Name: ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶヒト胚性幹細胞から内胚葉細胞を精製する方法。CXCR4抗体と磁気ビーズ分離を用いて未分化細胞を除去し、純粋な細胞集団を得ます。この技術は幹細胞研究と再生医療への応用に有用です。

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ジャスミンKresseの巧みな技術支援を深く感謝されています。

胚体内胚葉に向けたヒトESCの1分化<ol><li> 37℃のインキュベーター中でヒト胚性幹細胞（ESC）を育成し、5％CO 2。 </li><li>コー​​ト基底膜マトリックス1mlの新たな6ウェル細胞培養プレート、室温で少なくとも30分間培養ウェアインキュベートします。具体的な詳細については、各メーカーの指示に回してください。 </li><li>培養したヒトESCは、低倍率（ 例えば、4X）を使用して、顕微鏡下で80％-90％の密集度に達していることを確認してください。滅菌ガラスパスツールピペットで培地をオフに吸引することにより空洞から培地を吸引除去します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1回細胞を洗浄します。このために、そっと各ウェルに2mlのPBSを追加し、プレートを振盪し、死細胞及び細胞破片を除去するために溶液を吸います。 </li><li>細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。 37°C ANで細胞をインキュベートD 5％CO 2の細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで。 注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。材料の項で述べた無酵素継代溶液について、インキュベーション時間はおよそ7分です。 </li><li> 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのピペットチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、DMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。 </li><li> G×300で5分間、細胞を遠心。吸引した上清および10μMのRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤を含む5 mLのES細胞培養用培地中で細胞を再懸濁します。 </li><li>血球計数器を用いて顕微鏡下で細胞を計数150,000シード - 使用するES細胞系に応じて、6ウェルあたりまたは他のプレートレイアウト40万細胞。 CULを使用してください37℃のインキュベーター内で細胞を、5％CO 2、アポトーシスや文化を避けるために、10μMのROCK阻害剤を含むトゥーレ媒体。 </li><li>約24時間滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引を播種し、原始線条誘導培地の2ミリリットルを追加した後。 注：この培地は高度なRPMI-1640培地中で1％グルタミン、0.2％FCS、5μMCHIR-99021および50 ngの/ mlのアクチビンAの最終濃度が含まれています。一般的に、6ウェルプレートで培養に2mlの培地を使用します。 </li><li> 48時間播種した後、誘導培地を内胚葉する培地を交換してください。毎日培地交換を持つ別の48時間この培地中で細胞を培養。 注：この培地は、1％グルタミン、0.2％FCSおよび高度なRPMI-1640培地中で50 ngの/ mlのアクチビンAが含まれています。胚体内胚葉に向けてコミットされた細胞は、表面マーカーCXCR4を発現します。 CXCR4の染色は、DE-コミットした細胞の数を定量するために使用することができます。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。 CXCR4 +フローサイトメトリー分析のための胚体内胚葉細胞の染色<ol><li>収穫前の最後の24時間が、少なくとも1時間のために、細胞を培養培地に10μMのROCK阻害剤を追加します。 </li><li>コート基底膜マトリックスで再播種するために使用される細胞培養ウェア、qPCR分析または免疫蛍光染色のためにチャンバースライドのため、すなわち、12ウェルプレート。 RTで少なくとも30分間、プレートまたはスライドをインキュベートします。 </li><li>染色および/またはソートに使用分化した細胞のウェルから滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引除去します。 </li><li>細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで37℃で細胞を、5％CO 2をインキュベートします。 注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。 materiに記載された無酵素継代ソリューションのためのALS部は、インキュベーション時間はおよそ7分です。 </li><li> 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、/ FCS OワットDMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 6ウェルプレートの3つのウェルからの細胞は、分化の3日後に10〜15×10 6個の細胞をもたらすはずです。 G×300で5分間、細胞を遠心。 