Name: ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法シロイヌナズナ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ シロイヌナズナ胚珠のホールマウント免疫染色とFISHプロトコルによるクロマチン修飾と核構造の単一細胞レベル定量解析法。この手法は高解像度共焦点イメージングで植物細胞生物学研究に有用です。

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技術的および財政的支援について、Ueli Grossniklaus（チューリッヒ大学）に感謝します。Valeria Gagliardini氏、Christof Eichenberger氏、Arturo Bolanos氏、Peter Kopf氏には、ラボの一般的なサポートに感謝しています。この研究は、チューリッヒ大学、スイス国立財団からCB(31003A_130722)とUeli Grossniklaus(31003A_141245および31003AB-126006)への助成金、およびAgence Nationale de la RechercheからDG(Programme ANR-BLANC-2012)への助成金を受けました。

手順は、 図1のワークフローに記載されており、組織の切開および埋め込 ​​みのためのセットアップを図2に示す。 1。組織固定<ol><li>氷の上で焼きたてのBVO固定液緩衝液を含むマイクロチューブに、20〜30心皮を集める。 </li><li>穏やかに室温で振とうしながら組織30分を修正します。 </li><li> 400×gで卓上マイクロ遠心1分で固定液に心皮を含むチューブを回転。 </li><li>慎重に固定液緩衝液を除去し、PBTの1ミリリットルを加え、氷上にチューブを置きます。 </li></ol> 2。解剖と埋め込み<ol><li>新たに作製した、5％アクリルアミドミックスのそれぞれ200μlで5エッペンドルフチュー​​ブを準備します。 </li><li> 5スーパーフロストを70％エタノールで前洗浄し、鉛筆で標識摺動調製する。 </li><li> 20％APSと氷上で20％のNaPSをそれぞれの1アリコートを解凍。 </li><li>カットエンドチップで行われ4-5の心皮を取るきれいなスライド上に、液体の過剰を取り除く。 </li><li>細い針で縦カットを行い、 図2に示すように胚珠の行を解放する心皮の壁を切り離し、PBS（10μL以下で）で覆うことにより、乾燥を避ける。 </li><li>すぐに、200μlのアクリルアミドミックスのアリコートと12μLのAPSを12μlのNAPを追加し、混合する。 </li><li>解剖した胚珠に活性化したアクリルアミドの30を添加する。 </li><li> 20×20ミリメートルのカバーガラスで覆い、室温、45〜60分で重合してみましょう。 </li><li>カミソリの刃を使用してカバーガラスを取り外します。この段階で、サンプルはPBSを含むコプリンジャー中で4℃で一晩維持することができる。 </li></ol> 3。組織処理注：3.2.1、3.2.3、3.3.2および3.4​​.3を除くすべてのステップは室温での化学ボンネットの下に80ミリリットル溶液をコプリンジャーに行われている。スライドはフラットチップピンセットで転送されます。 <ol><li>組織の明確化と固定： <ol><li>メタノール中で5分間インキュベートする。 </li><li>エタノールに5分間インキュベート。 </li><li>エタノール中で30分間インキュベートする：キシレン（1:1）。 </li><li>エタノールに5分間インキュベート。 </li><li>メタノール中で5分間インキュベートする。 </li><li> 2.5％ホルムアルデヒドで補完、メタノールおよびPBT（1:1）中で15分間インキュベートする。 </li><li> PBTで2×10分を洗浄します。