Name: イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶイメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け。接着法と磁気分離法の二つの単球分離プロトコルを比較し、生存率と表面マーカー発現を評価する方法です。

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この研究は、国立アルコール乱用・アルコール依存症研究所のK99/R00 AA021264の支援を受けています。スタートアップパッケージの一部として、免疫学部、神経免疫薬理学研究所、ハーバート・ヴェルトハイム医科大学、FIU(研究経済開発局)から追加のラボ支援を受けています。Gianna Casteleiro は NIH/NIGMS R25 GM061347 の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

全体的にヒト血液の研究をレビューし、IRBプロトコル承認＃のIRB-13から0440 FIUの治験審査委員会（IRB）によって承認されています。ヒトロイコパックは、マイアミ、フロリダ州のコミュニティ血液バンクから購入しました。 標準的な密度勾配法によるPBMCの1の単離<ol><li> T75フラスコ中の1×リン酸緩衝生理食塩水で血液の1希釈：1を実行します。 </li><li>ピペット注意深く15 50mlの遠心分離チューブに密度勾配溶液のmlおよび層 - この傾斜以上希釈血液の（25〜30ミリリットル/チューブ）。 </li><li> 1の加速と0の減速で1200×gで20分間遠心します。 </li><li>遠心分離後、新しい50mlの遠心分離チューブに界面層（白血球）を収集し、PBSで2回（1,080×gで3分間）で細胞を洗浄します。毎回上清捨てます。 </li><li>塩化アンモニウム - カリウム溶解（ACK）緩衝液で細胞を治療する（赤血球を溶解するために）。バッファのとで10ミリリットルを追加します。4℃で15分間cubate。 </li><li> 、PBSで2回細胞を洗浄1080×gで3分間遠心分離し、上清を毎回捨てます。 </li><li> PBMCをを含んでなる、ペレットを保存します。 </li><li>選択した単球の精製方法に進みます。 </li></ol>アドヒアランス法による2.単球精製<ol><li> L-グルタミン（300 mg / mlで）を含有する完全な細胞培養培地を準備し、ペニシリン（50 U / ml）を-streptomycin（50μg/ ml）および10％ウシ胎児血清を補充しました。 </li><li> PBMCを、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で、完全培地10mlあたり5×10 7細胞の濃度で、T75フラスコ中でそれらを培養することにより、約2時間接着させます。 </li><li>インキュベーション後、培養フラスコからの非付着、浮遊細胞を除去し、穏やかにPBSで2回付着細胞を洗浄します。 </li><li>ヒト顆粒-MACRを2μl/ mlを添加した完全細胞培養培地中で接着細胞をインキュベート10μg/ mlのストック濃度で保存ophageコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）。 </li><li>培地の半分を変更し、サイトカインごとに48時間を補充します。 </li><li> MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。 </li></ol>磁気分離法による3単球の精製<ol><li>標準的な密度勾配技術からのPBMCを収集し、細胞/ mlの濃度でPBS緩衝液中の5 mlのポリスチレンチューブに注ぎ、再懸濁します。 </li><li> 、50μlの/ mlの細胞を用いたヒト単球濃縮カクテルを追加し、よく混ぜ、10分間4℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、50μlの/ mlの細胞を用いて磁性粒子を追加し、よく混ぜ、5分間4℃でインキュベートします。 </li><li> PBS緩衝液を添加することにより、2.5ミリリットルの全体積に細胞懸濁液を起動し、ピペッティングにより2ダウンよく混ぜる - 3回。 </li><li>磁気デバイスにキャップなしでポリスチレンチューブを置き、2 RTで取っておきます。5分。 </li><li>インキュベーションの後、連続した1つの動きで、磁石をピックアップし、クリーン50ミリリットルの遠心分離管に目的の精製された単球画分を注ぎます。 </li><li> 10μg/ mlのストック濃度で保存されたヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）を2μl/ mlを補充した完全細胞培養培地中で接着細胞を培養します。 </li><li> 48時間ごとに、培地の変更の半分は、新しいメディア（cRPMI中）およびサイトカインで5分間、1080×gでスピンダウンし、再サスペンドペレット。 </li><li> MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。 </li></ol> 4.トリパンブルー排除生存率アッセイ 注：PBMCを、単球、およびMDDCsの細胞収率および生存率を得るために、この技術を使用してください。 <ol><li>標準トリプシン-EDTAを用いてフラスコ及びPBSを用いて細胞ペレットの洗浄を行い、収穫細胞。ペレットの大きさに応じて、再ペレットを溶解するためにPBSの5〜10ミリリットルに懸濁。 </li><li>希釈した細胞ペレットとトリパンブルー試薬の1希釈：マイクロ遠心管では、1を実行します。 </li><li>このミックスから、アリコート10μlの細胞計数スライドにし、製造業者のプロトコルに従って自動細胞カウンターを使用して結果を読み取ります。自動細胞カウンターを使用できない場合は、同様の細胞数は、血球計または手動カウンターを使用して可能です。 </li></ol> 5. MTTアッセイ<ol><li> 96ウェルプレート中の完全培地4×10 4個 /100μlの濃度でプレートの細胞を各ウェルに。細胞が培養液に調整するための24時間を許可します。 </li><li>インキュベートし、それぞれ0（0日）、36（3日目）および84（7日目）時間で読み取りを行います。 </li><li>希望のインキュベーションの終了時に、メディアを取り出し、単独で100μlのPBSと交換してください。 </li><li> 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（MTT）（5mg / ml）をdimethを10mlを添加することにより調製しますドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を1gにイルスルホキシド（DMSO）。 </li><li>各ウェルにMTT溶液10μl（5 mg / mlで）を追加し、さらに2時間37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、PBSおよび未変換MTT混合物（黄色液）を含有する上清を除去します。 </li><li>各ウェルにSDS-DMSO溶液100μlを加え、さらに1時間インキュベートします。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて540 nmの吸光度を読みます。 </li></ol> 6.細胞表面イメージングフローサイトメトリーによる染色分析<ol><li>精製した単球からの分化の7日後に1.5 mlチューブの適切な数への単球由来樹状細胞の1×10 6細胞のアリコートを分配します。 </li><li>熱不活性化50μlの（HI）ヒト血清を用いてブロッキング細胞による細胞表面染色を開始し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、5分間720×gで遠心分離細胞は、上清を捨てます。 </li><li>セルPELLEへtは、それぞれの蛍光標識抗体（ 例えば、抗CD11cのまたは抗CD14）を追加し、光から保護し、20分間4℃でインキュベートします。彼らは、補償のために必要とされているので、別々のチューブでは、）は、単一の蛍光色素染色したサンプル/ mlのを準備します。 </li><li>インキュベーション後、5分間720×gでPBS緩衝液遠心1mlの各時間で細胞を2回洗浄します。 </li><li>光から保護された細胞を維持、フローサイトメトリー分析のための細胞/ 100μlの濃度でPBS緩衝液中に再懸濁します。 </li><li>生存細胞上にゲートするためには、事前の製造元の指示に従った器具サイトメトリ単一細胞イメージングフローに細胞を取得する各チューブにDAPIの1μlを添加します。 </li></ol> 7.統計分析<ol><li>入力スプレッドシート内のすべてのデータ。 </li><li>必要に応じてスチューデントのt検定および/または一方向ANOVAを使用して結果を比較してください。 </li><li> p &lt;0.05の場合の差は統計的に有意であると考えてみましょう。 </李&gt; </ol>

