Name: 呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ 馬の呼吸器疾患診断におけるEHV-2定量PCR法の開発と検証。核酸抽出からリアルタイムPCRによるウイルス量評価まで、AFNOR規格に準拠した信頼性の高い検査プロトコルを解説します。

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著者は、技術サポートを提供してくれたSophie CastagnetとNadia Doubli-Bounouaに感謝します。この作業は、カルヴァドス総評議会からの財政支援と、バス・ノルマンディー地域とフランス政府の合意(CPER 2007-2013; project R25 p3)を受けました。著者は、AFNORグループの専門家、特にJean-Philippe Buffereau氏とEric Dubois氏に感謝します。

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
<li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EPA-815-B-04-001.+Quality+Assurance%2FQuality+Control+Guidance+for+Laboratories+Performing+PCR+Analyses+on+Environmental+Samples%22">EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples</a>. , (2004).</li>
<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-1.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+1%3A+Requirements+and+recommandations+for+the+implementation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
<li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children%27s+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232(2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

2000年代以来、リアルタイムPCRは、研究室の数の増加に金の標準的な技術（細胞培養および細菌培養法）に代わるされています。技術の実装は比較的容易です。しかし、実験室方法の検証は、正確で再現性と信頼性の高いデータを確実にするために、病原体の分​​子検出および定量化のために不可欠です。 抽出工程は、生物学的材料の損失の主要な源であるので、あるプロトコルから別の定量化の誤差の主な原因と考えられてもよいです。このように、主に文献に報告された定量RT-PCR中のDNAプラスミドの標準曲線の作成は、ウイルスゲノムの負荷を示しているが、抽出工程を考慮していません。 AFNORノルムNF U47-600-2全体メソッドの検証プロセスのためのデノボ戦略の説明は、この分野における重要な進歩を表しています。に示すようにEHV-2ウマのため、この論文では、または蜂21で他の人が、これは現像工程および方法全体のPCRの特性評価および特性評価と検証ステップの間に明確な区別が必要となります。この興味深いアプローチで1つの制限は、プロトコルの変化は非常にコストがかかる可能性があり、完全なプ​​ロセスを再検証する義務をもたらすことがあります。この制限はまた、定量化の範囲は、ウイルス（ 例えば、呼吸器流体、器官、血液又は尿）が抽出されたソースに依存するという事実によって強調されました。実際には、各マトリックスは、それらの物理化学的特性が異なる特異性を提示し、独立して定量RT-PCRによるウイルスの検出および定量のために使用される各異なる行列を定義することが重要です。従って、各生物学的試料のウイルスゲノムの負荷が抽出からより正確に定量することができます。特徴付けはまた、サーマルサイクラーのmodを考慮に入れますエルと以前よく特徴付けられた方法（ 例えば、本論文で述べたEHV-2定量PCR法）の使用は、親の実験室や他の研究室でのマシンの新しいタイプを必要とするとき、人はその楽器の性能を確認する必要があります。定量PCRアッセイの性能の確認はすべてのテストが実験室に持ち込むための前提条件です。これは通常、既知の特性を有する参照試料を分析することによって達成されます。このようなチェックが前提条件と定量PCR（LOD、LOQ効率）の性能と全体の方法（LOD、LOQ）の堅牢性を検証するために、NF 47-600-1 AFNORノルムによって要求されるように必須と考えられています。開発と特徴付けステップの間だけでなく、研究または診断目的のために使用される場合、リスク要因は、プロトコルの標準化を確実にするために、同定され、十分に制御することができます。特に懸念されるのに十分なスタッフのトレーニング、優秀な人材、消耗品の品質管理です使用されており、そのストレージ、即時の環境条件およびアッセイに関わる科学機器の性能に影響を与える可能性が計量条件の意識のコントロール。試験所間比較のための参照サンプルの使用は、不確実性を制御するのに役立つ可能性があります。このようにして、研究室間でのデータの比較を容易にすることができます。実際、研究室間の実力テストが評価し、方法の再現性を確認するために必須です。 