ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

この方法の全体的な目標は、ヒト胚性幹細胞またはES細胞から生成された内胚葉細胞を精製することです。この方法は、内胚葉分化に関する幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、未分化細胞の除去後に純粋な内胚葉細胞集団を得ることができることです。

手順を開始する前に、6つのウェル細胞培養プレートをウェルあたり1ミリリットルの基底膜マトリックスでコーティングします。室温で少なくとも30分間。次に、ヒトES細胞を回収するために、滅菌ガラスの牧草地ピペットを用いて、80〜90%コンフルエントなヒト胚性幹細胞培養物から培地を吸引します。

そして、ウェルあたり2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。プレートを振って生理食塩水を吸引し、死んだ細胞や破片を取り除きます。次に、細胞クラスターを1ミリリットルの酵素を含まない継代溶液試薬で、摂氏37度、二酸化炭素5%で穏やかに解離し、細胞が小さなクラスターへの破壊の明確な兆候を示すまで

約7分後、1ミリリットルのDMMF12培地をウェルに加えます。また、1ミリリットルのピペットチップで数回ピペットを上下させ、残りの細胞凝集体を1つの細胞懸濁液に分離します。同じピペットを使用して、細胞を遠心分離チューブに移し、1ミリリットルの新鮮なDMMF12培地でウェルをすすぎ、洗浄液をチューブにプールします。

細胞をスピンダウンした後、ペレットをROCK阻害剤を添加した5ミリリットルのES細胞培養培地に再懸濁します。細胞を数え、アポトーシスを防ぐためにROCK阻害剤を添加した培養培地中の基底膜マトリックスコーティングプレート上のウェルあたり1.5:4倍から5番目の細胞に播種します。細胞を約24時間インキュベートします。

次に、滅菌ガラス製のパスツールピペットを使用して、各ウェルの培地を2ミリリットルの原始線条誘導培地と交換します。さらに24時間の培養後、培地を内胚葉誘導培地と交換し、48時間のインキュベーションを行い、毎日培地を交換します。培養の最終日、および細胞を回収する少なくとも1時間前に、新鮮なROCK阻害剤を培地に加えます。

次に、滅菌済みのガラス製パスツールピペットを使用して、各ウェルから培地を吸引し、先ほど示したように、酵素を含まない継代溶液試薬で細胞を解離します。単一細胞懸濁液が得られたら、細胞をカウントし、遠心分離します。この時点から、細胞の死滅を防ぐために、すべての培地とバッファーにROCK阻害剤が含まれていることを確認してください。

そうしないと、後退後に適切に取り付けられません。ペレットを100マイクロリットルのPEB緩衝液に再懸濁し、1×10ごとにROCK阻害剤を補充して7番目の細胞に添加する。次に、CXCR4 APC抗体を細胞に添加します。

チューブをそっとフリックして混ぜます。摂氏4度で15分後、細胞を1〜2ミリリットルのPEBバッファーで洗浄し、滅菌ガラスパスツールピペットを使用して上清を吸引します。ペレットを第7の細胞に10回あたり80マイクロリットルのPEB緩衝液に再懸濁し、20マイクロリットルの抗APCマイクロビーズを細胞に加える。

サンプルを優しくフリックして混合します。次に、細胞を摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、ROCK阻害剤を添加した1〜2ミリリットルのPEB緩衝液で細胞を洗浄します。

そして、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なPEBバッファーと阻害剤に再懸濁します。磁気ビーズ分離によりCXCR4+細胞を単離するには、中型の磁気カラムを適切なサイズの磁石にロードし、500マイクロリットルのPEBバッファーとROCK阻害剤でカラムを事前にすすぎます。すべての洗浄液がカラムの上部から排出されたら、磁気ビーズで標識された細胞容量全体をカラムに適用し、円錐形のチューブに流れを収集します。

500 マイクロリットルの PEB バッファーと ROCK 阻害剤を 3 回塗布してカラムを洗浄します。次に、磁石からカラムを適切な収集チューブに移します。そして、1ミリリットルのPEBバッファーとROCK阻害剤をカラムに注入して、CXCR4+細胞を回収します。

オプションで、すべてのフロースルーサンプルを別々に収集することができ、各サンプルから20マイクロリットルのアリコートを使用して、フローサイトメトリーによって各アルエット中のCXCR4+細胞の割合を決定することができます。この手順は、カラムに結合しなかった細胞を収集するために、最初のフロースルーで繰り返すことができます。次に、両方のallouted CXCR4 +サンプルをプールし、それらを遠心分離します。

最後に、ROCK阻害剤を添加した1ミリリットルの内胚葉誘導培地にペレットを再懸濁し、基底膜マトリックスコーティング細胞培養容器に適切な密度で細胞を播種します。ヒトES細胞は、分化に先立って多能性マーカーSOX2を高レベルで発現します。一方、決定的な内胚葉マーカーであるFOXA2は検出されません。

ES細胞は分化すると、遺伝子やタンパク質の発現に大きく変化します。実際、分化培地で4日間過ごした後、SOX17とFOXA2は、多くの旧ES細胞の核内で均一に共発現しており、これは内胚葉に対する決定的なコミットメントの特徴です。一部の細胞は分化プロセスに抵抗し、2つのマーカータンパク質のいずれも発現しません。

そして実際、それらの多能性マーカーであるSOX2の発現を保持しています。この代表的な実験では、分化の3日目に、採取したES細胞の約60%がCXCR4を発現し、多能性細胞やその他の望ましくない系統細胞の磁気ビーズ選別後、その純度は85%以上に向上しました。精製したCXCR4+細胞を播種した後、少数のSOX2+細胞のみが検出され、播種した細胞の大部分はFOXA2を発現しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間以内に完了できます。この手順に続いて、免疫組織化学やQPCRなどの他のものを実行して、分化プロセスに関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、磁気ビーズソーティングによる内胚葉細胞の精製方法についてよく理解できるはずです。