注：得られた細胞の正確な数は、分化のために使用される多能性細胞株に依存するであろう。 </li><li>上清を吸引除去し、10μMのROCK阻害剤を含むPEBバッファーで細胞を再懸濁します。最大10 7個の細胞のために、この緩衝液100μlを使用してください。 stainiの日に10μMのROCK阻害剤を追加します。ngの。 （PEBバッファー+ RIと呼ばれる）すべてのダウンストリームアプリケーションのためにこのバッファを使用します。 注：PEBバッファーは、0.5％のBSA、PBS中2mMのEDTAが含まれています。より多くの細胞を染色する場合は、それに応じてバッファ量を調整します。 </li><li> 100μl中10 7個の細胞当たりCXCR4-APC抗体を10μlを追加し、これは、およそ1:10希釈を表します。 注：APC結合抗体の使用は必須ではありません。その代わりに、使用されるマイクロビーズに応じて置換され得ます。より多くの細胞を染色する場合に応じて、抗体の音量を調整します。 </li><li>軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファーで細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。 </li><li>滅菌ガラスパスツールピペットで上清を吸引除去し、10 7個の細胞あたり80μlのPEBに細胞ペレットを再懸濁し、20μlの抗APCマイクロビーズを追加します。 注意： </sより多くの細胞を染色する場合trong&gt;、それに応じてマイクロビーズ音量を調整します。 </li><li>軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファー+ RIを用いて細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。バッファを吸引します。 500μlのPEBバッファー+ RIで再懸濁。 </li></ol> CXCR4 +細胞の3磁気分離<ol><li>製造指示に従って磁界の中型の磁気カラムを配置します。 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを事前にすすぎます。列に全体の細胞懸濁液を適用します。カラムに結合するようではないすべてのセルを通過する流れを収集します。 CXCR4 +細胞の最適な検索のために列を乱さないことを確認してください。 </li><li> 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを3回洗浄します。介して第1の流れを収集し、ステップ3.1から採取した細胞とそれを組み合わせます。磁場から磁気カラムを削除し、それを配置します適切なコレクションチューブ。 1ミリリットルPEBバッファー+ RIをカラムに追加します。細胞を溶出するためには、しっかりと列にプランジャーを押し下げます。 </li><li>オプション：別途サンプルを介してすべての流れを収集し、フローサイトメトリーを用いて、CXCR4 +細胞の数を分析するために20μlのそれぞれを使用しています。その数は、すべての洗浄工程で辞退すべきです。 注：少なくとも2×10 4生存し、ゲート細胞は、信頼性の高い結果を得るためにカウントする必要があります。 </li><li>繰り返しますが、ステップ3.1と新しいカラムを用いて、ステップ3.2からのサンプルを通る第一の流からサンプルを通る収集・フローで3.1から3.3の手順。前回のコラムを再使用しないでください。プランジ​​ャ空気を使用しているブロックをカラムに押し込まれます。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。分化の効率に応じて最大6×10 6細胞を、手順10 7個の細胞を使用する場合に第二のカラムを使用して最初にソートされ、他の1×10 6細胞であり得ます。 </李&gt; <li> 5分間、300×gで細胞を遠心。吸引した上清と滅菌ガラスパスツールピペットを持つと追加10μMのROCK阻害剤でステップ1.9から1ミリリットル胚葉誘導培地で細胞を再懸濁します。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 、適切な密度で細胞をシードすなわち、〜12ウェルプレートのウェルあたり4×10 5細胞（アプリ3.6 cm 2の表面）または〜8ウェルチャンバースライドのウェル当たり1.5×10 5個の細胞。 </li></ol> 4.オプション：精製胚体内胚葉人口の分析<ol><li>免疫蛍光染色のために、およそ24時間の胚体内胚葉（DE）および/または多能性マーカータンパク質のための4％パラホルムアルデヒドや汚れを接種した後、ステップ3.7から精製された細胞を固定。 注：一般的に使用されるDEマーカーはFOXA2及びSOX17を含む、一般的に使用される多能性マーカーは、OCT3 / 4、NANOGとSOX2 6、8を含みます。 </li><li>フォーR RT-qPCR分析、直接精製された細胞を採取するか、播種後24時間、全RNAを抽出し、抽出した全RNAサンプルからcDNAを逆転写。 DEおよび多能性マーカー遺伝子6、8の発現を分析するためにRT-qPCRの反応（三重）あたりを鋳型として10 ngのcDNAを使用してください。 注：一般的に使用されるマーカー遺伝子は、ステップ4.1に記載されています。サイクル条件は、融解曲線分析に続いて、95℃で5分間及び95℃で15秒間の40サイクル、60℃で1分間です。 </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Highly+Purified+Cardiomyocytes+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Small+Molecule-modulated+Differentiation+and+Subsequent+Glucose+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Sgodda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+hepatic+differentiation+strategies+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).</li>
