球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

この手順の全体的な目的は、水中油型エマルション液滴の幾何学的閉じ込めの中で、有糸分裂紡錘体様構造を再構成することです。この手法は、紡錘体がどのように配置され組み立てられるか、また、個々の構成要素がこれらのプロセスにどのように具体的に寄与しているかなど、有糸分裂紡錘体の構築分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、有糸分裂細胞の形状を模倣した幾何学的閉じ込めの中で、ボトムアップアプローチを用いて紡錘体様構造を再構成できる点にあります。

この手法は、細胞の閉じ込め（cellular confinement）に依存する他のプロセスの研究にも利用可能です。PDMSプレポリマー10部と硬化剤1部を、合計質量約40 gになるように混合します。次に、気泡を除去するため、混合物を真空チャンバー内に約30分間置きます。

その間に、型にアルミホイルを巻き付け、直径4インチ、深さ1センチメートルのカップ状にします。準備ができたら、PDMS混合液の約3/4を型に注ぎます。その後、PDMSを再び真空チャンバーに戻し、さらに30分間脱気します。

脱気後、PDMSを100 °Cで1時間硬化させます。その間に、圧縮空気でホコリを取り除き、スピンコート用のガラススライドを準備します。その後、残りのPDMS混合液をスライド上にスピンコートします。

PDMSを硬化させるため、これらのスライドを100 °Cで1時間キュアします。次に、カミソリを使用してPDMSをゆっくりと剥離し、PDMSストリップに必要な穴をパンチしてマイクロ流路チップを作成します。その後、マイクロ流路チップとPDMSコーティングしたガラススライドを数秒間コロナ処理します。

最後に、各ガラススライド上にマイクロ流体チップをチャンネルが下を向くように配置し、100 °Cで一晩ベイクします。まず、クロロフォームで洗浄したガラス器具を用いて、クロロフォームに溶解させた脂質を約250 µg準備します。不活性ガスを用いて、脂質混合物を慎重に乾燥させます。

その後、真空チャンバー内に1時間置きます。次に、脂質をミネラルオイルと2.5%界面活性剤に溶解し、濃度を0.5 mg/mL（約500 µL）にします。脂質を完全に溶解させるため、混合物を40 kHzで30分間ソニケーションします。

次に、顕微鏡対物レンズに適合する厚さになるように、カバーガラスにPDMSをスピンコートします。続いて、ガラススライドにもPDMSをスピンコートします。そして、PDMSをコートしたカバーガラスとガラススライドを100 °Cで1時間キュアします。

次に、ラボ用シーリングフィルムを薄く切り出し、PDMSコーティングを施したガラススライド上に密接に配置してフローセルを作製します。3 mm幅のストリップを約2 mm間隔で配置してください。その後、フローセルをPDMSコーティング済みのカバースリップで覆い、フィルムを100 °Cで1分間加熱してアセンブリを密閉します。

加熱後、カバーガラスをそっと押し下げ、Valapで封入します。次に、長期イメージング用のPDMSカップを準備します。厚さ3 mmのPDMSスライスに、直径4 mmの穴を開けます。

次に、PDMSスライスとPDMSコーティング済みのカバーガラスにコロナ処理を行います。処理後、これらを重ねて配置し、100 °Cで一晩ベイクします。液滴の形成を倒立明視野顕微鏡で観察します。

脂質オイル相をプレッシャーコントローラーに接続し、ピークチューブからオイルの一滴が滴下するまで圧力を上げます。次に、ピークチューブをマイクロフルイディクスチップのインレット2に接続します。その後、インレット2から脂質オイル相を導入し、マイクロフルイディクスチップ内を完全に満たします。

次に、インレット1からMRB-80ベースの水相を導入します。脂質オイル相と水相の圧力を調整して液滴サイズを制御し、直径約15µmの液滴を作製します。開始点としては、脂質オイル相を約800mbar、水相を200mbarに設定するのが適切です。

