Name: 球状エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ球状エマルジョン液滴を用いた紡錘体様構造の再構成法。ミトーシス細胞の幾何学的閉塞を模倣し、微小管とモータータンパク質の動態を可視化して紡錘体形成メカニズムを解明する革新的なボトムアップアプローチです。

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貴重な議論をしてくださったドグテロム研究室のメンバーに感謝します。試薬についてはStefan Diez氏とMarcel Janson氏、ダイニンの精製にはSamara Reck-Peterson氏に感謝します。この研究は、欧州研究会議(ERC Synergy助成金:MODEL-CELL)からの資金提供によって支援されました。

<ol><li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spindle+positioning%3A+cortical+force+generators+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li>
<li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+divisions%2C+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li>
<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
<li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers%3A+the+role+of+catastrophes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li>
<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li>
<li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li>
<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
<li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
<li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+function+of+Ase1p%3A+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li>
<li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li>
<li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li>
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<li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li>
<li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division%2C+meiotic+nuclear+oscillation%2C+and+cytokinesis+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li>
<li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cortical+Dynein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li>
<li>Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoudjou%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li>
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<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li>
<li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li>
<li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li>
<li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

方法は、ここで油中水型エマルジョンの液滴中の基本的な紡錘体を再構成することが、本の最近の取り組みを説明しました。幾何学的境界内にスピンドル・アセンブリを研究することは、多数の利点を提供します。重要なフィードバック機構は、有糸分裂紡錘体の微小管と、それらが組み立てられた幾何学的制約の間に存在します。微小管は、それらが、紡錘体の変位をもたらすことができる幾何学的境界に成長時に力を押し生成することができます。また、物理的な障壁に成長する微小管災害を誘発することができます。また、制限された形状内のスピンドル・アセンブリは、順番に直接微小管の成長率36に影響を与えるようなチューブリンなどの個々のコンポーネント、の漸進的な枯渇につながることができます。これらは、ここに記載のアッセイを用いて研究することができるスピンドル・アセンブリの全ての必須の決定要因です。 記載のアッセイは、低濃度のdiffereに非常に敏感です液滴コンポーネントのNCES。これは、マイナーな濃度差がいずれか遅すぎるか、あまりにも急速な微小管の成長をもたらすことができるチューブリン、の場合です。この場合には、微小管の成長率は、多くの場合、依然として実験の最初の約30分の間に温度を調整することによって補正することができます。有糸分裂紡錘体の組み立て及び位置合わせは、（皮質）力発生の濃度の変化に非常に敏感です。これは、精製された成分の濃度、純度および活性に依存する可能性があり、すべての新たに精製されたタンパク質のために慎重に滴定される必要があります。 また、特定のトレードオフは、アッセイの性質に応じて、撮像設定で行われなければなりません。最初は、水溶性の蛍光チューブリン二量体の高レベルは、画像の個々の微小管にそれを困難にします。微小管が長く成長し、可溶性チューブリンを徐々に枯渇しているように、信号対雑音比が徐々に高くなり、individuのイメージングを可能にしますアル微小管。オープンシステムでセットアップとは対照的に、幾何学的な閉じ込めは重要漂白が得られ、バルクリザーバ内の蛍光分子及び酸素スカベンジャー系の成分の交換を防止します。特に経時スピンドルアセンブリと位置を監視するために、それがあっても強力な酸素スカベンジャー系の存在下で、低い光強度で画像に必要とされます。 これらの方法には、in vitroでの簡素化紡錘状構造のボトムアップ再構成を可能にします。ここで紹介成分に加えて、他の多くの要因は、双極紡錘体形成、位置決め、方向付け、成形、 等 3に影響を与えることが記載されています。このシステムは、さらに、追加の力発生器の個々の及び組み合わせの効果を研究するために拡張することができます。このシステムから、現在存在しない紡錘体形成に重要な貢献者は、有糸分裂染色体です。有糸分裂クロマチンに示されていますいわゆる「極性吐出軍3 &#39; を生成することができます （1）chromokinesins、クロマチン結合RanGEF RCC1 38によってRanGTPと勾配の（2）の形成、（脱重合と相互作用することができる（3）動原体による直接紡錘体形成）微小管39及び（4）の対向する微小管40との間における機械的バネとして機能することができるクロマチン自体。 最後に、記載されたシステムは、現在、限られた時間的・​​空間的な活動を制御し、導入力発電機の局在を提供します。細胞では、多数のスピンドル・アセンブリの要素は、特定のコンパートメントに局在化または制限された時間ウィンドウ内で活性です。顕著な例は、具体的にはCの後側に濃縮されるダイニンの活動であり、非対称の主軸位置と細胞分裂を促進する1細胞期胚をエレガンス 。このシステムでは、我々は現在、トンを模倣する可能性を模索しています光遺伝学的手法から借用した方法を用いてemporalと非対称活動。また、Cの場合と同様エレガンス胚と剛性細胞壁を有する細胞は、多くの細胞が有糸分裂に切り上げていません。幾何学的な閉じ込めの形状は、スピンドル41に作用する力の基礎影響を与えることになります。したがって、潜在的に整形し、エマルジ ​​ョン液滴42,43の記憶許可より複雑なマイクロ流体システムを使用して、同様に非球形の小滴にスピンドル・アセンブリと位置を再構成することが重要であろう。最後に、組織において、細胞 - 細胞および細胞 - 基質シグナリングおよび付着は、多くの場合、上皮細胞において観察されるように、指向軸方向に変換することができる外部の手がかりを提供し、幹細胞。これらの特殊な側面のすべては、この現在の研究では考慮されておらず、紡錘体assembのin vivo様より再構成は向かって構築するための今後の課題を提供するかもしれませんLYとポジショニング。