分析生体マトリックスの国際単位（IU）で表されているウイルスゲノムの負荷の結果は、（IUは：流体またはコピーのコピー/ ml組織について/ g）は、異なる研究室間の結果を比較するために使用するのが容易です。 LOQ上記の全ての結果は、非定量化陽性の結果としたコピー/ mlとLODとLOQの間の結果として発現されます。このように、ゲノムの量化データを提示することはプロセスへとより正確に準拠します分析（ゲノムの増幅）のS。実際には、細胞培養実験において、TCID 50によるウイルス量の式（50％組織培養感染用量） 細胞やウイルス株の性質に依存します。各菌株のラインは、その独特の感染動態を有し、最初の細胞変性効果が明らかである前に、EHV-2のようないくつかのウイルスは数日かかることがあります。 結論として、定量RT-PCRの特性のこの新しい方法は、研究所間のデータの提示および解釈の調和を促進すべきです。これは、疾患の状態の宣言の代わりに、単に病原体の有無についてのカットオフ値の確立など、将来の定量RT-PCRの潜在的な新しいアプリケーションのために非常に有用であろう。

ウマヘルペスウイルス2型（EHV-2）は、このような鼻汁、咽頭炎やリンパ節の腫れ1-3のような潜在的な臨床症状で、呼吸器症候群に関与しています。このウイルスはまた、馬産業の2のための重要なと負の経済的影響をもたらす可能性がある、馬の貧弱なパフォーマンスとの関連が疑われています。 今までは、ガンマ - EHVのゴールドスタンダード（γ-EHV）の検出は、細胞培養方法でした。この手順の最初の不便さは、EHV-2およびその他のγ-EHVの（ 例えば、EHV-5）との間に差別が存在しないことでした。第二の不便は4,5をマニフェストに12〜28日からかかる細胞変性プロセスの遅い開発でした。 検証および正規化された定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の開発（QRT-PCR）は、この方法は、迅速にEHV-2とEHV-区別するために、ウイルスを検出するために役立ちます5およびウイルスゲノムの負荷と定量化の側面に病気のおかげとの関係を研究します。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）マリス6によって1986年に初めて記載され、生物学的診断（人間、環境と獣医学）の分野のほとんどに新しいゴールドスタンダードになろうとしているれました。特異性、感度、迅速性：病原体のゲノムの一部の増幅に基づいている。この方法は、多くの利点を提供します。また、アンプリコン混入のリスクを定量RT-PCRの出現及び品質保証7が後退しました。それにもかかわらず、新たなゴールドスタンダード法としてPCRの認識がちょうど改善されたパフォーマンスデータだけでなく、時間をかけて性能の劣化なしに全体の方法の開発と検証段階の制御の実証以上を必要としました。 EHV-2の検出のために使用される最初の分子ツールは、時間Cでしたonsumingおよびシーケンシング8に続いて、ネストされたPCRに関わる非特異的な増幅。ヘルペスウイルスの標的遺伝子は、デオキシリボ核酸（DNA）ポリメラーゼとDNAパッケージ9でした。ただし、ネストされたPCRアンプリコンによる汚染の高いリスクを提示します。それ以来、従来のPCR試験は、最近になって、リアルタイムPCRの特性はEHV-2 10の定量のために記載した。2009年に概説インターロイキン10様遺伝子または糖タンパク質B遺伝子を増幅するために設計されたが、データは利用できなかったされてい抽出プロセスを含む全方法の検証について。 このプロトコルでは、開発と検証の手順は協会フランセーズデ正規化 （AFNOR）によると、馬の呼吸器流体中のEHV-2 DNAの検出および定量化のための定量的PCR法に記載されている標準NF U47-600 3,11,12、フランス代表ではあります国際標準化委員会。この規範は、NF EN ISO / CEI 17025、2005〜13及びOIE（国際獣疫事務局）によると、11,12「動物衛生分析法における獣医学PCRの実施、開発と検証のための要件と推奨事項」詳細勧告、2010年14 EHV-2のqRT-PCR検証プロトコルは、3部構成の手順が含まれます。定量RT-PCRアッセイの（a）の開発、（b）は、単独で定量RT-PCRアッセイの特徴付けおよび全体の（c）の特性評価（PCR分析の生体試料からの核酸の抽出から）分析方法。 検出（LOD）の限界と定量限界（LOQ）：定量RT-PCRアッセイの全体分析方法の特徴は、二つの限界の定義が含まれています。 LOD 95％PCRは、すべてのCAの95％で検出することができ、単位体積当たりの核酸コピーの最小数を表しますエス。 LOQ 95％PCRを考慮に不確実性を取ることを決定することができる核酸コピーの最小量を表します。 この定量RT-PCR法は、呼吸流体中の正確な検出およびEHV-2の迅速な定量化を可能にします。