水生生物に有害な可燃性製品です。それはフード内で操作する必要があり、適切な保護具の使用が必要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する財務持分を有してないことを宣言します。

エシェリヒア属大腸菌の LacZ の遺伝子は、その高い感度と検出の容易さのため記者として遺伝子発現パターンの研究に広く使用されています。この議定書では、簡単かつ迅速に安価なだけでなく、実行する酵素反応に基づく β gal 式を検出するための古典的な方法について説明します。このメソッドは、全台紙胚、そのまま臓器、組織切片や培養細胞での大幅な変更なしも適用できます。
このメソッドの正確なアプリケーションは堅牢で解釈し染色の結果します。ただし、同時コントロールと検証手順は強く推奨します。この点で、この議定書は非特異的 x-gal 染色を監視に役立つネガティブ コントロールとして使用される野生型 littermate 胚における並列で行われます。また、発現データ取得西部のしみ方および量的な PCR (Q PCR) によって確認する β gal 染色を使用して解析 β gal による他の抗体併用免疫組織化学 (図 5) ができますの同定やLacZ9を表現する特定の細胞...

特定の遺伝子発現パターンを記述するためにレポーター遺伝子マーカーとしての使用は、ショウジョウバエから哺乳類を最優先されています。トランスジェニック、ノックアウト動物を含む実験でエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 遺伝子細菌の β-ガラクトシダーゼ (LacZ) は最も広く使用されている1,2,3,のいずれか4. β-ガラクトシダーゼ (β gal) 単糖類 (ブドウ糖そしてガラクトース)5に β-ラクトースリプレッサー (乳糖) などの加水分解を触媒します。その最も一般的に使用される基質は X-ガロン (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)、β-ガラクトシダーゼを生み出してラクトースオペロンとガラクトースで加水分解する配糖体です。最初は逆に酸化二量体で使用するとカリウム フェリと組み合わせる-鉄シアン化物の生成特性不溶性、青色沈殿 (図 1)6。
LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として 30 年以上前に使用される開始7,8。LacZの挿入、通常使用できるようにされるトランスジェニック動物、特定の挿入を含む細胞を可視化する細菌および細胞培養の内因性のトレーサーとして開いたリーディング ・ フレームの代わりに内因性プロモーターの下流開発9中遺伝子発現パターン。この点では、β-ガラクトシダーゼ活性の可視化使用されています広範囲ショウジョウバエの全体の組織を単一セルから発達と細胞のプロセスを理解します。ショウジョウバエの遺伝学はゲノム内の場所ランダムには、 LacZレポーター遺伝子を含んでいる変更された P 要素構造を挿入する安定したラインを生成を支持します。したがって、エンハンサー要素の影響下に置かれるときそれは過去二十年10の間に多くの遺伝子の発現パターンの体系的な分析を許可している組織の特定方法でその表現を駆動があります。また、 LacZ遺伝子の発現を監視するトランスジェニック マウスも使用するタゲネーシスによる遺伝子組換えイベントの検出を介した交叉およびキメラ解析の突然変異体の胚性幹細胞誘導体の局在11、一時的同様にある特定の臓器のLacZ発現の制御を容易にします。また、全胚で、β-ガラクトシダーゼ活性の検出可能性があります便利なの遺伝子発現の変化を解析するさまざまな発達段階にわたって観察できる強度の異なる差分の染色パターンを生産8,12。
この記事でマウス胚の初期の発達段階で全台紙組織染色 X gal 遺伝子発現を可視化するためのプロトコルを提案する.パラフィン埋組織や胚後標識細胞全載標本または細胞レベルでの正確な検出を支持する高感度・安価な手法としてこの組織化学的手法を提案する.メソッドは、13他の方法と比較すると最低限の背景を持つマウス組織染色の直接可視化できます。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>SCHARLAU</td><td>50004/ LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤</td><td>VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>合成封入剤</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>PROLABO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20824365 99.9% エタノール 絶対</td><td>シャラウ</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド溶液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>85% グリ</td><td>セロール MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>99.9% グリセロール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>非イオン性界面活性剤(ノニデットP-40)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>542334</td><td></td></tr><tr><td>ニュークリア・レッド・カウンターステイン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン・トローチ</td><td>メルク</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>・パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(錠剤)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>フェロシアン酸カリウム</td><td></td><td>MERCK 1049840500</td><td></td></tr><tr><td>フェロシアン化カリウム</td><td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム一水和物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性二水和物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>チモール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸塩 (トリス HCl)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (ロシュ)</td><td></td></tr><tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR ケミカル</td>ズ <td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てプラスチッククライオモールド15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr>回転<tr><td>式ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>カセット</td><td>オックスフォードトレード</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>カバーメガネ24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>スライド</td><td>Thermo Scientific、MENZEL-GL&Auml;SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml;SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>浮選 ウォーターバス</td><td>ライカ</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル ロープロファイル ミクロトームブレード</td><td>フェザー</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンオーブン</td><td>J.R. セレクタ</td><td></td><td></td></tr> 2000205<tr><td>ワックス パラフィンディスペンサー</td><td>J.R. セレクタ</td><td></td><td></td></tr> 4000490 <tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン微量遠心チューブ 2.0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン微量遠心チューブ 1.5 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>攪拌ホットプレート</td><td>Bibby</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスシェーカー</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>ラボスケール</td><td>グラム</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>精密スケール</td><td>ザルトリウスISO9001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmeter</td><td>クリソン</td><td>ベーシック20</td><td></td></tr><tr><td></td><td>光ファイバーOptech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