有糸分裂の間、複製されたゲノムの染色体は新たに形成された娘細胞の上に姉妹染色分の平等な分配を確保するために、セル赤道で編成されています。染色体の位置および分離は、二つの対向の中心体から発するスピンドル微小管への結合によって媒介されます。忠実な染色体分配を確保することに加えて、有糸分裂紡錘体の配向は、細胞分裂面1を決定します 。細胞分裂の協調姿勢は、開発の多くの段階中および組織の恒常性2に必須です。具体的には、規制紡錘体の位置は、細胞内容の非対称分布が生じ、あるいは異なるサイズ2の娘細胞を生成することができます。紡錘体アセンブリおよび向きは、前期に開始し、協力し力発電機3,4に拮抗するとの間の複雑な相互作用によって編成されています。発生する力は、Bから構成されOTH引っ張り、押す力。これらの力は、細胞の皮質とスピンドルの連絡先からだけでなく、スピンドル内の両方から発信され、微小管ダイナミクスによってだけでなく、分子モーターとクロスリンカー（ 図1）によって生成することができます。 微小管は、細胞皮質のような剛性の構造に対して成長時押圧力を発生させることができます。システム内で発生する総抵抗力に応じて、これは、有糸分裂紡錘体（低力）の再配置をもたらすか、微小管の座屈や大惨事（強い力）5-8をトリガすることができます 。長さは、微小管座屈9の強力な決定因子であるので、押すことによって発生させることができる力の量は、微小管の長さに依存します。さらに、1つの中心体に由来微小管は、他の中心体に対して早期前期3,10に中心体分離を駆動するために提案された機構を押すことができます。 広告で成長している微小管によって発生した力を押す、微小管が接触し末端細胞表層へのditionも力11を引っ張っ媒介することができます。複数の研究室からの研究は、皮質力発電機の制御された活性は、インビボ 1 で紡錘体の非対称の位置決めのために必要であることを示しています。これらの引っ張り力にエッセンシャル（以下「ダイニン」という）皮質局在細胞質ダイニン、マイナスエンド向かう微小管モーター蛋白質8,12,13です。例えば、酵母、皮質14に沿ってスライドモーター依存微小管における微小管の格子結果に皮質ダイニンの横方向の相互作用を出芽インチしかし、皮質引っ張り力はまた、微小管8を解重合する末端にアタッチメントを形成するダイニンの機能によって生成することができます。微小管収縮によって発生するエネルギーは、一般的により高い一桁力につながる可能性があり（〜50 PN（15を参照</s個々のモータータンパク質（〜7-8 PN（参考文献16））によって生成される力より））&gt;アップ。脱重合微小管への皮質ダイニンのエンド上の結合は出芽酵母17およびCで主軸の位置決めを促進しますエレガンス 13。モーター依存スライドおよび微小管脱重合駆動の両方皮質引っ張る力が協力またはin vivoで相互に排他的であることができるかどうかを現在不明です。 微小管押圧力とダイニン媒介皮質引っ張り力に加えて、中心体の位置決めは、多くの他のタンパク質によって有糸分裂紡錘体の中から制御されます。キネシン-5モータは、例えば、外側にスライド力18-20の生成をもたらす、逆平行極間微小管を架橋することができる四量体として存在します。キネシン-5モーターファミリーのメンバーは、Cの例外を除いて、研究した全ての真核生物における中心体分離およびバイポーラスピンドルアセンブリのために必要とされますエレガンス<html> （参照21に概説されています）。 また、ASE1 / PRC1ファミリーの拡散性架橋剤はまた、 インビボおよびインビトロ 22-27 に極間微小管の微小管重複領域に局在することが知られています。重複微小管領域のASE1主導の展開によって発生する力は、in vitro 28,29 にキネシン-14媒介スライディング力を相殺するのに十分な大きさです。細胞では、ASE1 / PRC1は、スピンドル中間帯25-27,30で微小管の重複領域を拡散性架橋剤によって発生する力が大幅にスピンドル組織に貢献できることを示唆しているの安定形成に必要です。最後に、有糸分裂クロマチンからの力および動原体は、種々の経路3を介して紡錘体のアセンブリおよび位置決めに影響を与えます。これらのコンポーネントは、ここで説明する再構成アッセイの一部ではないので、詳細には説明しません。 jove_content &quot;&gt;別の理論は、異なる分子成分と力がスピンドルアセンブリと位置決めに協力、私たちはまだ遠い定量的理解からである上記の方法に存在する。生細胞での実験に加えて、精製された成分を用いたin vitroの実験の強力なを提供しますこの目標を達成するのに役立つルート。ここでは、最近公開された方法（ロスら 31）の適応と拡張版の視覚ガイドを提示し、基本的なスピンドルが始まる、油中水型エマルジ ​​ョン液滴中で再構成されていますマイクロ流体技術を使用してコンポーネントの最小数は、球状液滴が分裂細胞に匹敵するサイズで生成される。これらの液滴内で、精製された中心体およびチューブリンは、微小管アスター動態を研究発生及びアスター・アスター相互作用を強制するために組み合わせることができる。で皮質（例えば、ダイニンなど）およびインター極性（例えば、キネシン5 / ASE1）力発電機を導入し、我々in vivoの状況に似ていると起動し、ますます複雑紡錘状の構造を再構成します。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.