<li>Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+surrogate+beta-cells+from+embryonic+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet.</a> Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).</li>
<li>Katsirntaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+sublineage+specification+of+pluripotent+stem+cells%3A+effect+of+dexamethasone+plus+cAMP-elevating+agents+and+keratinocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor.</a> Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).</li>
<li>Abranches, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%3A+a+road+map+to+neurogenesis+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo.</a> PLoS One. 4 (7), e6286(2009).</li>
<li>Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+definitive+endoderm+from+human+embryonic+stem+cells+is+initially+independent+from+activin+A+but+requires+canonical+Wnt-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling.</a> Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+efficient+protocol+for+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+into+the+definitive+endoderm+based+on+dispersed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).</li>
<li>Kim, P. T., Ong, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+definitive+endoderm+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).</li>
<li>Katoh, M., Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analyses+of+CXCR4%3A+transcriptional+regulation+of+CXCR4+based+on+TGFbeta%2C+Nodal%2C+Activin+signaling+and+POU5F1%2C+FOXA2%2C+FOXC2%2C+FOXH1%2C+SOX17%2C+and+GFI1+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors.</a> Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+undifferentiated+cells+during+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).</li>
<li>Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+embryonic+stem+cells+from+differentiation+cultures+through+HSV1+thymidine+kinase+and+ganciclovir+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).</li>
<li>Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+FACS+approach+isolates+hESC+derived+endoderm+using+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors.</a> PLoS One. 6 (3), 17536(2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