さらに、この方法は、他の新たな定量RT-PCRアッセイの開発のための標準化された手順とのような一般的なテンプレートを確実にするために、他の研究室に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>AB-1900 ナチュラルカラー ABgene 96 ウェルプレート&nbsp;</td><td>ダット</td><td>シャー16924</td><td></td></tr><tr><td>粘着フィルムqPCRアブソリュート&nbsp;</td><td>ダットシャー</td><td>16629</td><td>qRT-PCR実行前にプレートをシールするために使用される接着フィルム</td></tr><tr><td>0.5 mlマイクロチューブ、スカート付き、キャップ</td><td>ダットシャー</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td><td>ユーロフィン</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>プローブ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド</td><td>ユーロフィン</td><td>カスタム</td>オーダーQIAamp<td></td></tr><tr><td>&nbsp;RNA ウイルス Mini Kit (QIAamp Mini カラム、AVL&nbsp; バッファー、&nbsp;AW1バッファ、AW2バッファ、AVEバッファ、コレクションチューブ)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVLバッファー:72°Cで5分間温めてください。</td></tr><tr><td>サンガー法によるC シーケンシング</td><td>Eurofins</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA緩衝液</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度計</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCRシステム</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td>プレ<td>ウォーム15分&nbsp;</td></tr></tbody></table>

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的pcr法の開発と検証

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

このプロトコルは、NF U47-600の基準に従って、馬の呼吸液中のEHV-2の検出と定量のための定量的RT-PCR法を説明しています。開発および最初の検証ステップの後、AFNORの基準に従って、(a)qRT-PCRアッセイのみの特性評価と(b)分析法全体の特性評価という2つの異なる特性評価ステップを実施しました。分析法全体のバリデーションには、核酸の抽出から最終的なPCR分析までのすべてのステップの描写が含まれていました。
ウイルスゲノム負荷を正確に決定するためには、qRT-PCRによるウイルス検出のために、メソッド全体の検証が非常に重要です。抽出ステップは生物学的物質の損失の主な原因であるため、あるプロトコルと別のプロトコルとの間の定量誤差の主な原因と見なされる場合があります。このため、AFNOR規格NF-U-47-600では、抽出ステップの前にプラスミド希釈の範囲を含めることを推奨しています。さらに、定量の限界は、ウイルスが抽出されるソースによって異なります。国際単位(IU)で表されるウイルスゲノムロードの結果は、異なる研究室間で結果を比較するために使いやすくなっています。
この新しいqRT-PCRの特性評価方法は、データ提示とラボ間の解釈の調和を促進するはずです。

定量的RT-PCR法は、上述したように、呼吸流体中ウマヘルペスウイルス2を検出し、定量化するために実施された。 図1は、AFNOR標準NFに従 ​​って定量的RT-PCR法の開発および検証するための模式的なワークフロー図を示しますU47-600。プライマーおよびプローブの特異性は、PCRのステップバイステップの開発中に検証されました。唯一のEHV-2株は、このシステムで増幅しました。続いて、定量RT-PCRの性能を特徴づけなければなりませんでした。 まず、6 10倍連続希釈を削減ゾーン（ 図2）を確立するために実施したLOD PCRを推定します。この例では、6 10倍連続希釈物をLOD PCRを推定する（26,000及び0.26コピー/ 2.5μlのサンプルとの間の）10 -5と10 -10との間で行われました。除害ゾーンリットル（2.6および0.26コピー/ 2.5μlのサンプル間）10 -9〜10 -10の希釈液との間に居住。この場合のLOD PCR値を決定するために、プラスミドの6 2倍連続希釈を、この削減ゾーンで5.2および0.16コピー/ 2.5μlのサンプルの間で行われました。 LOD PCR値は2.6コピー/ 2.5μlのサンプルでした。 直線性の範囲とLOQ PCRを決定するために、LOD PCR値は2.6（LOD PCR）26万コピー/ 2.5μlのサンプルとの間の6 10倍連続希釈物の範囲を、開始するために使用された。 図3は EHV2のための線形回帰を示しています1試験の定量RT-PCR。線形回帰（ 図4）の性能は、 表3に記載された計算を用いて、四重に検証されている。計算は、基準に従って直線範囲を定義するために実行される絶対的なバイアスIをヴァルUE≤0.25ログ10、プラスミド負荷のどのようなレベルの私 。この場合、直線性の範囲は、2.6 26万コピー/ 2.5μlの試料の間に横たわっていました。 LOQ PCRは、直線性範囲（ すなわち 、2.6コピー/この場合、2.5μlのサンプル）中の最低濃度です。 U LINの範囲で2.6-260,000コピー/ DNA2.5μlの0.12ログ10であると決定しました。 定量RT-PCR（ 図1、黄色）の開発（ 図1、青）および特徴付けの後、AFNOR NF U47-600ノルムは、定量RT-PCR（ 図1、オレンジ）のDNA抽出からの全分析法の特徴付けをお勧めします。 