マイクロ流体チップの調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (フィルム基板上のフォトマスク)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 &オメガ;-cm, 500-550 &mu;m, SSP, フラット2個付)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター&nbsp;</td><td>ポロス</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMSのプレポリマーRVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>コロナのtreater</td><td>の電気technicプロダクト</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2。マイクロ流体セットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(ビオチニル))ア</td><td>バンティ 極性脂質</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ラボポート</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー</td><td>カルテル</td><td>ポリプロピレン 真空デシケーター</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>界面活性剤 (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm、厚さ 1.5</td></tr><tr><td>スライド</td><td></td><td></td>ガラス <td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>パンチャー</td><td>ハリス ユニコア</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>ラボ用シーリングフィルム</td><td>パラフィルム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap(ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスを等濃度で溶かした)</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>反転明視野があれば十分です</td></tr><tr><td>圧力コントローラー</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK チューブ</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.スピンドルの形成と位置決めの再構成<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース (D-(+)-グルコース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ (Aspergillus niger 由来のグルコースオキシダーゼ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ジチオールテイトール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (ウシ肝臓のカタラーゼ型)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin(ウシ脳由来チューブリン)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>株式会社サイトスケルトン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (グアノシン-'5-三リン酸、ナトリウム塩水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-カゼイン(&kappa;-カゼイン、ウシ血清ミルク由来)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (空気駆動超遠心分離機)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4.スピンドル組立因子の紹介</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</ストロング></td></tr><tr><td>ニュートラビジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP(アデノシン-'5-三リン酸、二ナトリウム塩水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (リン酸化(エノール)ピルビン酸 monosodium salt hydrate &ge;97%(酵素))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK / LDH -(ウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

