結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化シロイヌナズナルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

結晶性セルロースは、植物の細胞壁の重要な構成要素です。しかし、細胞分解能での定量化は技術的に困難です。 本稿では、偏光技術と根断面を用いて、細胞壁組成の情報を時空間分解能で取得する方法について報告する。

この解剖学的断面試料作製の全体的な目標は、細胞分解能で相対的な結晶とセルロースの蓄積を定量化し、一次シロイヌナズナ根の異なる組織間の直接比較を可能にすることです。この方法は、特定の細胞タイプの細胞組成が臓器全体の成長にどのように影響するかなど、植物生理学および発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。テキストプロトコルに従ってシロイヌナズナの種子を滅菌した後、0.8%植物寒天と0.5XM培地を含むプレートに滅菌種子を広げます。

パラフィルムでプレートを包み、アルミホイルで覆います。プレートを摂氏4度で1〜4日間保存して、均一な発芽を促進します。次に、プレートをシロイヌナズナの苗の成長に適した成長チャンバーに移し、プレートを垂直に向け、寒天培地の上で根の成長を維持します テキストプロトコルに従ってリチャードソンの溶液を準備します シリンジ駆動の0.22ミクロンPVDフィルターユニットを介してろ過します 使用前に

次に、化学フードの下に、38 mlの0.5Mカコジル酸ナトリウムと2.5 mlのグルタルアルデヒドを組み合わせて、50ミリリットルの固定剤を準備します。次に、100マイクロリットルのリチャードソン溶液を固定溶液に加えて、最終的な固定溶液を生成します。事前にマークされたプレートを使用し、2〜3 mlの最終固定溶液をウェルに入れて、溶液が苗木を完全に覆うようにします。

プラスチック製の鉗子を使用して、最大10本の苗木を各ウェルに慎重に移します。パラフィルムを使用してプレートを密封してから、摂氏4度の暗闇で少なくとも1晩、最大1週間保管してください。固定苗を脱水するには、鉗子を使用して植物を拾い上げ、ここに記載されている時間内にエタノールの濃度が増加する新しいマークされた6つの井戸プレートの井戸に移します。

Historesin Activatorの1袋の内容物を50mlの塩基性樹脂液と混合することにより、小さなガラス瓶に浸透媒体を準備します。.磁石を入れ、攪拌板上で溶液を20分間攪拌します。6ウェルプレートのラベル付きウェルに2〜3 mlの浸潤培地を充填します。

次に、苗が完全に脱水されたら、鉗子を使用して95%エタノール溶液から浸透培地に移し、苗木が培地で完全に覆われていることを確認します。サンプルを摂氏4度で少なくとも4日間保存して、植物組織への浸透を最大限に保ちます。ブロックを準備するには、サンプル名が印のついた小さなラベルを鉛筆で貼り付けます。

浸透媒体15mlに硬化剤1mlを加えて包埋培地を調製します。約200マイクロリットルの埋め込み媒体を使用して、金型内の各ウェルの半分を充填します。そして、オーバーヘッドフィルムを使用して、両側に1mlの追加で型を覆います。

型を室温で少なくとも2時間インキュベートして、部分重合を可能にします。次に、埋め込み媒体の追加バッチを準備し、根の先端が金型に配置されている間、重合を避けるためにナイスに保ちます。小皿に埋め込み培地を加え、培地に苗を1本入れます。

解剖スコープの下で、メスを使用して各根の先端を切断し、それを金型の周囲から約2〜3 mm離して、転写セクションの場合は垂直に、縦方向のセクションの場合は水平に、非常に慎重に金型に配置します。ティッシュを配置した後、埋め込み媒体を使用して型を完全に満たし、オーバーヘッドフィルムで覆います。その後、室温で最低2時間インキュベートします:ブロックを乾燥させるには、乾燥シリカゲルを入れたデシケーターに入れ、室温で一晩放置します。

ダイヤモンドスコアリングツールを装備したナイフメーカーを使用して、ガラスの棒からガラスのナイフを準備し、ガラスの道を正方形に切り、次に正方形を斜めに切断して2つのナイフを作成します。両方のナイフの刃が鋭利であることを確認します。ブロックをホルダーに取り付けます。

次に、シングルエッジの工業用ブレードを使用して、ルートチップから最大1mmの余分なブロック材料を取り除き、ピラミッド型にします。成形されたブロックを2〜3ミクロン幅のスライスに切断し、スライスをマークされたスライドガラスに移します。次に、スライスに水滴を追加します。

分析データのばらつきを最小限に抑えるために、幅が均一なセクションを準備することが重要です。水が蒸発するまで、弱火に設定されたヒートブロックにスライドガラスを置きます。偏光顕微鏡で見るスライドを準備するには、リチャードソンの溶液を元の溶液の2%に希釈し、スライスを覆うために約1mlを使用します。

次に、サンプルをヒートブロックに5秒間置き、蒸留水を使用して洗浄します。ホットプレート上のスライドを乾燥させた後、解剖顕微鏡でスライスを観察し、マーカーを使用してスライドの裏側にマークを付けて、目的のスライスの位置を示します。カバースリップで覆う前に、100マイクロリットルの封入剤を追加します。

テキストプロトコルに従って画像化および分析します。ここに示されているのは、シロイヌナズナの一次根の断面と、その構成細胞と非有毛細胞、有毛細胞、皮質を含む組織の放射状組織です。この共焦点画像は、隣接する細胞の一方向増殖と根全体の成長を阻害するBRI1変異体バックグラウンドの非有毛細胞におけるBRI1-GFP発現を示しています。

ここで見られるように、野生型および非有毛細胞のBRI1を発現する系統から得られた根の縦断面は、セルロースミクロフィブリルの同様の配向を示し、遷移帯の細胞と比較して、分裂細胞に存在する角度の大きな変動性を示しました。これにより、2つの遺伝的背景の対応する分裂細胞と伸長細胞におけるセルロース中の結晶の相対的蓄積の比較が可能になり、非有毛細胞におけるBRI1発現とセルロース中の結晶の高い局所的蓄積との間の相関関係が明らかになります。一般に、この方法に新しく触れたビデオでは、埋め込み手順中に向きの良い根を得るのが難しいため、苦労します。

したがって、いくつかのブロックをセクショニング用に準備する必要があります。一度マスターすれば、1つのブロックセクションを2〜3時間で完了させることができます。この手順を試みる際には、セルロース中の結晶の蓄積は、縦断面によって決定されるように、セルロースミクロフィブリルの同様の配向を持つ細胞間で同等であることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、シロイヌナズナの苗を固定する方法、それらをブロックに埋め込む方法、および縦方向と横方向の根の断面を準備する方法についてよく理解しているはずです。また、偏光顕微鏡を使用して取得できるデータについても、十分な洞察を得る必要があります。