ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

この手法の全体的な目的は、ヒト胚性幹細胞（ES細胞）から分化させた内胚葉細胞を精製することです。本手法は、内胚葉分化に関する幹細胞分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、未分化細胞を除去することで、純粋な内胚葉細胞集団を得られる点にあります。

手順を開始する前に、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルあたり1 mLの基底膜マトリックスでコーティングし、室温で30分以上静置します。次に、ヒトES細胞を回収するため、80〜90%コンフルエントなヒト胚性幹細胞培養液から、滅菌済みのガラス製パスツールピペットを用いて培地を吸引します。

その後、1ウェルあたり2 mLのPBSで細胞を洗浄します。プレートを揺らし、生理食塩水を吸引して、死細胞や残渣を除去します。次に、37 °C、5% CO2の条件下で、1 mLの酵素フリー継代溶液を用いて細胞塊を穏やかに解離させ、細胞がより小さな塊に分断されたことが明確に確認できるまで処理します。

約7分後、ウェルにDMMF12培地を1 mL加えます。そして、1 mLピペットチップを用いて数回ピペッティングし、残っている細胞凝集塊をバラして単一細胞懸濁液にします。同じピペットを使用して細胞を遠心管に移し、ウェルを1 mLの新鮮なDMMF12培地で洗浄し、その洗浄液を遠心管に回収します。

細胞を遠心分離した後、ROCK阻害剤を添加したES細胞培地5 mLでペレットを再懸濁します。細胞数を計測し、アポトーシスを防ぐためにROCK阻害剤を添加した培地を用いて、基底膜マトリックスでコーティングしたプレートに1ウェルあたり1.5〜4 × 10⁵個の細胞を播種します。その後、細胞を約24時間インキュベートします。

次に、滅菌済みのガラス製パストゥールピペットを用いて、各ウェルの培地を2 millilitersの原条誘導培地に入れ替えます。さらに24時間培養した後、培地を内胚葉誘導培地に交換し、毎日培地を更新しながら48時間インキュベートします。培養最終日の、細胞回収の少なくとも1時間前に、新鮮なROCK inhibitorを培養液に添加してください。

次に、滅菌済みのガラス製パストゥールピペットを使用して各ウェルから培地を吸引し、先ほど実演したように酵素フリーの継代用溶液試薬を用いて細胞を解離させます。単一細胞懸濁液が得られたら、細胞数を計測し、遠心分離を行います。ここからのすべての培地およびバッファーには、細胞死を防ぐためにROCK阻害剤が含まれていることを確認してください。

そうしないと、回収後に適切に接着しません。ペレットを、1 × 10⁷個の細胞あたりROCK阻害剤を添加した100 µLのPEBバッファーで再懸濁します。その後、細胞にCXCR4 APC抗体を添加します。

チューブを軽く弾いて混ぜ合わせます。4 °Cで15分間置いた後、1〜2 mLのPEBバッファーで細胞を洗浄し、滅菌済みのガラス製パステールピペットを用いて上清を吸引します。1 × 10⁷個の細胞あたり80 µLのPEBバッファーでペレットを再懸濁し、細胞に20 µLのanti-APCマイクロビーズを加えます。

サンプルを軽く指で弾くようにして混ぜ合わせます。その後、細胞を4 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー1〜2 mLで細胞を洗浄します。

次に、ペレットを500 µLの新鮮なPEBバッファー（インヒビター添加）に再懸濁します。磁気ビーズ分離法でCXCR4+細胞を単離するために、適切なサイズの磁石に中型の磁気カラムをセットし、500 µLのPEBバッファー（ROCKインヒビター添加）でカラムをあらかじめ洗浄します。洗浄液がすべてカラム上部から流れ出た後、磁気ビーズでラベル化した細胞懸濁液の全量をカラムに添加し、通り抜けた液をコニカルチューブに回収します。

ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー500 µLで、カラムを3回洗浄します。次に、磁石からカラムを取り出し、適切な回収チューブに移します。そして、ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー1 mLをカラムに流し込み、CXCR4+細胞を回収します。

オプションとして、すべてのフロースルーサンプルを個別に回収し、各サンプルから20 µLずつ分注して、フローサイトメトリーにより各分注分に含まれるCXCR4+細胞の割合を決定することができます。この手順を最初のフロースルーで繰り返すことで、カラムに結合しなかった細胞を回収できます。その後、分注したすべてのCXCR4+サンプルをまとめ、遠心分離します。

最後に、ROCK阻害剤を添加した内胚葉誘導培地 1 mL でペレットを再懸濁し、基底膜マトリックスでコーティングした細胞培養容器に適切な密度で細胞を播種します。分化前、ヒトES細胞は多能性マーカーである SOX2 を高レベルで発現していますが、決定的な内胚葉マーカーである FOXA2 は検出されません。

分化に伴い、ES細胞は遺伝子およびタンパク質の発現において劇的な変化を起こします。実際に、分化培地で4日間培養した後、かつてのES細胞の多くにおいて、核内にSOX17とFOXA2が均一に共発現しており、これは決定的な内胚葉への分化（definitive endoderm commitment）の指標となります。一部の細胞は分化プロセスに抵抗し、これら2つのマーカータンパク質のいずれも発現しません。

実際に、これらの細胞は多能性マーカーであるSOX2の発現を維持しています。この代表的な実験では、分化3日目に回収したES細胞の約60%がCXCR4を発現しており、磁気ビーズによる多能性細胞およびその他の不要な系統細胞のソーティング後、その純度は85%以上にまで高められました。精製したCXCR4+細胞を播種した後、検出されるSOX2+細胞はわずかであり、播種された細胞の大部分はFOXA2を発現していました。

この手法に習熟すれば、適切に実施することで2時間以内に完了させることができます。本手順に続いて、免疫組織化学染色やQPCRなどの同様の手法を行うことで、分化プロセスに関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。このビデオを視聴することで、磁気ビーズソーティングによる内胚葉細胞の精製方法について十分に理解できるはずです。