油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

この油中水型エマルジョン遠心分離法の全体的な目標は、薄層の巨大小胞を簡単に調製することです。この方法は、巨大な小胞に基づく人工細胞の作成など、合成生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を開始するには、DOPC の 25 ミリモル原液とテキサス レッド DHPE のゼロポイント 2 ミリモル原液をクロロホルムで調製します。

次に、DOPCとTexas Red DHPEストック溶液の混合物を流動窒素ガス下で蒸発させることにより、5ミリリットルのガラスバイアルの内面に脂質膜を形成します。フィルムを減圧下で一晩インキュベートした後、バイアルに1ミリリットルの流動パラフィンを加えます。バイアルをアルミホイルで包み、混合物を摂氏80度で一晩インキュベートします。

1点5ミリリットルの蓋付きマイクロチューブミックスで、237点5マイクロリットルの1マイクロメートルの非蛍光マイクロスフェアと12ポイント5マイクロリットルの1マイクロメートルの蛍光マイクロスフェアを混ぜ合わせます。次に、64ミリグラムのスクロースを追加し、続いて1モルトリス緩衝液125マイクロリットルと875マイクロリットルの脱イオン水をマイクロチューブに追加します。混合物を30秒間ボルテックスし、次いで10分間超音波処理する。

10ミリリットルのトリス緩衝溶液を調製した後、1ミリリットルを1ポイント5ミリリットルの蓋付きマイクロチューブに入れます。溶液をボルテックスして超音波処理したら、1ミリリットルの油溶液と300マイクロリットルの内部水溶液を1点5ミリリットルのマイクロチューブで混合します。室温で2分間、10, 000rpmで作動する機械式ホモジナイザーを使用して、マイクロチューブ内の2つの成分を乳化します。

次に、1点5ミリリットルの蓋付きマイクロチューブに、4°Cで外側の水溶液1ミリリットルの上面に300マイクロリットルの油中水型エマルジョンを穏やかに重ねます。マイクロチューブを10分間冷却した直後に、混合物をGの18,000倍で30分間遠心分離します。終了したら、マイクロチューブの底にプッシュピンで穴を開け、滅菌した1ポイント5ミリリットルのマイクロチューブに1つの液滴を集めて、沈殿した巨大な小胞またはGVを取得します。

NC 2ポリメラーゼ連鎖反応およびハイブリダイゼーション用の接着インキュベーションチャンバーを顕微鏡カバーガラスの上に置きます。マイクロピペットを使用して、希釈した沈殿GVの25マイクロリットルを標本領域に沈着させ、すぐにインキュベーションチャンバーの上部にゼロポイント1 5ミリメートルの厚さのカバーガラスを置きます。小胞の顕微鏡画像を記録した後、まずUFBNAおよびUFMCHE蛍光ミラーユニットを顕微鏡に挿入して蛍光顕微鏡検査を行います。

次に、ユニットに励起フィルターと発光フィルターを取り付けて解析します。油中水型法の成功を左右する最も重要な要因は、遠心分離中にGVが沈殿するように、内側の水溶液の比重が外側の水溶液の比重よりも大きくなければならないことです。微分干渉顕微鏡法および蛍光顕微鏡法により、マイクロスフェアを使用しないGVとマイクロスフェアを有するGVの合成法により、低ラメラリティのGVが形成されることが確認されました。

得られた160のGVのうち、55のカプセル化されたマイクロスフェアと105のマイクロスフェアが空であり、カプセル化の比率は34%でした。GV中のミクロスフェアの体積分率は、約11±3体積パーセントと推定され、計算された体積分率の精度は10〜30%であった:同じ外部水溶液を使用して他の材料を100モルパーセントのDOPC GVにカプセル化し、示差干渉顕微鏡法および蛍光顕微鏡法によって示されるように、同じプロトコルが成功した。この手順に続いて、モデル化された細胞の解明などの追加の質問に答えるために、フローサイトメトリーなどの他の方法を実行できます。

このビデオを見れば、カプセル化された材料で巨大な小胞を調製する方法をよく理解できるはずです。