この段階で、スライドを4℃で一晩保持することができる</li></ol></li><li>細胞壁消化： <ol><li>氷上で細胞壁消化混合物のアリコートを解凍する。 </li><li>コプリンジャーからスライドを取り、ペーパータオルの上に垂直に配置することによって、液体の過剰を排出。 </li><li>アクリルアミドパッド上で細胞壁の消化ミックスを100μlを加え、23 X 46ミリメートルのカバースリップでカバーしています。他のスライドについて、この手順を繰り返します。 （材料に記載されている）湿ったチャンバー内で37℃で2時間インキュベートする。 </li><li> PBTのスライド2×5分を洗ってください。 </li></ol></li><li>治療をRNアーゼ： <ol><li>コプリンジャーからスライドを取り、目のドレイン前のような液体のE過剰。 </li><li>湿ったチャンバー内で37℃で1時間、1％のTween-20を含むPBS中の100μg/ mlでのRNaseA100μlで各スライドをインキュベートします。 </li><li> PBTで2×5分間スライドを洗浄します。 </li></ol></li><li>ポスト固定および透過： <ol><li>新たに作成したPBT-Fでの20分間のポスト修正。 </li><li> PBTで10分間スライドを洗浄します。 </li><li> 4℃で2％のTween-20を含むPBS中で2時間透過化</li><li> PBTで2×5分間スライドを洗浄します。 </li></ol></li></ol> 4。免疫染色注：このステップでは、一次抗体の最適濃度は、抗体の異なる希釈（1:200、1:500、1:1000）を用いて試験されなければならない。 <ol><li> 4℃で12〜24時間、0.2％のTween-20を含むPBSで希釈した一次抗体100μlで各スライドをインキュベート</li><li>穏やかに振とう下、室温で2〜4時間、PBTでスライドを洗浄します。 </li><li>適用するPBS +0.2％のTween-20で24時間、4℃で、二次抗体1:200 </li><li>穏やかに振とう下、室温で1時間、PBTでスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間、PBS中10μg/ mlのヨウ化と対比染色後、室温で、穏やかに振盪下にPBS中で15分をすすぐ。 </li><li>退色防止液体封入内のマウントは、10μg/ mlのヨウ化を補った。封入剤は、CLSMで画像を取得する前に、1時間硬化させてみましょう。 </li></ol> 5。定量的イメージング<ol><li>画像収集： <ol><li>理想的には、より良好な長期のイメージング23を超える蛍光シグナルの保存、および63Xグリセロール浸レンズを可能にする共振型走査モードを使用して、CLSMを用いた高解像度の画像を取得する。 </li><li>厳密に従うことを通して、標準的な取得手順を定義するためにこのような実験の開始時レーザー強度、利得、ピンホール、ボクセルサイズとズーム倍率として取得パラメータをテスト一貫性の定量的測定のためのすべてのスライド。 </li><li>蛍光色素間のクロストークが存在しないことを確認してください。存在する場合、シーケンシャルスキャンを設定します。同時に、別々に透過画像を取得していない。 </li><li> xとyの次元で可能な限り高い分解能でかつZ次元（ナイキストの法則）での2倍のオーバーサンプリングをシリアル、3次元画像取得を実行します。 </li></ol></li><li>画像処理： <ol><li>商用またはオープンソースのソフトウェアを使用して3次元的に連続画像を再構成する。 </li><li> 3Dへの関心のそれぞれの核（またはセル）の周囲に輪郭面を定義します。 </li><li>各オブジェクト内の画素強度の和として、各チャンネルで蛍光を定量する。 </li><li>統計分析のためにデータをExcelにエクスポートします。 例えば、DNA染色信号に対する抗体シグナルを正規化する。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