有糸分裂紡錘体の組み立て、位置、および配向は、微小管のダイナミクス、微小管モータータンパク質、および架橋剤によって生成される複合的な力に依存します。成長する微小管は押す力を発生させることができますが、解重合する微小管は、微小管の収縮からのエネルギーを、たとえば皮質のダイニンや染色体に付着したときに引っ張る力に変換できます。さらに、紡錘体内のモータータンパク質と拡散性架橋剤は、反平行微小管を結合して摺動することにより、紡錘体の構造に貢献します。In vivoでは、個々のプレーヤーが全体的な力のバランスに相対的に貢献していることを解明することは困難であることが証明されています。ここでは、基本的な有糸分裂紡錘体をin vitroでボトムアップで再構成するために最近開発した方法を紹介します。マイクロ流体技術を用いて、セントロソームとチューブリンを油中水型エマルジョン液滴に封入し、幾何学的に閉じ込められた(二重の)微小管アスターを形成します。さらに、皮質に固定されたダイニン、プラスエンド指向性微小管モーター、拡散性架橋剤を導入することにより、このシステムは紡錘状構造の再構成に使用されます。ここで紹介する方法は、より完全な有糸分裂紡錘体を再構成するための出発点を提供し、個々のコンポーネントの寄与を詳細に研究し、有糸分裂紡錘体内の力とバランスの統合的な定量的ビューを得ることができます。

前のセクションで提示される方法は、油中水型エマルジョン液滴の幾何学的な閉じ込めを使用して複雑さを増加させると、スピンドル状構造の再構成を可能にします。このセクションでは、質的にこれらのアッセイの能力を実証する代表的な結果を説明しています。 バイポーラスピンドルが組み立てられたとき、有糸分裂の間、細胞はヒト細胞のために測定されるように、約15ミクロンの直径を有する球を形成するために切り上げます。この特性有糸分裂細胞の形状が制限され、両方がスピンドルサイズや向き35,36を指示する幾何学的境界を提供します。マイクロ流体技術は、正確に生きた細胞で観察された状況に似ているため、in vitroでの紡錘体のボトムアップ再構成を可能にする幾何学的封じ込めのレベルを提供します。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-微小管の成長は、幾何学的境界によって制限されているときにページ= &quot;1&quot;&gt;微小管アスターは既にそれ自体で複雑な動作が可能です。微小管が成長するにつれ、新たなチューブリン二量体を組み込むことにより生成された押し込み力はエマルジョン液滴の両側に2中心体を駆動します。最初は、中心体が自由に閉じ込められたボリューム（ 図4a、左パネル）内に拡散します。約20〜30分後、最初の微小管は微小管がすべての方向に皮質に対して成長するにつれて拡散が制限となり、可視および中心体になります。中間の長さ（液滴直径の約50％）の微小管とアスターは、（立体的に）、他の中心体および皮質互いに押し微小管と、それぞれ別のを撃退することができます。これは、互いに（ 図4a、中央のパネル）二つの対向中心体を有する典型的な「バイポーラ」紡錘状の配置になります。微小管は、液滴直径の〜50％以上成長するとメーターは、中心体を液滴皮質（ 図4a、右パネル）に沿って成長している微小管と、液滴の対向する境界にさらにプッシュされます。これらのアッセイにおける微小管の成長率は温度とチューブリン濃度の両方に非常に敏感であることに注意することが重要です。これらのパラメータは、したがって、強く核生成が最初に観察され、定常状態のアスター位置に達したときの時間に影響します。 細胞では、皮質引っ張る力が微小管プラス端と皮質関連ダイニンとの間に耐荷重添付ファイルの形成を介して生成されます。動物細胞では、この関連はのGαi1のN末端 ​​ミリストイル化を経由して、原形質膜を標的とするのGαi/ LGN / NuMAの複合体に依存します。これらの再構成アッセイでは、のGαi/ LGN /のNuMA複合体の要件を直接介して、ビオチン化脂質とダイニンを結合させることによりバイパスされますビオチン - ストレプトアビジン - ビオチン複合体の形成。これらの結合は比較的安定（K D〜10 -14 M）37であり、急速に形成する（通常は微小管の核形成が明らかになる前に、エマルション滴形成後10分以内）（ 図4b）。ダイニンの非存在下で、中心体を液滴皮質（ 図4c）の反対側に押され、一方の皮質ダイニンの存在下では、中心体は、典型的には、複数の中央位置を保持します。私たちは、これを防止し、微小管押す力に対抗する二つの効果の結果である理由。 （1）ダイニンは直接それによって微小管の長さを制限し、過度の微小管の座屈を防止し、微小管の大災害を促進し、（2）皮質引っ張る力は、アスター、アスター反発力に対抗個々アスター8、上の正味のセンタリング力につながります。 拡散性架橋剤ASE1がfを誘導します逆平行微小管29の重なり領域を増大させる傾向があるorces。これと一致し、ASE1の存在（とダイニンの不在）で中心体は、ASE1がバンドルさ極間微小管（ 図4d）にローカライズと密接一緒に発見されました。キネシン-5ファミリーのメンバーは、（導入を参照）スピンドル内から押し出す力を提供することにより、中心体の分離を駆動します。 Cut7（S.ポンベキネシン5オルソログ）の存在下では、中心体であってもASE1（ 図4e）の存在下で、エマルション液滴の反対側に押し出されます。皮質およびインター極性力発生器を組み合わせることによって、複雑さのレベルは、さらに最終的には双極性有糸分裂紡錘体の包括的な理解をもたらす、これらの実験で増加させることができます。これらの結果の詳細な定量的記述は、将来的に利用できるようになります（ロスら、原稿準備中）。 <p class="jove_content" fo:keeP-together.withinページ= &quot;1&quot;&gt;時点で固定瞬間中心体の位置を観察し、そして微小管の観察された長さに彼らの行動に関連することに加えて、有益な情報が渡って測位処理を以下により得ることができます時間。露光時間及びレーザ強度​​を低減することにより、それだけで約30％の漂白剤を有する少なくとも1時間、2分間隔でアスター位置に追従することが可能です。これは、集中介して自由に拡散する中心体からアスターアセンブリおよび位置決めの監視（0分）ことができます（12分）分散型アスター（36分、さらに）（ 図5c）に。これは、両方の定常状態の挙動とスピンドルアセンブリ動態の研究を促進します。同一試料中の異なる内容の小滴を組み合わせることによって、そのままでおよび皮質力発生器（ 図5b）なしで小滴に中心体の位置決め及びスピンドルアセンブリ動態を比較するために、例えば、可能です。 図1： 紡錘体に作用する力 、いくつかの力を発生する分子は紡錘体の形成および位置決めを促進するために、紡錘体の微小管に作用します。細胞表層に成長する微小管は中心体に押圧力を発生させます。 （紫）皮質ダイニンは、脱重合微小管をキャプチャし、中心体に引っ張り力を発生させます。 PRC1 / ASE1ファミリーのクロスリンカーは、対向する外側にスライドする力を発生に対し、スピンドル内では、キネシン-5 / Cut7モータータンパク質は、反平行微小管を外側にスライドする力を与える。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> 図2：4マイクロ流体チップを含む4インチのフォトマスクのマイクロ流体チップの設計 （A）設計。 （B）シングルチップの詳細な表現。チップは、1つの出口チャネルとダストフィルタが続く3の入口チャネルが含まれています。入口チャネル1が水相を含有し、脂質/油相とチャネル3 2チャネルは、追加の脂質/油相で形成された液滴を希釈するために使用することができます。 （C）（上下から来る）脂質/油相（左から来る）水相に会う接合部の詳細な表現。ジャンクショ​​ンで、液滴が形成され、右側の出口流路に向かって流れます。 （D）2ミクロンチャネルを有する防塵フィルタの詳細な表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> 図 3： 油中水滴型エマルジ ​​ョン液滴形成のための方法論 （A）明視野顕微鏡上のマイクロ流体チップとマイクロ流体チューブ。水及び脂質/油相の管の両方が、それぞれチップ口1,2に接続されています。 （B）水と脂質/油相が満たすマイクロ流体チップの制限。圧力を変化させることにより、液滴サイズを制御することができます。 PDMSコーティングされたフローセルの（C）設計。フローセル内への液滴をロードした後、開放端部には、追加Valapで閉鎖されています。 （D）液滴形成の概略図。液滴は、中心体、チューブリンおよび紡錘体形成のために必要な追加の構成要素を封入するために使用されます。皮質ダイニンターゲティングの（E）の回路図。ビオチン化（バイオ）ダイニンは、ストレプトアビジン（STRP）を介してビオチン化脂質を標的とします。 <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> 図4： 複雑さの増加に伴ってスピンドル・再構成はの代表的な結果 （A）、短い、中間、及び長い微小管の一例を示す2中心体を含む液滴の最大強度投影。中心体と微小管10％HiLyte-488チューブリン標識の添加により可視化されます。スケールバー=10μmです。 （B）非存在下でのGFP-ビオチンダイニン-TMRのローカライズ（ - 、左）とストレプトアビジンの存在（+、右）（STRP）。皮質GFP-ビオチンダイニン-TMRのまたは存在（+、右） - （C）微小管アスター不在の位置決め（左）。 （D）微小管アスター（左パネル、GRASE1の存在下でEEN）ポジショニング（中央のパネル、赤）。 ASE1とCut7（キネシン-5）（中央のパネル、赤）の存在下で、（E）微小管アスター（左パネル、緑）ポジショニング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> 図 5：in vitroでの イメージングアスターポジショニングダイナミクス （A）、数時間までのために液滴イメージングを可能にするPDMSカップのデザイン。異なる内容を含む液滴の（B）の生成、ストレージおよびイメージング（送信）は、不在蛍光デキストランの（左）インクルージョン（右）（アレクサ647）によって示されています。広告のzスタック（2μmの距離）から取られた60分のタイムラプスの（C）シングル平面画像（2分間隔）単一の中心体を含むroplet。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

有糸分裂紡錘体の組み立てと位置は、微小管のダイナミクス、モータータンパク質、および架橋剤によって生成される複合的な力に依存します。ここでは、球状エマルジョン液滴の幾何学的閉じ込めを基本的な有糸分裂紡錘体のボトムアップ再構成に使用する最近開発された方法を紹介します。

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

この手順の全体的な目的は、水中油型エマルション液滴の幾何学的閉じ込めの中で、有糸分裂紡錘体様構造を再構成することです。この手法は、紡錘体がどのように配置され組み立てられるか、また、個々の構成要素がこれらのプロセスにどのように具体的に寄与しているかなど、有糸分裂紡錘体の構築分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、有糸分裂細胞の形状を模倣した幾何学的閉じ込めの中で、ボトムアップアプローチを用いて紡錘体様構造を再構成できる点にあります。この手法は、細胞の閉じ込め（cellular confinement）に依存する他のプロセスの研究にも利用可能です。PDMSプレポリマー10部と硬化剤1部を、合計質量約40 gになるように混合します。次に、気泡を除去するため、混合物を真空チャンバー内に約30分間置きます。その間に、型にアルミホイルを巻き付け、直径4インチ、深さ1センチメートルのカップ状にします。準備ができたら、PDMS混合液の約3/4を型に注ぎます。その後、PDMSを再び真空チャンバーに戻し、さらに30分間脱気します。脱気後、PDMSを100 °Cで1時間硬化させます。その間に、圧縮空気でホコリを取り除き、スピンコート用のガラススライドを準備します。その後、残りのPDMS混合液をスライド上にスピンコートします。PDMSを硬化させるため、これらのスライドを100 °Cで1時間キュアします。次に、カミソリを使用してPDMSをゆっくりと剥離し、PDMSストリップに必要な穴をパンチしてマイクロ流路チップを作成します。その後、マイクロ流路チップとPDMSコーティングしたガラススライドを数秒間コロナ処理します。最後に、各ガラススライド上にマイクロ流体チップをチャンネルが下を向くように配置し、100 °Cで一晩ベイクします。まず、クロロフォームで洗浄したガラス器具を用いて、クロロフォームに溶解させた脂質を約250 µg準備します。不活性ガスを用いて、脂質混合物を慎重に乾燥させます。その後、真空チャンバー内に1時間置きます。次に、脂質をミネラルオイルと2.5%界面活性剤に溶解し、濃度を0.5 mg/mL（約500 µL）にします。脂質を完全に溶解させるため、混合物を40 kHzで30分間ソニケーションします。次に、顕微鏡対物レンズに適合する厚さになるように、カバーガラスにPDMSをスピンコートします。続いて、ガラススライドにもPDMSをスピンコートします。そして、PDMSをコートしたカバーガラスとガラススライドを100 °Cで1時間キュアします。次に、ラボ用シーリングフィルムを薄く切り出し、PDMSコーティングを施したガラススライド上に密接に配置してフローセルを作製します。3 mm幅のストリップを約2 mm間隔で配置してください。その後、フローセルをPDMSコーティング済みのカバースリップで覆い、フィルムを100 °Cで1分間加熱してアセンブリを密閉します。加熱後、カバーガラスをそっと押し下げ、Valapで封入します。次に、長期イメージング用のPDMSカップを準備します。厚さ3 mmのPDMSスライスに、直径4 mmの穴を開けます。次に、PDMSスライスとPDMSコーティング済みのカバーガラスにコロナ処理を行います。処理後、これらを重ねて配置し、100 °Cで一晩ベイクします。液滴の形成を倒立明視野顕微鏡で観察します。脂質オイル相をプレッシャーコントローラーに接続し、ピークチューブからオイルの一滴が滴下するまで圧力を上げます。次に、ピークチューブをマイクロフルイディクスチップのインレット2に接続します。その後、インレット2から脂質オイル相を導入し、マイクロフルイディクスチップ内を完全に満たします。