Name: レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ エンハンサー同定と実験的検証の統合的手法。ChIP-seqデータに基づく候補選択とレポーターアッセイによる活性測定を用い、胚性幹細胞分化における遺伝子制御を解明する。様々な細胞モデル系に適応可能なワークフローです。

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著者は、原稿についての議論とコメントに対して、Dr. Bence Daniel、Matt Peloquin、Dr. Endre Barta、Dr. Balint L Balint、およびNagy研究室のメンバーに感謝したいと思います。L.Nは、ハンガリー科学研究基金(OTKA K100196およびK111941)からの助成金によって支援され、欧州社会基金、欧州地域開発基金、およびハンガリー脳研究プログラム(助成金番号)によって共同出資されています。KTIA_13_NAP-A-I/9.

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<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

近年、シーケンシング技術の進歩により、多くの細胞型や組織におけるエンハンサーの大規模な予測が可能になりました 7-9。上記のワークフローにより、ChIP-seqデータに基づいて選択された候補エンハンサーの一次特性評価を実行できます。詳細な手順と注意事項は、ラボで定期的なエンハンサー検証を設定するのに役立ちます。
ルシフェラーゼレポーターアッセイの最も重要なステップは、トランスフェクション効率です。すべての実験でトランスフェクション効率を推定するために、GFPコンストラクトを含めることをお勧めします。新鮮で良質のプラスミドを持つことは非常に重要であり、トランスフェクションを大幅に改善することができます。提示されたプロトコルは、任意のセルラーモデルシステムに適合させることができます。組織特異的エンハンサーの特性評価には、適切な細胞型を使用することを強くお勧めします。したがって、ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、実験用に選択された細胞が効率的にトランスフェクション可能である必要があります。あるいは、目的の転写因子が(過剰)発現している場合には、簡単にトランスフェ...

発達中の組織全体で数千の遺伝子の発現を正確に制御する必要があります。遺伝子発現の調節は、主にエンハンサーによって達成されます。エンハンサーは、転写因子(TF)と結合し、離れた場所から標的遺伝子の転写を活性化するために作用する短いノンコーディングDNA要素です1。エンハンサーは一般にシス作用性であり、転写開始部位(TSS)のすぐ上流に最も頻繁に見られますが、最近の研究では、エンハンサーが遺伝子の3'上、またはイントロンとエクソン2内でも、はるかに上流で見つかった例も記載されています。
脊椎動物のゲノムには何十万もの潜在的なエンハンサーがあります1.クロマチン免疫沈降法(ChIP)に基づく最近の方法は、エンハンサー分析3-9に使用できる全ゲノムのハイスループットデータを提供します。ChIP-seq実験で得られたデータは、細胞や組織特異的なエンハンサーを同定する可能性を大幅に高めますが、検出された結合部位が必ずしも直接的なDNA結合や機能エンハンサーを特定するわけではないことに留意することが重要です。したがって、新たに同定されたエンハンサーのさらなる機能解析が不可欠です。この研究では、推定上の活性エンハンサーの同定と検証の基本的な3ステップのプロセスを紹介します。これには、1)ChIP-seqデータのバイオインフォマティクス解析による転写因子結合部位の推定選択、2)レポーターコンストラクトにおけるこれらの調節配列のクローニングと検証、3)エンハンサーRNA(eRNA)の測定が含まれます。
胚性幹細胞(ES)のレチノイン酸(RA)への曝露は、多能性細胞の神経分化を促進するために頻繁に使用されます10。RAは、RARα、β、γ)やレチノイドX受容体(RXRα、β、γ)に結合することでその効果を発揮します。RARおよびRXRは、ヘテロ二量体の形で、RA応答要素と呼ばれるDNAモチーフに結合し、通常はAGGTCA配列の直接反復(ハーフサイトと呼ばれる)として配置され、転写を調節します。リガンド処理実験により、ES細胞11,12におけるいくつかのレチノイン酸調節遺伝子の同定が可能になった。しかし、これらの遺伝子の多くのエンハンサー要素はまだ記載されていません。ここで説明するワークフローをエンハンサーの同定とバリデーションにどのように使用できるかを示すために、胚性幹細胞における2つのレチノイン酸依存性エンハンサーの選択と特性評価を段階的に示します。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td>gDNA</td><td></td></tr> <tr><td>DNeasy Blood &ティッシュキット&nbsp;</td><td>ゲノムDNA分離用</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>PCR製品精製</td>用<td>Qiagen</td><td>28106</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット&nbsp;</td><td>より多くのPCR産物がある場合のゲル抽出用の</td><td>Qiagen</td><td>28706</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td> DNA T4 DNAリガーゼNEB M0202からの<td>5'-および3'-リン酸基の放出</td></tr> ライ<tr><td></td><td></td><td></td><td>ゲーション</td></tr><tr><td>QIAprepプラス</td><td>ミド単離用</td>スピンミニプレップキット<td>Qiagen</td><td>27106</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES培地</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES培地</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td></td><td>Sigma M7145</td><td>ES培地</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES培地</td></tr><tr><td>β メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ESメディア</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td>トランス<td>フェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg;I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>for transfection</td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligand, for activation of RAR/RXR</td></tr><tr><td>96-well clear plate</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>96-well white plate</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>s Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>ルシフェラーゼアッセイ</td></tr><tr><td>ATP 塩</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>ルシフェラーゼアッセイ</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>ルシフェラーゼアッセイ</td></tr>用 <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>ルシフェラーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>ベータガラクトシダーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226;H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>ベータガラクトシダーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226;7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>ベータガラクトシ</td></tr><tr>ダーゼアッセイ<td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>ベータガラクトシダーゼアッセイ</td></tr><tr><td>ONPG (o-ニトロフェニル-&β;-D-ガラクトシダーゼ)</td><td>Σ</td><td>N1127-1G</td><td>ベータガラクトシダーゼアッセイ</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>eRNAの逆転写</td></tr><tr><td>Rnaseフリー</td><td>Dnase Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade;リアルタイムPCR解析システム</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCRマシン</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td></td>発光<td>カウンター</td></tr></tbody></table>