表4に記載されるように、診断の感度および特異性を計算した。定量RT-PCR全分析法の定量的な性能は、精度プロファイル（で評価し、検証されました<stronグラム&gt;図5）。 最先端の分子技術を使用しています。このプロトコルは、私たちが呼吸器疾患および/または感染の臨床的疑いで馬から得られた172鼻スワブ試料でEHV-2ウイルスゲノムの負荷を検出し、定量化することができました。フィールドからEHV-2の発生率（生物学）のサンプルは、この集団では（172分の86）は、50％でした。定量分析は、EHV-2のウイルスゲノムの負荷は若い馬で有意に高かったとウイルスゲノムの負荷の配分は、年齢（ 図6）とともに減少することを示しました。本研究では、最高のEHV-2ウイルスゲノムの負荷は（1.9×10 11コピー/ mlの）仔馬（ 図6）で検出されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> 図1：開発のためのワークフローのチャート（青）、定量的RT-PCRのキャラクタリゼーション（黄色）とAFNORノルムNF U47-600-2に従ってDNA抽出からのqRT-PCR（オレンジ）の全分析法の特性評価。ワークフローのチャートは、定量的RTの特性評価、開発のための異なるステップを再開-PCRおよび定量RT-PCRにDNA抽出からの全分析法の特性評価。各ステップでは、ワークフローのチャートは、必要な実行、実行される希釈液と必要なアナリストの数の数を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> 図2：プラスミドの6 10倍連続希釈液を用いて得られたリアルタイムPCR曲線の代表的な結果を軽減ゾーンの決意 。除害ゾーンを推定するために、6 10倍連続希釈は、10 -5（26,000コピー/ 2.5μlのサンプル）と10 -10（0.26コピー/ 2.5μlのサンプル）との間で行われています。除害ゾーンは10 -9（2.6コピー/ 2.5μlのサンプル）の希釈液と10 -10（0.26コピー/ 2.5μlのサンプル）の間にあります。この場合、プラスミドの6 2倍連続希釈液を5.2と0.16コピー/ 2.5μlのサンプルとの間で、LOD 95％PCRを決定するために、この削減ゾーンで行われました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> 図3：EHV2定量RT-PCRのための線形回帰定量試験の直線性は、特定の範囲内に存在する標的の濃度に比例する結果を生成する能力です。これによってモデル化することができます。線形回帰（Y = AX + b）の楽器応答（サイクル閾値またはCT）とターゲットの量の対数（ターゲットコピー/ 2.5μlのサンプルの数）の間。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> 図4：EHV-2定量PCRの線形回帰のパフォーマンス平均バイアスは、（測定されたプラスミドの量との間の平均差を表します<img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ）および各プラスミドのレベルの理論的なプラスミド量（X &#39;I）。縦棒は、式によって与えられた直線の不確実性（U LINI）を表します <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> SD&#39;iは、標準偏差、Oであり<html> F測定されたプラスミドの量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> 図5：EHV-2定量RT-PCR法の検証結果に基づいて、精度プロファイル緑線（丸）（系統誤差、又はバイアス）のデータの正確さを表しています。受容性の限界は、実験室（破線）で±0.75ログ10で定義されています。下限と上限の精度限界は信頼性データの標準偏差の2倍（赤線）の平均±バイアスから各プラスミドの負荷レベルについて決定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;&gt; <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> 図6：年齢に応じEHV-2のウイルスゲノムの負荷の定量化は、鼻腔スワブ試料で検出されたEHV-2のウイルスゲノムの負荷分布が異なる年齢層のために表されています。水平線は、標準偏差（M =ヶ月）内の中央値を表します。 *ニューマン-クールズ事後検定（p &lt;0.05）とのANOVAによって有意に異なる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 標的遺伝子 </td><td colspan="3"> プライマー、プローブおよびplasmide配列（5&#39;-3 &#39;） </td><td> ヌクレオチド位置 </td><td> 製品サイズ（ヌクレオチド） </td><td colspan="2"><stronグラム&gt;サーマルサイクリング条件</td><td> リファレンス </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2のgB （HQ247755.1） </td><td colspan="3">フォワード：GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95℃で5分間</td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3">リバース：CCCCCAAAGGGATTYTTGAAを</td><td> 