ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法シロイヌナズナ

この手順の全体的な目標は、シロイヌナズナVuesをホールマウントハイブリダイゼーションと免疫染色のために調製することです。これは、最初に生花のつぼみを固定液に固定することによって達成されます。2番目のステップは、顕微鏡スライドに直接、ミニチュアアクリルアミドパッドにvueを慎重に解剖し、埋め込むことです。

次に、組織処理により、組織の清澄化と浸透が可能になります。最後のステップは、処理したサンプルを免疫染色用の抗体溶液または蛍光in C 2ハイブリダイゼーション用の標識プローブとインキュベートすることです。最終的には、高解像度の共焦点イメージングとそれに続く3次元再構成により、シングルセルレベルでのホールマウントでの定量分析が可能になります。

この方法は、当初、ビュー内のCT組織への洞察を提供するために採用されましたが、それはまた、プランジの他の組織および他のモデル生物の他の細胞コンパートメントを分析するために適用することができました チューブあたり20〜30の手根骨で氷上で冷やした新しく作られたBBO緩衝液で満たされたマイクロフュージチューブに、チューブを室温で30分間穏やかに振るように設定します。次に、チューブを400Gで1分間スピンダウンし、上清を慎重に吸引して廃棄し、手根骨にPBTを1ミリリットル加えます。手根骨の各チューブを取り付けるために、チューブを氷の上に置きます。

氷の上で準備しました。200マイクロリットルが入った5本のチューブ。作りたての5%アクリルアミドミックス。

ペンシルでラベル付けされた5つのきれいなスーパーフロストスライド、手根骨の1本のチューブから20%a PSの思考Eloquaと20%NAPSの思考Eloqua。先端が切り取られた4つまたは5つを取り、それぞれを1つのスライドに置きます。細い針を使って慎重にピペッティングして余分な液体を取り除きます。

手根骨に縦方向の切り込みを入れ、手根骨の壁を取り除き、ビューの列を解放します。このステップには練習が必要です。ビューが乾燥するのを防ぐには、最大10マイクロリットルのPBSを加え、次にアクリルアミドミックスを含むマイクロフージチューブに追加します。

12マイクロリットルのNAPSと12マイクロリットルのPSをすばやく追加します。ピペッティングで溶液をよく混合し、この活性化アクリルアミドを30マイクロリットルすばやく加えます。解剖したビューのあるスライドに混ぜます。調製物に小さなカバースリップをそっと置き、溶液を室温で約1時間重合させます。

後でこの方法で各スライドを準備します。かみそりの刃を使用して、カバースリップを削り取ります。サンプルは、PBSの入ったコプランジャーに摂氏4度で一晩保存することも、直接処理を進めることもできます。

一般に、処理は80ミリリットルの溶液を含むコプランジャーで行う必要があります。そして、ヒュームフードの下。まず、メタノールエタノール、1対1のエタノールキシレン溶液、そして再びエタノール、次にメタノールの溶液シリーズでのインキュベーションを通じて組織を清澄化します。

各お風呂は5分または30分です。テキストプロトコルを参照してください。次に、2.5%ホルムアルデヒドを含む1対1のメタノールPBT溶液を15分間使用します。

次に、ティッシュをPBTで1回、10分間浴します。この後、スライドは必要に応じて摂氏4度で一晩保管できます。次に、瓶から最大6枚のスライドを取り出し、余分な液体を排出します。

それらをティッシュペーパーの上に置き、冷やした細胞壁消化酵素100マイクロリットルをすばやく加えます。パッドに混ぜます。次に、スライドを大きなカバースリップで覆います。

湿ったチャンバー内でスライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。新しい酵素溶液ごとにCO消化温度を最適化することが重要です。なぜなら、このステップは後で均質な染色を行うために重要であるからです。スライドをPBTで2回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。

次に、スライドを各スライドに排出します。1%tweenで完成したPBS中のRNA A100マイクロリットルを添加し、インキュベーション後に湿ったチャンバーでスライドを摂氏37度で1時間インキュベートし、スライドを前と同様にPBTで2回洗浄し、次にスライドを新たに作成したPBTFの浴中で20分間インキュベートすることにより組織を再度固定します。PBTFをPBTで1回洗い、10分間洗い流します。

次に、スライドをPBSで2%tweenで摂氏4度で2時間インキュベートすることにより、組織浸透に進みます。PBTで5分ごとに2回洗浄して、透過性溶液を除去します。その後、免疫染色に進みます。

まず、目的の一次抗体でスライドをインキュベートします。PBSで希釈した抗体の100マイクロリットルのアリコートを、0.2%の間隔で各スライドに適用します。スライドを湿ったチャンバーに移し、摂氏4度で12〜24時間インキュベートします。

スライドをPBTの浴槽で2〜4時間、室温で穏やかに揺らしながら洗浄します。次に、PBSで1〜200に希釈した二次抗体100μLを20μL0.2%で加え、スライドを4°Cで24時間インキュベートします。PBTで1時間入浴し、穏やかに揺さぶるだけで、未結合の二次抗体のスライドを洗浄するのに十分です。

次に、PBS中のヨウ化プロピジウム1ミリリットルあたり10マイクログラムの溶液でDNAを対比染色します。染色を15分間続けてから、室温で15分間穏やかに揺さぶってスライドをPBTで洗浄します。次に、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヨウ化プロピジウムを補充した退色防止媒体でスライドを取り付けます。

1時間セットした後、63倍グリセロール浸漬レンズを使用して共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。そのため、画像取得時には、サンプル間でスキャン設定を同一に保ち、比較定量を可能にし、線形検出モードを使用することが重要です。その後、シリアル画像を3次元構造に再構築し、対象の各核をセグメント化し、3D画像処理ソフトウェアを使用して信号を定量化します。

この堅牢な大規模調製プロトコルを使用すると、Mount Vues全体がその3次元構造を保持します。細胞内構造は、クロマチンで見られるように高精細に見えるようになります。DNAを染色すると、ヘテロクロマチンはデコンボリューションを適用することなく、明るく明確な病巣として現れます。

このプロトコルでは、1ラウンドで複数の抗体を用いた並行免疫染色が可能です。例えば、クロマチンダイナミクスを解析するための異なる複製スライドでの1回の実験で、Uクロマチン関連許容マーカーであるH 3 trimmメチル化リジン4、およびヘテロクロマチン関連マーカーH 3モノメチルリジン27が検出されました。別の互換性のある技術は、蛍光C 2ハイブリダイゼーションまたは魚を45 s.Ribosomalにすることです。

DNAリピートは、核組織領域を定義するために使用されました。プローブはAlexa 4 88で直接標識し、DNAは対比染色されました ification分析のためには、さまざまな体の希釈とインキュベーション時間をテストして、可能な限り低く堅牢でhogeneシグナルを与える条件を特定することが非常に重要です。そして、体の悔恨。

この方法は、クロマチン組織の単一細胞解析のための組織の優れた保存と最適な浸透を達成するため、植物細胞生物学または植物エピエピジェネティクスの分野の科学者が、単一細胞レベルおよび全人類の状況で核組織または細胞内組織を調査する道を開きます。