レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

このビデオの全体的な目標は、エンハンサーと呼ばれるジェノミクス制御要素を特定し、実験的に検証するための統合された一連の方法を提供することです。この方法は、エンハンサーの選択と使用、細胞分化の使用、外部刺激への応答など、生物学的イベントの転写と制御における重要な質問に答えるのに役立ちます。提示されたワークフローの主な利点は、プロトコルを任意の細胞モデルシステムに容易に適合させ、使用できることです。

手順の手順を実演します。まず、既存のチップ シーケンス解析に基づいて候補エンハンサーを選択します。ゲノムブラウザを使用して、目的のチップシーク実験の結果を表示し、目的の遺伝子の近接にある結合部位を特定します。

「Define a Region of Interest」を選択して、選択したゲノム領域の 200-400 塩基対配列を取得し、その配列を後続のプライマー設計に使用します。標準的な分子生物学的手法を用いて、選択したゲノム領域を増幅し、レポータープラスミドコンストラクトにクローニングします。エンハンサー活性をテストするには、まずウェルあたり200マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液を48ウェルプレートに添加することにより、レポーターコンストラクトを大量の胚性幹細胞にトランスフェクトします。

プレートを30分間インキュベートしてから、めっきします。トランスフェクションの前日に、フィーダーフリー胚性幹細胞またはES細胞を、1ウェルあたり10の3倍から4番目の細胞の密度で250μリットルのES培地にプレートします。トランスフェクションの日に、プラスミドミックスを調製し、各ミックスから8つのウェルに十分な量を作ります。

トランスフェクション品質の還元血清培地を各プラスミドミックスに添加すると、容量が最大106マイクロリットルになります。その後、4.5μLのES品質トランスフェクション試薬を加え、ピペッティングで15回上下に慎重に撹拌します。トランスフェクションミックスを室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、トランスフェクションミックスのウェルあたり13 μリットルを細胞に加え、ピペッティングで十分に混合します。次に、苔癬治療の前に細胞をインキュベーターに一晩戻します。トランスフェクションの効率は重要なステップです。

別のセルタイプを使用する場合、この手順には最適化が必要です。最も関連性の高い細胞タイプを使用してエンハンサー活性をテストし、状況依存の影響を最小限に抑えます。翌日、吸引によって培地を慎重に除去し、1マイクロモルのすべてのトランスレチノイン酸を含むウェルあたり250マイクロリットルの新鮮な培地、またはDMSOをビヒクルとして追加します。

細胞を24〜48時間インキュベートします。テキストプロトコルに従って溶解バッファーを調製した後、細胞から培地を慎重に吸引します。1X PBSを使用して細胞を一度上昇させ、ウェルごとに200 μリットルの1X Lysis Bufferを添加します。

細胞を室温で2時間振とうします。次に、完全な細胞溶解のために、プレート内の細胞溶解物を摂氏80度で凍結します。ライセートを完全に解凍した後、電子マルチチャンネルピペットを使用して、ベータガラクトシダーゼ用の細胞ライセート80マイクロリットルを96ウェルクリアプレートに移し、ルシフェラーゼ測定用のライセート40マイクロリットルをホワイトプレートに移します。

ベータガラクトシダーゼを実行するには、1ミリリットルのベータガロン基質緩衝液と4ミリグラムのOMPGを混合します。次に、混合物に3.5マイクロリットルのベータメルカプトエタノールを加え、すぐに80マイクロリットルの細胞溶解物に100マイクロリットルの緩衝液を加えます。かすかな黄色が発達するまで、摂氏37度で反応をインキュベートします。

プレートリーダーで420ナノメートルの吸光度を読み取り、データをエクスポートします。ルシフェラーゼアッセイを行うには、テキストプロトコルに従って基質試薬を調製した後、開始する前にルシフェラーゼ基質試薬を室温まで温めます。次に、40マイクロリットルの細胞溶解物を含む白色プレートの各ウェルに100マイクロリットルをピペットします。

すぐに発光カウンターマシンを使用して信号を測定します。少なくとも3つの独立したトランスフェクションおよび実験から活性を取得します。テキストプロトコルに従って、両方のアッセイの計算を実行します。

RTCPRによるeRNA検出用のプライマーを設計するには、アノテーションされた遺伝子転写産物から少なくとも1.5〜2キロ塩基離れたゲノム領域を選択します。遺伝子の相対的な方向を特定し、センス転写産物とアンチセンス転写産物の位置を決定します。エンハンサーRNA定量用のプライマーを設計するには、転写因子結合部位の中心から領域200-1, 000塩基対を選択します。

遺伝子がマイナス鎖にある場合は、正鎖の200〜300塩基対をコピーし、配列を変換して逆補体配列を取得します。次に、この配列を後続のプライマー設計に使用します。製品サイズ範囲を80〜150ベースペアに設定します。

eRNA転写を測定するには、テキストプロトコルに従って処理した細胞から全RNAを単離した後、標準的な手順を使用してRTCPRによって逆転写されたeRNAを検出します。非処理依存性mRNAの正常化を測定します。このように、レチノイン酸で処理したES細胞から得られたRXRチップのseqデータのバイオインフォマティクス解析により、RXRが占める部位の下に核内受容体ハーフ部位が濃縮されていることが明らかになりました。

バイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して、ハーフサイトのモチーフ検索結果をRXRチップのseqデータにマッピングしました。この分析により、標準的な核内受容体結合部位と重なるチップピークが同定されました。IGVの部位を可視化したところ、Hoxa1に近い転写因子が濃縮されていることが示されました。

以前に特徴付けられた RAR RXR ターゲット。また、新規RA標的鎖であるPRMT8に対する懲罰的エンハンサーも同定されました。同定されたエンハンサー領域をTKルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングし、ES細胞にこれらのコンストラクトをトランスフェクションしました。

ルシフェラーゼ活性は、RAの不在下および存在下で測定されました。RA応答要素(RARE)を含むコンストラクトは、RA治療時にルシフェラーゼシグナル強度の増加を示しましたが、RAREを含まないコンストラクトは誘導されませんでした。Hoxa1 RAR RXR結合エンハンサーのセンスおよびアンチセンスeRNA発現が遺伝子のmRNA発現と相関しているかどうかを確認するために、Hoxa1 eRNAのレベルも測定しました。その結果、エンハンサー活性は短期間のRA治療によって誘発されることが確認されました。

一度習得すると、このワークロードは、記載されたエンハンサートラップ実験とエンハンサーの定量化を実施することにより、数日で行うことができ、エンハンサー活性の強力な機能的証拠を提供することができます。このビデオを見た後、懲罰的エンハンサーを特定し、特徴付ける方法についてよく理解しているはずです。エンハンサーが同定され、検証されると、染色体確認キャプチャー(CCC)などの他の方法を実行して、検証されたエンハンサーによってどの遺伝子が制御されているかなど、追加の重要な質問に答えることができます。