2189-2170 </td><td> 95°C 15秒</td><td rowspan="2"> 45サイクル</td></tr><tr><td colspan="3">プローブ：FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60℃で1分</td></tr><tr><td colspan="3">プラスミド： ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1：プライマー、プローブおよびこのプロトコルで使用される正の合成DNAコントロールの配列プラスミド（正の合成DNA）の配列は、EHV2gBシーケンス（HQ247755.1）の位置2081から2381のヌクレオチドに相当します。このプロトコルで使用されるプライマーおよびプローブの設計は、特定のソフトウェアを用いて得ました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 病原体 </td><td rowspan="2"> リファレンス（原点） </td><td rowspan="2"> 菌株数 </td><td> 結果 </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701（ATCC） </td><td rowスパン= &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2">ポジティブ</td></tr><tr><td> 20サンプル（FDLコレクション） </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05（GERC） </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2">負</td></tr><tr><td> 20サンプル（FDLコレクション） </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352（ATCC） </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2">負</td></tr><tr><td> T934 WSV（GERC） </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td>ケンタッキー株ケンタッキーA（ATCC） </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2">負</td></tr><tr><td> 2サンプル（FDLコレクション） </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230（ATCC） </td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> 愚かなヘルペスウイルスAHV5 </td><td> FDLコレクション</td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td rowspan="2"> 馬のインフルエンザウイルス</td><td> A /ウマ/ Jouars / 4/2006（H3N8） </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2">負</td></tr><tr><td> （アクセッション番号JX091752） </td></tr><tr><td> ウマ動脈炎ウイルス </td><td> VR796（ATCC） </td><td> 2 </td><td>負</td></tr><tr><td> ロドコッカス・エクイ </td><td> FDLコレクション</td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> ストレプトコッカス・エクイ亜種。ズーエピデミカス </td><td> FDLコレクション</td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> ストレプトコッカス・エクイ亜種。エクイ </td><td> FDLコレクション</td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> Q熱リケッチア </td><td> ADI-142から100（Adiagene） </td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> クラミジア流産 </td><td> ADI-211から50（Adiagene） </td><td> 1 </td><td>負</td></tr><tr><td> クレブシエラPNEUmoniae </td><td> FDLコレクション</td><td> 1 </td><td>負</td></tr></tbody></table> 表2：EHV-2のためのqRT-PCRの分析特異性。 <img alt="表3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> 表3：（NF U47-600-2 12 から適応 ） バイアスと直線性不確かさの計算 。各試験について、線形回帰（Y = AX + B）の性能は、yが得られるサイクル閾値であるテーブルを使用して検証され、傾斜が得られる; xは 、プラスミドレベルで、bは切片である私はプラスミドです。