顕花植物では、女性の生殖細胞系列は、このように技術的に困難なホールマウントで細胞学的染色をレンダリング、珠心や胚珠外皮を含むいくつかの細胞層に囲まれています。ここでは、このような全体マウントでのin situハイブリダイゼーション 、免疫染色、DNA染色および蛍光として細胞学的染色に適し胚珠多数の製造および加工を可能に効率的なプロトコルを提示する。我々が正常にシロイヌナズナ 21,22における女性の生殖生殖細胞の分析のためにそれを使用していました。複数のスライドは、異なる染色のために並列に処理することができるように、この方法は非常に効率的である。また、堅牢でかつ均一な信号分布を与え、再現性のある定量分析が可能になります。このようなクロマチン構造の変性を伴うフォイルゲン染色などの古典的な方法とは対照的に、我々のプロトコルは、クロマチン組織と核エピトープを保持します。アプリケーションの追加ition、組織の明確化は、単一細胞レベルでの高解像度の信号を撮像可能にする。 花ではなくBVOバッファー（1.1）の4％パ...

顕花植物では、生殖系統の確立は、SMCの分化、女性MMCおよび男性の胞子母細胞から始まります。 MMCは胚珠原基の遠位先端のサブ表皮珠心細胞から発達し、小胞子母細胞は、深い花器官1の内部に配置されている葯房に胞子形成組織から開発しています。平滑筋細胞は、その後、有糸分裂の際に配偶体を生じる一倍体胞子を生成する減数分裂を受ける。雌性配偶体、または胚嚢は、1卵細胞、1中央のセル、2助細胞と3 antipodalsで構成されています。雄性配偶体または花粉は一つの栄養細胞二つ精子細胞から構成されている。雄性配偶体は、比較的アクセス可能なオブジェクト·オブ·研究したまま雌性配偶体が胚珠内に埋め込まれ、それ自体が花の心皮で囲まれ​​、したがって、分子·細胞学的分析に固有の課題を提起する。しかし、近年、レーザ支援マイクロダイセクションは、トランスクリプトームは、MMCと女性の配偶体細胞2-4で分析することができ、エレガントなソリューションを提供しました。候補遺伝子の発現に加えてin situハイブリダイゼーションまたはレポーター遺伝子アッセイにおいて、例えば RNAを用いて、分析において、細胞学的分析は、特定の直接的な細胞染色または間接的な免疫染色を用いて内因性の細胞成分の動態を調査することができる。特に、一緒にクロマチンの修正やクロマチンの構成要素の免疫染色で、魚やDNAの染色を用いて細胞遺伝学的染色は、 シロイヌナズナ 5クロマチン動態と核組織を解明するための中心的なアプローチである。一般的に、減数分裂がよく、植物の雄減数母細胞6,7で検討されている特定の染色体動態を伴う。おそらく動的なエピジェネティックなリプログラミングを反映し、さらに大規模、細胞特異的なクロマチン再編成は、花粉の発達8月10日の間に記載されている。これとは対照的に、原因女性の減数分裂細胞と配偶体の相対的な到達不能に、これらの調査は、適用が技術的に困難で残っており、多くの場合（下記参照）切片または手動切開および酵素消化を必要とする。また、全体のマウントで光学的透明度の欠如は、優勢無傷胚珠の生殖細胞の高分解能撮像の障害となる。 ホールマウント胚珠における染色体組織の細胞学的分析のための古典的な方法は、フォイルゲン染色の11から13を使用しています。これは、タンパク質の変性をもたらすので、クロマチン構造の破壊を引き起こすDNAの（次亜塩素酸を用いて）酸加水分解を含む。代わりに、女性の減数母細胞と配偶体細胞における染色体組織が ​​（例えば14〜18を参照）は、半薄切片または解剖し、胚嚢とMMCにDAPI染色および免疫染色を用いて観察することができます。明らかに、しかし、手動の解剖と分割は、労働集約的であることができ、クロマチンエピトープの多数の定性的および定量的分析に妨げる。 ここでは、全体のマウントの下流細胞学的染色に適した種々のシロイヌナズナ胚珠を多数準備するために効率的なプロトコルを提供する。簡単に説明すると、花芽が固定液中でインキュベートされる、胚珠の行は心皮から解剖され、花粉減数母細胞19,20のために行ったように、スライドにアクリルアミドに包埋した。埋め込まれた胚珠は、さらに細胞壁消化および透過化の前に、メタノール、エタノール、キシレン中でクリアされ、固定されている。これらのステップの可能なバリエーションが議論されている。次いで、試料をDNA染色、免疫染色およびFISHのために使用することができる。準備モードは、効率的で、並列実験設備（最大16のスライドが異なる下流の解析のために一日に製造することができる）が可能になります。記載され治療は、ホールマウントで均質なイネーブル信号を、よく組織学的、細胞の保存生殖細胞および細胞型の間の定性的および定量的な比較に利益をもたらす、周囲の珠心細胞および核の組織。校正され、3次元再構成に続いて、CLSMベースの高分解能イメージング、蛍光シグナルの意味のある定量的な測定を可能にします。我々が正常に差別MMC 21にクロマチン動態を解析するために、この手順を使用し、雌性配偶体22を開発。ここではホールマウント胚珠内のヘテロクロマチン解析、クロマチン免疫染色、GFP免疫染色およびFISHの代表的な結果を提示する。今後も我々のプロトコルは、他の植物組織および種に適していると考えています。