現在使用されて分化プロトコルはほとんど100％に分化した細胞になりません。まだ対処されなければならない理由のために、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗します。使用される分化プロトコルの効率とESCの傾向に応じて、残留​​多能性細胞の特定の数は、一般的にさえ胚体内胚葉への分化後に観察されているライン。これらの残留細胞は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびmiRNA発現解析などの下流の微分またはさらなる分析を損なうおそれがあります。残余の多能性細胞または他の不要な系統はまた、分化の目標を妨げる可能性パラクリン効果を示すことができます。したがって、これらの細胞の除去は、改善された再現性をもたらすことができます。 分化後に内胚葉細胞を発現CXCR4 +の精製は、これらの集団を濃縮するために、および分化過程に抵抗する細胞を除去するために使用することができます。表面DEマーカータンパク質CXCR4は、胚体内胚葉細胞の特異的な精製のために使用することができます。手元MACS精製プロトコル未満、2時間以内に完了することができ、高価な実験装置および装置なしですべての細胞培養実験室での単純な...

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞は、ヒトの身体の実質的に任意の細胞型に分化する能力を有します。したがって、in vitroでの分化プロトコルは、心筋1、肝細胞2、β細胞3、肺上皮4または神経細胞5のような多数の成体細胞型を生成することができます。これは、様々な変性疾患3の潜在的な治療のためのESCの貴重なツールとなります。 肺、肝臓と膵臓の成体組織に向かってESCのインビトロ分化は、胚体内胚葉（DE）6を連想させる細胞への擬似原腸形成を必要とします。上記の体細胞型に向かって下流分化は著しく効率が低いので、最適な内胚葉分化は律速7とみなされます。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、茶を受けますそれらの遺伝子発現プロファイルのracteristic変化。例えばFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバーと表面受容体CXCR4のような他の転写因子の発現は非常6、8、9を上方制御される一方、多能性マスター調節遺伝子がダウンレギュレートされている。CXCR4はSMAD2によりトランスされることが知られています、そのプロモーター領域10内の特定の結合部位へのノーダル/ TGF-βシグナルとSOX17の下流/ 3、。したがって、レポート6、8、11〜13の数で使用される非常に適したマーカーです。これらの発現変化のESCが第原始線条様細胞集団の特性を獲得し、その後、内胚葉の胚層6にコミットする擬似原腸形成のイベントを反映しています。 少数の細胞が分化過程をレジストや他の意図しない系統14に分化することができるようしかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。これらの細胞は、負influeありNCEさらなる分化。また、残余の未分化細胞は、後の移植実験のための大きなリスクを保有し、奇形腫15-17を生じさせる可能性があります。 早期に表面マーカーCXCR4 DE 18に向けてコミットされた細胞の精製に使用することができ、これらの不要な細胞を除去するために。ここでは、DE分化培養からのCXCR4 +細胞の正の選択のための方法を説明します。このため、表面マーカーCXCR4は、その後今度は、磁気マイクロビーズに結合する抗体によって結合されます。 FACS選別中過酷な条件とは異なり、磁気的に標識されたDE細胞様細胞は、その後、簡単に優しい精製法を用いて、ベンチトップ形式で精製され得ます。このプロトコルは、DE分化プロセスに抵抗する細胞集団を除去するための簡単​​な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Hues8 ヒト胚性幹細胞株</td><td>ハーバード大学幹細胞・再生生物学</td><td></td>部 <td>内胚葉世代に適した細胞株</td></tr><tr><td>Hes3 ヒト胚性幹細胞株</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>内胚葉世代に適した堅牢な細胞株</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC 培養液</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>磁場</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK 阻害剤</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Enzyme-free継代液、代替:トリプシン/ EDTA</td></tr><tr><td>マトリゲル*</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>基底膜マトリックス *-80°Cでアリコートに解決して保存します。サプライヤーマニュアルに記載されているC。使用時には、氷上で解凍し、25 mlの氷冷ノックアウトDMEM / F-12. で希釈します6ウェルプレートの各ウェルに1 mlを加え、室温で45分間インキュベートします。 マトリゲルを取り外してすぐに使用します。</td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FOXA2 FW gggagcggtgagatgga</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ NA</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒト GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ SOX17 TaqMan アッセイ</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>ヒト SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>ヒューマン SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtgggggg</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒト POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒューマンナノグ FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒューマンナノグ REV ccatccactgccacatctcttct</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒューマンTBP FW caacag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 人間 TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 人間 TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 人間 TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g ライフ</td><td>テクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 人間 G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>ヒト G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ アンチSOX2</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>アンチFOXA2</td><td>メルクミリポア</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>アンチSOX17</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞の分化能力は、細胞置換療法のための潜在的治療用途を可能にします。分化した細胞型は、種々の変性疾患の治療のために使用することができる。、肺、肝臓、および膵臓の組織に向かって、これらの細胞のインビトロ分化は、第一段階として、決定的な内胚葉細胞の生成を必要とします。このステップは、レート制限などのインスリン産生β細胞、肝細胞または他の内胚葉由来の細胞型として末端成熟した細胞型に向けてさらなる分化のためのものです。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、非常にそのようなFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバー、および表面受容体CXCR4のような転写因子の多くを表現します。しかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。ここでは、分化後のCXCR4 +細胞集団の精製のための方法を説明します磁性マイクロビーズを使用して、DEへ。この精製は、さらに不要な系統の細胞を除去します。穏やかな精製方法は、迅速で信頼性が高く、下流側のアプリケーションと分化を改善するために使用されるかもしれません。