遺伝子発現のレポーター、細胞系譜研究におけるトレーサーとして、大腸菌の LacZ遺伝子、β-ガラクトシダーゼは主として使用されます。古典的な化学反応は基質 X gal が見やすい不溶性の青い沈殿物を生成する鉄と鉄イオンとの組み合わせでの加水分解に基づいています。したがって、開発が進むにつれて、β-ガラクトシダーゼ活性は興味の遺伝子の発現パターンのためのマーカーとして機能します。ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片と counterstaining の後続のメソッドについて述べる。さらに、X gal 胚の深い地域で染色を見やすくします全体の胚を明らかにするための手順が提供されます。一貫性のある結果は、反応条件の最適化がバック グラウンド アクティビティを最小限に抑える必要がこの手順を実行することによって得られます。試金の制限もに配慮すべき、特に全台紙の染色で, 胚の大きさ。我々 のプロトコルは、敏感な切片として全臓器にさらに適用できるマウス開発中に β-ガラクトシダーゼ検出のための信頼性の高い方法を提供します。したがって、開発全体を通して動的な遺伝子発現パターンを全胚で、このプロトコルを使用して、簡単に分析できますが、パラフィン切片後も細胞レベルで詳細な式を評価できます。

(図 1および図 2) 全体のマウス胚における基板として X gal を使用して β-ガラクトシダーゼの組織化学的反応の標準的なプロトコルを適用した結果を示す.このプロトコルを使用して、我々 は胚発達段階 (E9.5、E11.5、E12.5) を別に膜型マトリックスメタロプロテアーゼ 4 (Mt4 mmp) 式を調べて、内因性の制御の下で LacZ レポーターを表す Mt4 mmp 遺伝子変異マウスを使用してMt4 mmp プロモーター (図 3図 4、および図 5)9,15。Mt4 mmp は、glycophosphatidyl イノシトール アンカー (GP...

ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片および counterstaining の方法について述べる。これはティッシュ セクションにも適用することができます開発における遺伝子の発現を監視する簡単かつ迅速な手続を器官または培養細胞。

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

この方法は、胚発生中の遺伝子発現パターンの研究など、発生生物学分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、高感度で、簡単かつ迅速に実行でき、サンプルのパラフィン切片化後、マウント組織全体の染色またはより高い分解能で染色を直接視覚化できることです。この手順を実演するのは、マリア・ホセ・ブランコ博士、アナベル・リアルテ博士、エマ・ムニョス博士、ミゲル・マルチェナ博士です。まず、ガラクトシダーゼを発現するグルタルアルデヒド固定トランスジェニック胚を、新たに調製したX-galリンスバッファーで室温で10分間インキュベートします。野生型の同腹仔胚を酵素反応のネガティブコントロールとして使用します。次に、リンスバッファーをpH 8-9のX-gal染色溶液と交換し、光から保護し、37°Cで2時間から一晩インキュベートします

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。...

マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ

このビデオは、マウス胚のレチノイン酸活性を評価するための技術を示しています。マウス胚から細胞を単離すると、細胞はレチノイン酸(RA)レポーター細胞と共培養されます。胚性細胞はRAを産生し、レポーター細胞にβ-ガラクトシダーゼの発現を誘導し、胚性細胞におけるRA活性を示しています。...

レポーター細胞を共培養に用いたマウス胚細胞によるレチノイン酸産生の研究

ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

二元的な遺伝的戦略を利用して、Creを介した組換え後に相補的な経シナプストレーサーを発現するマウスの神経回路トレースのための詳細なプロトコルを提供します。細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされているため、私たちの実験的アプローチは、マウス胚の脳発生中の神経回路の形成と成熟を単一細胞分解能で研究するのに適しています。...

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。...

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

ここでは、受精卵母細胞の囲卵腔のレンチウイルスベクターの単純な注射によって transgene の統合および創設者トランスジェニック マウスに高効率の生産を促進するためにプロトコルを提案する.

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

マウスの受精卵および初期胚は透明帯、遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。この資料では、ヘッジホッグ レンチウイルスベクターを持つ胚細胞、トランスジェニック...

マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。...

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

我々は、初期胚発生における単一細胞における受精ゲノム活性化中の新生転写を可視化する方法を記述します。...

初期胚の単一細胞における接合ゲノム活性化の可視化

学ぶ β-ガラクトシダーゼ活性検出法でマウス胚における遺伝子発現パターンを可視化する手法です。パラフィン切片や全胚マウントに適用でき、発生生物学研究で広く利用可能です。

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

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