<table><tbody><tr><td>溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO 固定バッファー (ベース32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA、pH 7.5、1% (v/v) ホルムアルデヒド、10% DMSO、1x PBS、0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS、0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT、2.5% (v/v) ホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>30% アクリルアミド:ビスアクリルアミド</td><td></td><td></td><td>アクリルアミド3 g、ビスアクリルアミド0.33 g、PBS1個(10 mlを調製し、4°Cで保存します。C)</td></tr><tr><td>200 ml 5%アクリルアミド混合物、PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30%アクリルアミド:ビスアクリルアミド、166 ml 1x PBS(30%ストックから新鮮に作る)</td></tr><tr><td>20%アンモニウムペルサルフト</td><td></td><td></td><td>0.2 g、1 ml滅菌水(1 mlでアリコートを準備し、-20°Cで保存します。C)</td></tr><tr><td>20%亜硫酸</td><td></td><td></td>ナトリウム<td>0.2 g、1 mlの滅菌水(1 mlでアリコートを準備し、-20°Cで保存します。C)</td></tr><tr><td>細胞壁酵素ミックス</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) セルラーゼ、1% (w/v) ドリセラーゼ、0.5% (w/v) ペクトリアーゼ</td></tr><tr><td>試薬および材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シャルラウ</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ</td><td>シグマ</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>ドリセラーゼ</td><td>シグマ</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>ペクトリアーゼ</td><td>シグマ</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>メルク</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td></td><td>Σ A-3553</td><td></td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド</td><td>ΣM2022</td><td>毒性</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Σ</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム</td><td>フルーカ</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>抗トリメチルヒストン H3 (Lys4)</td><td>アップステート</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>アンチモノメチルヒストン H3 (Lys27)</td><td>アップステート</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488~ヤギ ~抗 ~ウサギ (H+L)</td><td>Molecular Probe</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>有毒</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>有毒</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Huber &CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>ハイドル</td>フ <td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>モイストチャンバー</td><td></td><td></td><td>湿ったペーパータオルが入ったプラスチックの箱で、スライドを支え、スライドを水から守るためのプラスチック製のサポートが箱に入れられています。</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラススライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>J1800AMNZ</td><td>メンゼル-GL&auml;ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

植物の開花では、体への生殖細胞の運命遷移は大人の植物の花器官における胞子母細胞（SMC）の仕様でマークされています。女性のSMC（大胞子母細胞、MMC）は胚珠原基に区別し、減数分裂を受ける。選択された一倍体大胞子は、その後一緒にアクセサリー細胞と、配偶子を生じるであろう多雌性配偶体、卵細胞と中央のセルを形成するために、有糸分裂を受ける。胚珠内部MMC、減数分裂細胞と雌性配偶体の限られたアクセス性細胞学的および細胞遺伝学的ための技術的に困難である単一細胞レベルで分析する。特に、携帯電話または核エピトープの直接的または間接的な免疫が植物細胞および単一細胞イメージング内部の試薬の貧弱な浸透によって損なわれては、ホールマウント組織における光学的透明性の欠如によってdemisedされる。 そこで、NUCLを分析する効率的な方法を開発したホールマウント組み込みシロイヌナズナ胚珠内の単一のセルの高解像度で耳の組織とクロマチン修飾。これは、顕微鏡スライド上のアクリルアミドゲルの薄層内の固定胚珠の解剖と埋め込みに基づいています。埋め込まれた胚珠は、免疫染色試薬、組織の透明度および透過性を向上させることを目指した化学的および酵素的処理に供される。これらの治療は、細胞のクロマチン組織、DNAおよびタンパク質のエピトープを保持します。サンプルは、クロマチン免疫染色、in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、およびヘテロクロマチンの解析のためのDNA染色を含む種々の下流の細胞学的分析のために使用することができる。 3D再構成に続いて、高解像度の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングは​​、単細胞の解像度で定量的な測定を可能にする。