レベル（iは 1からk個のレベルに変化する）; kは 、プラスミドのレベルの数が使用されている（トンで例えば 、K = 6彼のテーブル）; jは （jは I試験1〜異なります）試用版では、 私は、この表の例：I = 4）（3と6の試験の間に含まれる、試行回数をx iは 、それぞれの推定プラスミド量です。 私はレベルをプラスミド。X I = iがレベルをプラスミドそれぞれについて、（X I）10を記録し 「 私は、xの式で得られた理論的なプラスミドの量です」。各Jトライアル期間中、サイクル閾値は、各iについて得られ プラスミドレベルは、線形回帰を用いて計算されます Y I、J = j個の X I、J + B jを 。 <img alt="表3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" />トライアルjの間に測定されたプラスミドの量である。 バイアスI </<html>サブ&gt;測定されたプラスミドの量及び各試験のための理論的なプラスミドの量および各プラスミドのレベルの間で観察された差です。 <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" />の平均値であります<img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" />各によって私はレベルをプラスミド; SDは「 私は、測定量の標準偏差であります<img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" />各iについて プラスミドレベル、 平均バイアスは、 バイアス、iの平均である; U LINIは 私が SD&#39;iから計算レベルをプラスミドとバイアスを意味する毎に決定リニアリティの不確かさである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;のfo：キープで-next.within-ページ=&quot;常に &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2">サンプルの実際の状況</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ポジティブ</td><td>負</td></tr><tr><td rowspan="3">全体の方法を用いて得られた結果</td><td>ポジティブ</td><td> RP（正の実数） </td><td> FP（偽陽性） </td></tr><tr><td>負</td><td> FN（偽陰性） </td><td> RN（実負） </td></tr><tr><td>合計</td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> SE = RP /（RP + FN） </td><td> SP = RN /（RN + FP） </td></tr></tbody></table> 表4：診断感度（SE）の計算 と 全体の方法の 特異性（SP）シュワルツテーブルはconfidを計算するために使用しました。全体の方法の感度および特異度95％でレンス間隔NF U47-600-2に記載の方法。

ここでは、馬の呼吸液中のEHV-2 DNAの検出と定量に使用される定量的PCR法の開発と検証のためのプロトコールを紹介します。EHV-2 qRT-PCRバリデーションプロトコルには、開発、qRT-PCRアッセイのみの特性評価、および分析法全体の特性評価の3つの手順が含まれます。

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

このqPCR法の全体的な目的は、馬の生物学的サンプルにおける馬ヘルペスウイルス-2（equine herpesvirus-2）のウイルス量を評価することです。本手法は、馬の呼吸器疾患の診断分野における重要な疑問への回答や、獣医師向けの新しく解釈可能な補助手段となる定量的なデータの提供に役立ちます。この手法の主な利点は、感度が高く、特異的であり、迅速な方法であることです。もう一つの利点は、国際標準化委員会のフランス代表であるAFNOR norme NF U47-600に従って開発されていることです。本手順のデモンストレーションは、私のユニットの若手研究者であるErika Hueが行います。呼吸器液の生物学的試料から核酸を抽出するために、ドラフトチャンバー内で、140 µLの生物学的試料を560 µLの溶解液に加え、室温で10分間インキュベートします。サンプルに560 µLのエタノールを加え、全溶液のうち630 µLをシリカカラムに適用して遠心分離します。残りの630 µLをシリカカラムに適用し、再度遠心分離します。サンプルをカラムに適用した後、洗浄バッファーAW1およびAW2をそれぞれ500 µLずつ使用して、カラムを2回洗浄します。次に、カラムから核酸を溶出させるため、室温の溶出バッファーまたはAVEバッファーを50 µL加えます。キャップを閉め、室温で1分間インキュベートします。その後、6,000 gsで1分間遠心分離します。DNAを増幅させるため、テキストのプロトコルに従ってプライマーとプローブをタイトレーションした後、PCRマスターミックス 12.5 µL、20 µMのフォワードおよびリバースプライマー、10 µMのプローブを加え、22.5 µLになるまで超純水を適量添加して、各反応用に22.5 µLの反応液を調製します。コンタミネーションを避けるため、PCR反応液の調製は必ず専用のエリアで行ってください。