球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

この手順の全体的な目標は、油エマルジョン液滴中の水の幾何学的閉じ込め内で有糸分裂紡錘体様構造を再構成することです。この方法は、スピンドルの配置と組み立て方法、これらのプロセスに対する個々のコンポーネントの具体的な貢献度など、有糸分裂スピンドルアセンブリ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ボトムアップアプローチを使用して、有糸分裂細胞の形状を模倣する幾何学的な閉じ込め内で紡錘体様構造を再構成することです。

この方法は、細胞の閉じ込めに依存する他のプロセスの研究にも使用できます。PDMSプレポリマー10部と硬化剤1部を総質量約40gで混合します。その後、真空チャンバーに約30分間入れて気泡を取り除きます。

その間、型にアルミホイルを巻き付けて、直径4インチの深さ1センチのカップを作成します。準備ができたら、PDMSミックスの約3/4を型に流し込みます。その後、PDMSをさらに30分間真空チャンバーに戻します。

脱気後、PDMSを100°Cで1時間硬化させます。その間、スピンコーティング用のスライドガラスを圧縮空気でほこりを払い、準備します。次に、残りのPDMSミックスをスライド上にスピンコートします。

これらのスライドを摂氏100度で1時間硬化させ、PDMSを硬化させます。次に、かみそりの刃を使用してPDMSをそっと剥がし、PDMSストリップから必要な穴を開けてマイクロ流体チップを作成します。次に、コロナはマイクロ流体チップとPDMSコーティングされたスライドガラスを数秒間処理します。

最後に、チャネルを下にして各スライドガラスにマイクロ流体チップを置き、チップを摂氏100度で一晩焼きます。まず、クロロホルム洗浄ガラス器具を使用して、約250マイクログラムのクロロホルム溶解脂質を準備します。脂質混合物を不活性ガスで慎重に乾燥させます。

そして、それを真空チャンバーに1時間入れます。次に、脂質を鉱物油と2.5%の界面活性剤に溶解して、1ミリリットルあたり0.5ミリグラム、つまり約500マイクロリットルにします。脂質を完全に溶解するには、混合物を40キロヘルツで30分間超音波処理します。

次に、顕微鏡の対物レンズと一致する厚さのカバーガラスにPDMSをスピンコートします。次に、PDMSをスライドガラスにスピンコートします。次に、PDMSコーティングされたカバーガラスとスライドガラスを摂氏100度で1時間硬化させます。

次に、PDMSコーティングされたスライドガラス上に実験室用シーリングフィルムの薄いスライスを密接に間隔を空けてフローセルを作成します。3 mm のストリップを約 2 mm 離して配置します。次に、PDMSコーティングされたカバースリップでフローセルを覆い、フィルムを摂氏100度ですばやく1分間溶かしてアセンブリをシールします。

加熱したら、カバースリップをそっと押し下げ、Valapで密封します。次に、長期イメージング用のPDMSカップを準備します。厚さ 3 mm の PDMS に直径 4 mm の穴を開けます。

次に、PDMSスライスとPDMSコーティングされたカバーガラスをコロナ処理します。処理したら、それらを互いに重ねて置き、アセンブリを摂氏100度で一晩焼きます。倒立明視野顕微鏡で液滴の形成をモニターします。

脂質油相を圧力コントローラーに接続し、ピークチューブからオイルの滴が出るまで圧力を上げます。ピークチューブをマイクロ流体チップのインレット2に接続します。次に、インレット2からマイクロ流体チップを脂質油相で完全に充填します。

次に、入口1からMRB-80ベースの水相を導入します。脂質油相と水相の圧力を変化させることで液滴サイズを制御し、直径約15ミクロンの液滴を作ります。脂質油相は約800ミリバール、水相は200ミリバールが出発点として適しています。

目的の液滴サイズを取得したら、フローセルを液滴で完全に満たします。これらの液滴は、少量の水相を使用して形成されます。これは、正しいサイズの液滴が形成される前に水相全体を失わないように、マイクロ流体のセットアップを迅速に実行する必要があることを意味します。

充填したら、Valapを使用してフローセルの端を慎重に閉じます。液滴の動きが止まらない場合は、シールが完全でないか、気泡が混入している可能性があります。長期間のイメージングでは、液滴をPDMSカップに移し、油脂質混合物の層で覆います。

中心体を室温で解凍し、摂氏37度で20分間置いて、適切な微小管核形成を確保します。待っている間に、氷上でアッセイミックスを調製します。これには、チューブリン、GTP、脱酸素剤システム、微小管架橋剤などの分子力発生器、ATP、およびATP再生システムが含まれている必要があります。

混合したら、冷却したエアフュージローターでサンプルを30psiで3分間スピンダウンします。次に、予熱した中心体を混合物に加えます。液滴ごとに1つまたは2つの中心体を得るために、追加される中心体の量を最適化します。

次に、この混合物を使用して、前述のようにエマルジョン液滴を生成します。液滴皮質でダイニンをビオチン化脂質に動員するために、GFP-ダイニンTMRおよびストレプトアビジンを水相に含めます。スピニングディスク共焦点顕微鏡で、摂氏26度で30分後の微小管の成長を視覚化します。

イメージング中、微小管の成長は、温度を摂氏28度または30度に上げることで促進できます。Z投影の場合は、1ミクロン間隔でスタックを撮影しますが、これには液滴あたり約20枚の画像が必要です。メインカメラパネルに移動し、[Zの編集]をクリックして、[Zステップ]を1.0に設定します。

[次へ]をクリックして、設定を保存します。次に、Acquisition パネルの Camera タブをクリックし、EM Gain バーを 300 にスライドして、最大リニア EM ゲインを設定します。次に、同じタブで[露出時間]を200ミリ秒に設定します。

[記録]をクリックして設定を保存します。ライブイメージング実験では、露光時間を約 100 ミリ秒に短縮し、Z 間隔を 2 ミクロンに増やすことで、2 分ごとに 2 時間にわたって Z 投影を行います。ライブイメージング実験では、サンプルを最大限に固定するために、通常のフローセルの代わりにPDMSカップを使用します。

記載されたプロトコルを用いて、アスター形成を、セントロソームを含む水および油エマルジョン液滴中で研究した。最初は、中心体は閉じ込められたボリューム内で自由に拡散します。約20〜30分後、最初の微小管が見えるようになり、微小管が皮質に対して全方向に成長するため、中心体の拡散が制限されます。

微小管が液滴の直径の半分よりも長くなると、中心体は反対の境界に押し出され、微小管は液滴皮質に沿って成長します。ストレプトアビジンがないと、ジマインは液滴内で拡散します。しかし、ストレプトアビジンでは、液滴形成から約10分以内に、ダイニンがビオチン化脂質と結合します。

皮質ダイニンの存在下で蛍光チューブリンを見ると、中心体が中央に位置していることは明らかです。一方、ダイニンがない場合、中心体は液滴の反対側に押し出されます。これはおそらく、ダイニンが微小管の大惨事と皮質の引っ張り力を促進し、その結果、アスターがセンタリングされるためです。

このビデオを見れば、マイクロ流体技術を使用して球状エマルジョン液滴に紡錘状構造を作成する方法を十分に理解できるはずです。一度習得すれば、液滴形成とイメージングは適切に行えば2〜3時間で完了します。この手順を使用すると、他のスピンドルアセンブリ因子をカプセル化して、スピンドルの形態と位置決めへの影響を調べることができます。

クロロホルムやPDMSを使用する際は、手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。