我々は全体のマウント中の細胞学的染色に適しシロイヌナズナ胚珠の大規模調製および処理のための堅牢なプロトコルを提供する。埋め込 ​​みのおかげで、胚珠が3次元構造（ 図3）を保持する。さらに、光の明確化など、組織処理は、高解像度で細胞内構造を画像化することができます。 図4は、ヘテロクロマチンが明るく表示され、明確に定義された目立つ巣（何デコンボリューションは、この絵のために使用されなかった）ホールマウント胚珠原基でDNA染色を示している。これらの画像は、MMCと珠心（ 図4）21ヘテロクロマチン含量を分析するために使用した。 加えて、我々は成功して定量的に大胞子母細胞、機能的大胞子、開発、女性配偶体および初期胚21、22〜24で免疫染色によりクロマチン動態を解析するために、このプロトコルを使用していました。 図5の</s&gt; trong、我々はシロイヌナズナ胚珠に免...

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

本手順の目的は、Arabidopsisの雌しべ（Vues）をホールマウントハイブリダイゼーションおよび免疫染色に供するための試料調製を行うことです。まず、新鮮な花芽を固定液で固定します。次に、雌しべを慎重に解剖し、顕微鏡スライドガラス上の小型アクリルアミドパッドに直接包埋します。次の組織処理により、組織の透明化と透過処理が行われます。最終ステップとして、処理したサンプルを免疫染色のための抗体溶液、または蛍光in situハイブリダイゼーションのための標識プローブとともにインキュベートします。最終的に、高解像度共焦点イメージングとそれに続く3次元再構築を行うことで、ホールマウントにおける単一細胞レベルでの定量解析が可能になります。この手法は、当初は視覚におけるCT組織の構成を解明するために採用されましたが、肺などの他の組織や他のモデル生物における他の細胞区画の解析にも適用可能です。氷上で冷却した調製直後のBBO緩衝液を満たしたマイクロチューブに、1本あたり20〜30個の角膜を入れ、室温で30分間緩やかに揺動させます。次に、チューブを400 Gで1分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引して廃棄し、角膜に1 mLのPBTを加えます。各チューブの角膜をマウントするために、チューブを氷上に置きます。氷上で準備してください。200 µLの5%アクリルアミド混合液（調製直後のもの）を入れたチューブを5本用意します。鉛筆でラベルを貼った5枚の清潔なスーパーフロストスライド、20% PSのEloqua溶液、および同一のカルパルスチューブから分注した20% NAPSのEloqua溶液を用意します。カット端チップを用いて4〜5回分を採取し、それぞれのスライド上に滴下します。細いニードルを用いて慎重にピペッティングし、余分な液体を除去します。手根骨に縦方向の切開を加え、手根骨壁を取り除いてvueの列を放出させます。この工程には習熟が必要です。最大10 µLのPBSを加え、その後アクリルアミド混合液が入ったマイクロ遠心チューブに移すことで、vueの乾燥を防いでください。12 µLのNAPSと12 µLのPS.Mixを迅速に加えます。ピペッティングで溶液を十分に混合し、この活性化アクリルアミド30 µLを速やかに加えます。解剖したvuesを載せたスライドグラス上で混合します。準備した試料の上に小さなカバーガラスをそっと置き、室温で約1時間、溶液を重合させます。後ほど、各スライドを同様に準備します。カバースリップはカミソリの刃を用いて取り除いてください。サンプルはPBSを入れたコプランジャーを用いて4 °Cで一晩保存するか、そのまま処理に進みます。通常、処理は80 mLの溶液を入れたコプランジャーを用い、ドラフトチャンバー内で行います。まず、メタノール、エタノール、エタノールとキシレンの1:1混合溶液、再びエタノール、そして最後にメタノールの順に連続的に浸漬し、組織の脱水・脱脂（クリアリング）を行います。各洗浄は5分または30分間行います。テキストプロトコルを参照してください。次に、2.5% formaldehydeを含む1:1のmethanol PBT溶液を用い、15分間処理します。その後、組織をPBTで10分間ずつ2回洗浄します。必要に応じて、スライドは4°Cで一晩保存することが可能です。次に、ジャーから最大6枚のスライドを取り出し、余分な液体を切り捨てます。