目的の液滴サイズが得られたら、フローセルを液滴で完全に満たします。これらの液滴は、少量の水相を用いて形成されます。したがって、適切なサイズの液滴が形成される前に水相をすべて使い切らないよう、マイクロ流体セットアップを迅速に動作させる必要があります。

充填後、Valapを用いてフローセルの両端を慎重に閉じます。液滴の移動が止まらない場合は、封止が不完全であるか、気泡が混入した可能性があります。長期的なイメージングを行う場合は、液滴をPDMSカップに移し、オイル脂質混合物層で被覆します。

中心体を室温で融解し、微小管の適切な核形成を確実にするため、37°Cで20分間置きます。待機している間に、氷上でアッセイミックスを調製します。これには、チューブリン、GTP、酸素除去系、微小管架橋剤などの分子力発生装置、ATP、およびATP再生系を含める必要があります。

混合後、冷却したAirfugeローターを用いて、30 psiで3分間サンプルを遠心分離します。次に、あらかじめ加熱しておいた中心体を混合物に加えます。液滴あたり1〜2個の中心体が含まれるように、添加する中心体の量を最適化してください。

次に、この混合液を用いて、既報の手法でエマルション液滴を作製します。液滴の皮質にあるビオチン化脂質にダイニンのリクルートを誘導するため、水相にGFP-dynein TMRおよびストレプトアビジンを加えます。26 °Cで30分間静置した後、回転円盤共焦点顕微鏡を用いて微小管の伸展を可視化します。

イメージング中、温度を28℃または30℃まで上げることで、微小管の伸長を促進させることができます。Z投影（Z-projection）を行う場合は、1 µm間隔でスタック撮影してください。これにより、ドロップレットあたり約20枚の画像が必要になります。メインカメラパネルに移動し、[Edit Z]をクリックして、Z Stepを1.0に設定してください。

[Next]をクリックして設定を保存します。次に、AcquisitionパネルのCameraタブをクリックし、EM Gainバーを300までスライドさせて、最大線形EM Gainを設定します。その後、同じタブでExposure Timeを200 millisecondsに設定します。

「Record」をクリックして設定を保存します。ライブイメージング実験では、露光時間を約100 millisecondsに短縮し、Z間隔を2 micronsに広げることで、2時間にわたり2分ごとにZ投影（Z Projections）を作成します。ライブイメージング実験では、サンプルの固定を最大化するため、通常のフローセルではなくPDMSカップを使用してください。

記載されたプロトコルを用いて、中心体を含む水中油型エマルション液滴におけるアスター形成を検討しました。初期段階では、中心体は限定された体積内で自由に拡散します。約20～30分後、最初の微小管が可視化され、微小管が全方向に向かって皮質まで成長するにつれて、中心体の拡散が制限されます。

微小管が液滴の直径の半分より長く成長すると、中心体は対向する境界まで押し出され、微小管は液滴の皮質に沿って成長します。ストレプトアビジンがない場合、ダイニーンは液滴内で拡散しています。しかし、ストレプトアビジンが存在すると、液滴形成から約10分以内に、ダイニーンがビオチン化脂質に結合します。

皮質ダイニンが存在する状態で蛍光標識したチューブリンを観察すると、中心体を中心付近に位置していることが明確に分かります。一方、ダイニンが存在しない場合、中心体は液滴の反対側へと押しやられます。これは、ダイニンが微小管のカタストロフと皮質への牽引力を促進し、その結果としてアステルの中心への配置が導かれるためであると考えられます。

このビデオを視聴することで、マイクロ流体技術を用いて球状のエマルション液滴内に紡錘体様構造を作成する方法を十分に理解することができます。習得すれば、適切に実施した場合、液滴の形成とイメージングを2〜3時間で完了させることが可能です。この手順を用いることで、他の紡錘体構成因子を封入し、それらが紡錘体の形態や配置に及ぼす影響を研究することができます。

クロロホルムまたはPDMSを使用する際は、常に手袋を着用するなどの予防措置を講じてください。