分化すると ESCは、遺伝子およびタンパク質発現の急激な変化を受ける。 図1は、成功した内胚葉分化を確認するために使用することができる代表的なマーカー遺伝子を示します。遺伝子発現解析のための主要な標的は、GSC、FOXA2、及びSOX17ある。未分化のESCと比較した場合の相対的な遺伝子発現解析では、特にFOXA2及びSOX17は &gt; 2000倍に増加している。GSCはすでに原始線条形成の間に非常に初期の24時間以内に発現していますしかし、それにもかかわらず4日目&gt; 100倍に誘導されます。これらの遺伝子の発現は、CXCR4の表面マーカー6を用いて選別時に結果的に増加します。これらの遺伝子の発現は、まだ4日後に検出可能であるが、このようなOCT3 / 4（POU5F1）およびNANOGなどの多能性のマスターレギ...

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

この手法の全体的な目的は、ヒト胚性幹細胞（ES細胞）から分化させた内胚葉細胞を精製することです。本手法は、内胚葉分化に関する幹細胞分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、未分化細胞を除去することで、純粋な内胚葉細胞集団を得られる点にあります。手順を開始する前に、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルあたり1 mLの基底膜マトリックスでコーティングし、室温で30分以上静置します。次に、ヒトES細胞を回収するため、80〜90%コンフルエントなヒト胚性幹細胞培養液から、滅菌済みのガラス製パスツールピペットを用いて培地を吸引します。その後、1ウェルあたり2 mLのPBSで細胞を洗浄します。プレートを揺らし、生理食塩水を吸引して、死細胞や残渣を除去します。次に、37 °C、5% CO2の条件下で、1 mLの酵素フリー継代溶液を用いて細胞塊を穏やかに解離させ、細胞がより小さな塊に分断されたことが明確に確認できるまで処理します。約7分後、ウェルにDMMF12培地を1 mL加えます。そして、1 mLピペットチップを用いて数回ピペッティングし、残っている細胞凝集塊をバラして単一細胞懸濁液にします。同じピペットを使用して細胞を遠心管に移し、ウェルを1 mLの新鮮なDMMF12培地で洗浄し、その洗浄液を遠心管に回収します。細胞を遠心分離した後、ROCK阻害剤を添加したES細胞培地5 mLでペレットを再懸濁します。細胞数を計測し、アポトーシスを防ぐためにROCK阻害剤を添加した培地を用いて、基底膜マトリックスでコーティングしたプレートに1ウェルあたり1.5〜4 × 10⁵個の細胞を播種します。その後、細胞を約24時間インキュベートします。次に、滅菌済みのガラス製パストゥールピペットを用いて、各ウェルの培地を2 millilitersの原条誘導培地に入れ替えます。さらに24時間培養した後、培地を内胚葉誘導培地に交換し、毎日培地を更新しながら48時間インキュベートします。培養最終日の、細胞回収の少なくとも1時間前に、新鮮なROCK inhibitorを培養液に添加してください。次に、滅菌済みのガラス製パストゥールピペットを使用して各ウェルから培地を吸引し、先ほど実演したように酵素フリーの継代用溶液試薬を用いて細胞を解離させます。単一細胞懸濁液が得られたら、細胞数を計測し、遠心分離を行います。ここからのすべての培地およびバッファーには、細胞死を防ぐためにROCK阻害剤が含まれていることを確認してください。そうしないと、回収後に適切に接着しません。ペレットを、1 × 10⁷個の細胞あたりROCK阻害剤を添加した100 µLのPEBバッファーで再懸濁します。その後、細胞にCXCR4 APC抗体を添加します。チューブを軽く弾いて混ぜ合わせます。4 °Cで15分間置いた後、1〜2 mLのPEBバッファーで細胞を洗浄し、滅菌済みのガラス製パステールピペットを用いて上清を吸引します。1 × 10⁷個の細胞あたり80 µLのPEBバッファーでペレットを再懸濁し、細胞に20 µLのanti-APCマイクロビーズを加えます。サンプルを軽く指で弾くようにして混ぜ合わせます。その後、細胞を4 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー1〜2 mLで細胞を洗浄します。次に、ペレットを500 µLの新鮮なPEBバッファー（インヒビター添加）に再懸濁します。磁気ビーズ分離法でCXCR4+細胞を単離するために、適切なサイズの磁石に中型の磁気カラムをセットし、500 µLのPEBバッファー（ROCKインヒビター添加）でカラムをあらかじめ洗浄します。洗浄液がすべてカラム上部から流れ出た後、磁気ビーズでラベル化した細胞懸濁液の全量をカラムに添加し、通り抜けた液をコニカルチューブに回収します。ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー500 µLで、カラムを3回洗浄します。次に、磁石からカラムを取り出し、適切な回収チューブに移します。そして、ROCK阻害剤を添加したPEBバッファー1 mLをカラムに流し込み、CXCR4+細胞を回収します。オプションとして、すべてのフロースルーサンプルを個別に回収し、各サンプルから20 µLずつ分注して、フローサイトメトリーにより各分注分に含まれるCXCR4+細胞の割合を決定することができます。この手順を最初のフロースルーで繰り返すことで、カラムに結合しなかった細胞を回収できます。その後、分注したすべてのCXCR4+サンプルをまとめ、遠心分離します。最後に、ROCK阻害剤を添加した内胚葉誘導培地 1 mL でペレットを再懸濁し、基底膜マトリックスでコーティングした細胞培養容器に適切な密度で細胞を播種します。分化前、ヒトES細胞は多能性マーカーである SOX2 を高レベルで発現していますが、決定的な内胚葉マーカーである FOXA2 は検出されません。分化に伴い、ES細胞は遺伝子およびタンパク質の発現において劇的な変化を起こします。実際に、分化培地で4日間培養した後、かつてのES細胞の多くにおいて、核内にSOX17とFOXA2が均一に共発現しており、これは決定的な内胚葉への分化（definitive endoderm commitment）の指標となります。一部の細胞は分化プロセスに抵抗し、これら2つのマーカータンパク質のいずれも発現しません。実際に、これらの細胞は多能性マーカーであるSOX2の発現を維持しています。この代表的な実験では、分化3日目に回収したES細胞の約60%がCXCR4を発現しており、磁気ビーズによる多能性細胞およびその他の不要な系統細胞のソーティング後、その純度は85%以上にまで高められました。精製したCXCR4+細胞を播種した後、検出されるSOX2+細胞はわずかであり、播種された細胞の大部分はFOXA2を発現していました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで2時間以内に完了させることができます。本手順に続いて、免疫組織化学染色やQPCRなどの同様の手法を行うことで、分化プロセスに関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。このビデオを視聴することで、磁気ビーズソーティングによる内胚葉細胞の精製方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。...

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高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

我々は、正の選択を用いた生きたヒト胚性幹細胞(hESC)の同定および濃縮のための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介した細胞表面抗原の複合検出のためのモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用と、混合細胞集団からのhESCCをパージするための否定的選択の使用について述べた。...

モノクローナル抗体TG30およびGCTM-2を用いた細胞表面抗原の検出によるヒト胚性幹細胞の濃縮とパージ

このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。...

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。...

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

フィーダー細胞で培養したヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の酵素的または機械的継代に伴う制限を回避するため、EDTAを介した接着除去を使用して、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に維持されたヒトES細胞またはiPS細胞コロニーを採取するための迅速、効果的、費用対効果の高い、高収率の方法を確立しました。...

エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

学ぶヒト胚性幹細胞から内胚葉細胞を精製する方法。CXCR4抗体と磁気ビーズ分離を用いて未分化細胞を除去し、純粋な細胞集団を得ます。この技術は幹細胞研究と再生医療への応用に有用です。

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

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