呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

このqPCR法の全体的な目的は、馬の生物学的サンプルにおける馬ヘルペスウイルス-2（equine herpesvirus-2）のウイルス量を評価することです。本手法は、馬の呼吸器疾患の診断分野における重要な疑問への回答や、獣医師向けの新しく解釈可能な補助手段となる定量的なデータの提供に役立ちます。この手法の主な利点は、感度が高く、特異的であり、迅速な方法であることです。

もう一つの利点は、国際標準化委員会のフランス代表であるAFNOR norme NF U47-600に従って開発されていることです。本手順のデモンストレーションは、私のユニットの若手研究者であるErika Hueが行います。呼吸器液の生物学的試料から核酸を抽出するために、ドラフトチャンバー内で、140 µLの生物学的試料を560 µLの溶解液に加え、室温で10分間インキュベートします。

サンプルに560 µLのエタノールを加え、全溶液のうち630 µLをシリカカラムに適用して遠心分離します。残りの630 µLをシリカカラムに適用し、再度遠心分離します。サンプルをカラムに適用した後、洗浄バッファーAW1およびAW2をそれぞれ500 µLずつ使用して、カラムを2回洗浄します。

次に、カラムから核酸を溶出させるため、室温の溶出バッファーまたはAVEバッファーを50 µL加えます。キャップを閉め、室温で1分間インキュベートします。その後、6,000 gsで1分間遠心分離します。

DNAを増幅させるため、テキストのプロトコルに従ってプライマーとプローブをタイトレーションした後、PCRマスターミックス 12.5 µL、20 µMのフォワードおよびリバースプライマー、10 µMのプローブを加え、22.5 µLになるまで超純水を適量添加して、各反応用に22.5 µLの反応液を調製します。コンタミネーションを避けるため、PCR反応液の調製は必ず専用のエリアで行ってください。96ウェルプレートの各反応ウェルに、適切な反応液を22.5 µLずつ分注します。

抽出およびPCRのネガティブコントロールを含め、試薬に不要なDNAが混入していないことを確認します。次に、サンプル、抽出ネガティブコントロール、PCRネガティブコントロール、またはポジティブコントロールサンプルのいずれかを2.5 µL、対応する反応ウェルに加えます。その後、粘着プレートシールを使用してプレートを密閉します。

次に、6,000 gsで10秒間遠心分離します。プレートをリアルタイムPCRシステムにセットしてください。その後、ここに示すアッセイレイアウトのテンプレートとPCRプログラム設定を選択し、ランを開始します。

リアルタイムPCRシステムからスプレッドシートに生データを転送した後、各サンプルの閾値サイクル（Ct値）を算出するため、増幅プロットにおいてベースラインより高く、かつ指数増殖領域内に閾値を設定します。各標準点セットを標準曲線としてプロットし、線形性を確認します。その後、この標準曲線に基づいて各サンプルのコピー数を算出します。

qRT-PCR結果の検出限界を決定するため、6本のチューブに超純水 90 µL ずつ分注します。減衰領域を標的としたプラスミドの10倍段階希釈液を6段階調製するため、まずプラスミド調製希釈液 10 µL を、超純水 90 µL が入ったチューブに転移させます。その後、チューブを短時間ボルテックスし、遠心分離します。

次に、チューブから10 µLを次の水が入ったチューブに移します。ボルテックス処理と遠心分離を行った後、すべての水チューブにプラスミドが行き渡るまで、この移送操作を繰り返します。本ビデオの前半で説明した通り、6段階の10倍希釈系列でDNAを増幅させた後、プラスミドの陽性信号が出た最後の希釈段階と、検出されなかった最初の希釈段階である、減少ゾーン（abatement zone）を決定します。

6段階の2倍連続希釈を調製するために、6本のチューブに超純水を25 µLずつ分注します。10倍希釈において陽性シグナルを示したプラズミドの最終希釈液から、25 µLを1本目の水が入ったチューブに移します。ボルテックスおよび遠心分離を行った後、先ほど示した方法で残りの5段階の希釈調製を行います。

本ビデオの前半で説明した手順に従い、2倍段階希釈したDNAを増幅させます。3回の独立した試験でDNAを増幅させた後、各プラズミド濃度レベルにおいて、24個のレプリケートのうち陽性となったレプリケートの数を算出します。24個のレプリケート中23個が陽性と判定されたレベルを、信頼度95%の検出限界（LOD 95% PCR）として決定します。

本法のLOD（検出限界）を決定するために、陽性シグナルが得られた10倍希釈の最終濃度より4倍濃いプラスミド調製希釈液25 µLを起点として、2倍連続希釈を5段階で調製します。増幅工程に使用するプラスミドは、コンタミネーションを避けるため、専用の区域で調製したプラスミド調製希釈液から採取します。これは極めて重要な工程です。

プラスミドの各希釈液から5 µLを、135 µLの陰性リソース材料が入った4本のチューブにそれぞれ移し、5つの陽性標準物質につき4つのレプリケートを作成します。これら5つの陽性標準物質の4レプリケートについて抽出を行い、本ビデオの前述の手順に従って増幅操作を実施します。プラスミド濃度レベルごとに、8つのレプリケートのうち陽性となったレプリケートの数を数えます。

最後に、8回中8回の複製サンプルが陽性となる最後のレベルであるLOD（検出限界）を決定します。このビデオで説明した定量RT-PCR法では、呼吸器液中の馬ヘルペスウイルス2を検出し、定量します。本実験では、10倍段階希釈を行い、10⁻⁹と10⁻¹⁰の希釈倍率の間にある減少域（abatement zone）を推定しました。

LOD PCR値は、低濃度領域において新たに2倍段階希釈を行うことで決定しました。直線性の範囲およびLOQ PCRを決定するため、LOD PCR値である2.6から、サンプル2.5 µLあたり260,000コピーまでの間で、10倍段階希釈を6段階にわたって行い、その範囲を開始点としました。LOQ PCRは、直線性の範囲内における最低濃度となります。

全手法の特性評価とは、呼吸器検体からのDNA抽出から、標的の増幅および定量に至るまで、qRT-PCRデータを得るために必要なすべてのステップのバリデーションを指します。qRT-PCRの全分析手法の定量性能は評価およびバリデーションされ、その精度プロファイルがこのグラフに示されています。呼吸器疾患を有する馬から採取した172例の鼻腔スワブ検体におけるEHV2ウイルスゲノム量は、ここに示す通り定量されました。

若い馬においてウイルスゲノム量はより高く、最大で1.9 × 10¹¹ copies/mLが検出されました。この手法を習得すれば、1回の増幅ステップあたり2時間以内に完了し、適切に実施すれば全バリデーションステップを4週間以内に完了することが可能です。本手順を行う際は、特にプラスミド溶液を扱う際に汚染のリスクを避けることが重要です。

この手順に続き、ゲノム同定などの追加の疑問を解決するために、シーケンシングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、DNAの抽出と増幅の方法、およびそのPCR産物の特性評価について十分に理解できたはずです。病原体などの生物学的試料の取り扱いは非常に危険を伴う可能性があることに注意してください。

本手順を実施する際は、フード内での作業や適切なセキュリティレベルの区域での操作など、常に必要な予防措置を講じてください。