それらをティッシュペーパーの上に置き、冷却した細胞壁消化酵素を100 µL速やかに加えます。パッド上で混ぜ合わせます。その後、スライドを大きなカバーガラスで覆います。スライドを湿潤チャンバー内にて37 °Cで2時間インキュベートします。後の染色を均一にするためにはこの工程が極めて重要であるため、新しい酵素溶液を使用する際は、常にCO消化温度を最適化することが重要です。その後、PBTで1回5分間、計2回スライドを洗浄します。次に、各スライドの液を捨てます。1% tweenを添加したPBSで調製したRNAse A溶液を100 µL加え、加湿チャンバー内で37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベート後、前述と同様にPBTでスライドを2回洗浄し、その後、新しく調製したPBTF液にスライドを20分間浸して組織を再度固定します。PBTで10分間洗浄し、PBTFを洗い流します。次に、2% Tween含有PBS中で4°Cで2時間インキュベートし、組織透過処理を行います。PBTを用いて5分間の洗浄を2回行い、透過処理液を除去します。その後、免疫染色の工程に進みます。まず、目的の一次抗体でスライドをインキュベートします。PBSで希釈し0.2%のTweenを含む抗体溶液を、各スライドに100 µLずつ滴下します。スライドを湿潤チャンバーに移し、4 °Cで12～24時間インキュベートします。スライドをPBT溶液に浸し、室温で緩やかに揺らしながら2〜4時間洗浄します。次に、0.2%のPBTで1:200に希釈した二次抗体を100 µL加え、4 °Cで24時間インキュベートします。その後、PBT溶液中で緩やかに揺らしながら1時間洗浄することで、未結合の二次抗体を十分に除去できます。次に、PBSで調製した10 µg/mLのプロピジウムヨード溶液を用いてDNAを対比染色します。15分間染色を行い、その後、室温で15分間、緩やかに揺らしながらPBTでスライドを洗浄します。最後に、10 µg/mLのプロピジウムヨードを添加した抗退色剤でスライドを封入します。1時間ほど静置した後、63倍のグリセロール浸漬レンズを用いて共焦点顕微鏡でスライドを撮影します。この際、比較定量を可能にするため、画像取得中のスキャン設定をサンプル間で同一に維持し、リニア検出モードを使用することが極めて重要です。その後、連続画像を3次元構造に再構成し、目的の核をそれぞれセグメンテーションし、3D画像処理ソフトウェアを用いて信号を定量します。この堅牢な大規模作製プロトコルを用いることで、ホールマウント標本の三次元構造を維持することができます。クロマチンに見られるように、細胞内構造が高精細に可視化されます。DNAを染色すると、デコンボリューション処理を行うことなく、ヘテロクロマチンが明るく明瞭な焦点として現れます。このプロトコルでは、1回の染色で複数の抗体を用いて並行的に免疫染色を行うことができます。例えば、クロマチンに関連する許容マーカーであるH3K4me3（H three trimm methylated lysine four）と、ヘテロクロマチンに関連するマーカーであるH3K27me1（H three monomethyl lysine 27）を、クロマチンダイナミクスを解析するために、別々の複製スライド上の1つの実験で同時に検出しました。また、適合性のある別の手法として、45S rRNAに対する蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）が挙げられます。核組織領域を定義するために、DNAリピートが使用されました。プローブはAlexa 488で直接標識し、DNAを対比染色しました。同定分析においては、最小限の抗体濃度で、堅牢かつ均一なシグナルが得られる条件を特定するために、異なる抗体希釈倍率およびインキュベーション時間を検討することが非常に重要です。本法は、組織の優れた保存性と、クロマチン構造のシングルセル解析に最適な透過性を実現するため、植物細胞生物学や植物エピジェネティクス分野の研究者が、単一細胞レベルおよび個体全体のコンテキストで核または細胞内構造を調査するための道を切り拓くものです。

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

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