96ウェルプレートの各反応ウェルに、適切な反応液を22.5 µLずつ分注します。抽出およびPCRのネガティブコントロールを含め、試薬に不要なDNAが混入していないことを確認します。次に、サンプル、抽出ネガティブコントロール、PCRネガティブコントロール、またはポジティブコントロールサンプルのいずれかを2.5 µL、対応する反応ウェルに加えます。その後、粘着プレートシールを使用してプレートを密閉します。次に、6,000 gsで10秒間遠心分離します。プレートをリアルタイムPCRシステムにセットしてください。その後、ここに示すアッセイレイアウトのテンプレートとPCRプログラム設定を選択し、ランを開始します。リアルタイムPCRシステムからスプレッドシートに生データを転送した後、各サンプルの閾値サイクル（Ct値）を算出するため、増幅プロットにおいてベースラインより高く、かつ指数増殖領域内に閾値を設定します。各標準点セットを標準曲線としてプロットし、線形性を確認します。その後、この標準曲線に基づいて各サンプルのコピー数を算出します。qRT-PCR結果の検出限界を決定するため、6本のチューブに超純水 90 µL ずつ分注します。減衰領域を標的としたプラスミドの10倍段階希釈液を6段階調製するため、まずプラスミド調製希釈液 10 µL を、超純水 90 µL が入ったチューブに転移させます。その後、チューブを短時間ボルテックスし、遠心分離します。次に、チューブから10 µLを次の水が入ったチューブに移します。ボルテックス処理と遠心分離を行った後、すべての水チューブにプラスミドが行き渡るまで、この移送操作を繰り返します。本ビデオの前半で説明した通り、6段階の10倍希釈系列でDNAを増幅させた後、プラスミドの陽性信号が出た最後の希釈段階と、検出されなかった最初の希釈段階である、減少ゾーン（abatement zone）を決定します。6段階の2倍連続希釈を調製するために、6本のチューブに超純水を25 µLずつ分注します。10倍希釈において陽性シグナルを示したプラズミドの最終希釈液から、25 µLを1本目の水が入ったチューブに移します。ボルテックスおよび遠心分離を行った後、先ほど示した方法で残りの5段階の希釈調製を行います。本ビデオの前半で説明した手順に従い、2倍段階希釈したDNAを増幅させます。3回の独立した試験でDNAを増幅させた後、各プラズミド濃度レベルにおいて、24個のレプリケートのうち陽性となったレプリケートの数を算出します。24個のレプリケート中23個が陽性と判定されたレベルを、信頼度95%の検出限界（LOD 95% PCR）として決定します。本法のLOD（検出限界）を決定するために、陽性シグナルが得られた10倍希釈の最終濃度より4倍濃いプラスミド調製希釈液25 µLを起点として、2倍連続希釈を5段階で調製します。増幅工程に使用するプラスミドは、コンタミネーションを避けるため、専用の区域で調製したプラスミド調製希釈液から採取します。これは極めて重要な工程です。プラスミドの各希釈液から5 µLを、135 µLの陰性リソース材料が入った4本のチューブにそれぞれ移し、5つの陽性標準物質につき4つのレプリケートを作成します。これら5つの陽性標準物質の4レプリケートについて抽出を行い、本ビデオの前述の手順に従って増幅操作を実施します。プラスミド濃度レベルごとに、8つのレプリケートのうち陽性となったレプリケートの数を数えます。最後に、8回中8回の複製サンプルが陽性となる最後のレベルであるLOD（検出限界）を決定します。このビデオで説明した定量RT-PCR法では、呼吸器液中の馬ヘルペスウイルス2を検出し、定量します。本実験では、10倍段階希釈を行い、10⁻⁹と10⁻¹⁰の希釈倍率の間にある減少域（abatement zone）を推定しました。LOD PCR値は、低濃度領域において新たに2倍段階希釈を行うことで決定しました。直線性の範囲およびLOQ PCRを決定するため、LOD PCR値である2.6から、サンプル2.5 µLあたり260,000コピーまでの間で、10倍段階希釈を6段階にわたって行い、その範囲を開始点としました。LOQ PCRは、直線性の範囲内における最低濃度となります。全手法の特性評価とは、呼吸器検体からのDNA抽出から、標的の増幅および定量に至るまで、qRT-PCRデータを得るために必要なすべてのステップのバリデーションを指します。qRT-PCRの全分析手法の定量性能は評価およびバリデーションされ、その精度プロファイルがこのグラフに示されています。呼吸器疾患を有する馬から採取した172例の鼻腔スワブ検体におけるEHV2ウイルスゲノム量は、ここに示す通り定量されました。若い馬においてウイルスゲノム量はより高く、最大で1.9 × 10¹¹ copies/mLが検出されました。この手法を習得すれば、1回の増幅ステップあたり2時間以内に完了し、適切に実施すれば全バリデーションステップを4週間以内に完了することが可能です。本手順を行う際は、特にプラスミド溶液を扱う際に汚染のリスクを避けることが重要です。この手順に続き、ゲノム同定などの追加の疑問を解決するために、シーケンシングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、DNAの抽出と増幅の方法、およびそのPCR産物の特性評価について十分に理解できたはずです。病原体などの生物学的試料の取り扱いは非常に危険を伴う可能性があることに注意してください。本手順を実施する際は、フード内での作業や適切なセキュリティレベルの区域での操作など、常に必要な予防措置を講じてください。

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