次に、インレット1からMRB-80ベースの水相を導入します。脂質オイル相と水相の圧力を調整して液滴サイズを制御し、直径約15µmの液滴を作製します。開始点としては、脂質オイル相を約800mbar、水相を200mbarに設定するのが適切です。目的の液滴サイズが得られたら、フローセルを液滴で完全に満たします。これらの液滴は、少量の水相を用いて形成されます。したがって、適切なサイズの液滴が形成される前に水相をすべて使い切らないよう、マイクロ流体セットアップを迅速に動作させる必要があります。充填後、Valapを用いてフローセルの両端を慎重に閉じます。液滴の移動が止まらない場合は、封止が不完全であるか、気泡が混入した可能性があります。長期的なイメージングを行う場合は、液滴をPDMSカップに移し、オイル脂質混合物層で被覆します。中心体を室温で融解し、微小管の適切な核形成を確実にするため、37°Cで20分間置きます。待機している間に、氷上でアッセイミックスを調製します。これには、チューブリン、GTP、酸素除去系、微小管架橋剤などの分子力発生装置、ATP、およびATP再生系を含める必要があります。混合後、冷却したAirfugeローターを用いて、30 psiで3分間サンプルを遠心分離します。次に、あらかじめ加熱しておいた中心体を混合物に加えます。液滴あたり1〜2個の中心体が含まれるように、添加する中心体の量を最適化してください。次に、この混合液を用いて、既報の手法でエマルション液滴を作製します。液滴の皮質にあるビオチン化脂質にダイニンのリクルートを誘導するため、水相にGFP-dynein TMRおよびストレプトアビジンを加えます。26 °Cで30分間静置した後、回転円盤共焦点顕微鏡を用いて微小管の伸展を可視化します。イメージング中、温度を28℃または30℃まで上げることで、微小管の伸長を促進させることができます。Z投影（Z-projection）を行う場合は、1 µm間隔でスタック撮影してください。これにより、ドロップレットあたり約20枚の画像が必要になります。メインカメラパネルに移動し、[Edit Z]をクリックして、Z Stepを1.0に設定してください。[Next]をクリックして設定を保存します。次に、AcquisitionパネルのCameraタブをクリックし、EM Gainバーを300までスライドさせて、最大線形EM Gainを設定します。その後、同じタブでExposure Timeを200 millisecondsに設定します。「Record」をクリックして設定を保存します。ライブイメージング実験では、露光時間を約100 millisecondsに短縮し、Z間隔を2 micronsに広げることで、2時間にわたり2分ごとにZ投影（Z Projections）を作成します。ライブイメージング実験では、サンプルの固定を最大化するため、通常のフローセルではなくPDMSカップを使用してください。記載されたプロトコルを用いて、中心体を含む水中油型エマルション液滴におけるアスター形成を検討しました。初期段階では、中心体は限定された体積内で自由に拡散します。約20～30分後、最初の微小管が可視化され、微小管が全方向に向かって皮質まで成長するにつれて、中心体の拡散が制限されます。微小管が液滴の直径の半分より長く成長すると、中心体は対向する境界まで押し出され、微小管は液滴の皮質に沿って成長します。ストレプトアビジンがない場合、ダイニーンは液滴内で拡散しています。しかし、ストレプトアビジンが存在すると、液滴形成から約10分以内に、ダイニーンがビオチン化脂質に結合します。皮質ダイニンが存在する状態で蛍光標識したチューブリンを観察すると、中心体を中心付近に位置していることが明確に分かります。一方、ダイニンが存在しない場合、中心体は液滴の反対側へと押しやられます。これは、ダイニンが微小管のカタストロフと皮質への牽引力を促進し、その結果としてアステルの中心への配置が導かれるためであると考えられます。このビデオを視聴することで、マイクロ流体技術を用いて球状のエマルション液滴内に紡錘体様構造を作成する方法を十分に理解することができます。習得すれば、適切に実施した場合、液滴の形成とイメージングを2〜3時間で完了させることが可能です。この手順を用いることで、他の紡錘体構成因子を封入し、それらが紡錘体の形態や配置に及ぼす影響を研究することができます。クロロホルムまたはPDMSを使用する際は、常に手袋を着用するなどの予防措置を講じてください。

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

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球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

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球状エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成