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

胚発生は、多くの遺伝子の活性化と抑制を含む多段階プロセスです。ゲノム中のエンハンサーエレメントは、組織及び細胞分化の間の遺伝子発現の細胞型特異的調節に寄与することが知られています。したがって、それらの同定およびさらなる調査は、細胞の運命を決定する方法を理解するために重要です。遺伝子発現データ（ 例えば、マイクロアレイまたはRNA-seqの）およびクロマチン免疫沈降（ChIPの）ベースのゲノムワイドな研究（チップ配列）の結果の統合は、これらの調節領域の大規模な同定を可能にします。しかしながら、細胞型特異的エンハンサーの機能的検証は、in vitroおよびin vivo実験手順でさらに必要とします。ここでは、アクティブなエンハンサーを同定し、実験的に検証できる方法について説明します。このプロトコルは、ステップバイステップのワークフローを提供します：1）のChIP-seqのデータ解析による調節領域の同定、2）クローニングおよびEXPERimentalレポーターアッセイで同定されたゲノム配列の推定調節の可能性の検証、およびエンハンサーRNA転写物のレベルを測定することにより、in vivoでのエンハンサー活性の3）決意。提示されたプロトコルは、ラボでは、このワークフローを設定するために誰を助けるために十分に詳述されています。重要なことに、このプロトコルは容易に適応し、任意の細胞モデル系において使用することができます。

我々はゲノムワイドRA調節遺伝子は、その近接して受容体濃縮を持っている識別するために、汎特異的RXR抗体を使用します。レチノイン酸で処理されたES細胞から得られたRXRチップ、配列データのバイオインフォマティクス解析は、RXR部位を占領下で核内受容体半部位（AGGTCA）（ 図1）の濃縮が明らかになりました。バイオインフォマティクスのアルゴリズムを用いて、我々はRXRのChIP-seqのデータ（ 図2）に半分サイトのモチーフ検索結果をバックマッピングされました。この分析は、正確に標準的な核内受容体結合部位と重複したものをChIPのピークを識別するために私たちを助けてくれました。 IGVにおけるこれらの部 ​​位の視覚化はHOXA1、以前に特徴付けRAR / RXRターゲット（ 図2及び図3）に近接して、これらの転写因子の濃縮を示しました。我々はまた、新規RA標的遺伝子、すなわちPRMT8 27を同定しました...

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

このビデオの全体的な目的は、エンハンサーと呼ばれるゲノム制御領域を同定し、実験的に検証するための一連の統合的な手法を提供することです。この手法は、細胞分化の利用や外部刺激への応答など、エンハンサーの選択と利用を含む、生物学的イベントの転写および調節における重要な疑問を解決するのに役立ちます。提示されたワークフローの主な利点は、プロトコルを容易に適応させ、あらゆる細胞モデルシステムで使用できることです。手順のステップを実演します。まず、既存のChIP-seq解析に基づいて、候補となるエンハンサーを選択します。ゲノムブラウザを使用して目的のChIP-seq実験の結果を確認し、標的遺伝子の近傍にある結合部位を特定します。「Define a Region of Interest」を選択して、選択したゲノム領域の200-400 base pairの配列を取得し、その配列を以降のプライマー設計に使用します。標準的な分子生物学的手法を用いて、選択したゲノム領域を増幅し、レポータープラスミド構築物にクローニングします。エンハンサー活性を試験するため、まず48ウェルプレートの各ウェルに0.1%ゼラチン溶液を200 µLずつ添加し、レポーター構築物をマウス胚性幹細胞にトランスフェクションします。播種前にプレートを30分間インキュベートします。トランスフェクションの前日に、フィーダーフリー胚性幹細胞（ES細胞）を、ES培地250 µLを用いて、1ウェルあたり3×10⁴ cellsの密度で播種します。トランスフェクション当日に、各ミックスから8ウェル分となる十分な量のプラスミドミックスを調製します。各プラスミド混合液に、トランスフェクション品質の低血清培地を加えて、全量を106 µLにします。次に、4.5 µLのES品質トランスフェクション試薬を加え、ピペッティングで15回慎重に上下に混ぜ合わせます。このトランスフェクション混合液を室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルにトランスフェクションミックスを13 µL添加し、ピペッティングにより十分に混合します。その後、地衣類による処理を行うまで、細胞をオーバーナイトでインキュベーターに戻します。トランスフェクション効率は重要なステップです。別の細胞種を使用する場合は、このステップの最適化が必要です。コンテキスト依存的な影響を最小限に抑えるため、エンハンサー活性の試験に最も適切な細胞種を使用してください。翌日、吸引によって培地を慎重に除去し、1 µM の全トランスレチノ酸を含む新鮮な培地、または溶媒としての DMSO を各ウェルに 250 µL ずつ添加します。細胞を24～48時間インキュベートします。テキストプロトコルに従って溶解バッファーを調製した後、細胞から培地を慎重に吸引します。1X PBSを使用して細

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。...

マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ

レチノイン酸を用いて幹細胞を神経前駆細胞に分化誘導する方法と、吊り下げ培養法を実演しています。...

レチノイン酸を用いた胚様体細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオは、マウス胚のレチノイン酸活性を評価するための技術を示しています。マウス胚から細胞を単離すると、細胞はレチノイン酸(RA)レポーター細胞と共培養されます。胚性細胞はRAを産生し、レポーター細胞にβ-ガラクトシダーゼの発現を誘導し、胚性細胞におけるRA活性を示しています。...

レポーター細胞を共培養に用いたマウス胚細胞によるレチノイン酸産生の研究

レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。...

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。...

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

少量の組織中のレチノイン酸(RA)レベルを正確に測定する方法は存在しません。このプロトコールでは、RAレポーター細胞株を使用して、E8.5胚およびニューロスフェアにおける相対的なRAレベルの容易で定量的な測定について説明します。...

F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。...

浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

学ぶ エンハンサー同定と実験的検証の統合的手法。ChIP-seqデータに基づく候補選択とレポーターアッセイによる活性測定を用い、胚性幹細胞分化における遺伝子制御を解明する。様々な細胞モデル系に適応可能なワークフローです。

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

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