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<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

すべての著者は、競合する金銭的利益を開示していません。

単離したヒト血液からMDDCsを生成する既知の難しさに基づいて、本研究はMDDCsを生成するための2つのよく確立された方法の総合的な比較を提供することを目的としました。比較第一の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を活用することによってMDDCsを生成するための十分に確立された伝統的な方法です。付着方法は、迅速かつ費用効果的であり、複雑な装置の使用を必要としません。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、単球過渡操作22,30,31が含まれます。比較して第二の別の方法は、ネガティブ選択によりPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キット26を使用して、全末梢血単核細胞（PBMC）からの単球の磁気分離です。この分離方法の利点は、不要な細胞であります標識した標的細胞を自由に列を必要とせずに直接抗体で細胞を標的とすることなく、新たなチューブに注ぎ出している間に磁石を用いて分離されます。かかわらず（磁気分離対付着）単球の単離方法の、両方の手順の後に、プロトコル内の重要な...

樹状細胞（DC）は、先天性および適応免疫系の重要なメディエーターです。それらは、一次免疫応答を誘導し、免疫記憶の発達を促進するように機能します。これらの細胞は、抗原捕捉、移動およびT細胞刺激の主な原因であり、したがって、DCの.Manipulation異なる治療するための研究分野の広範囲にわたって、臨床設定で利用できる1とプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）と呼ばれますそのようなHIV 6,7、癌8などの炎症性疾患、自己免疫疾患9、およびアレルギー応答10。 DCはまた、アルコール依存11-14、薬物依存13,15、及びHIV感染および物質乱用16-19の組み合わせに関連するものなどの未知のメカニズムおよび経路を解決するために、薬物乱用の研究に使用されています。これらの継続的な研究と今後の調査研究Inは免疫学の分野は、研究のために非常に重要なDCの試験管内世代で行います。総血単核細胞20の1％ -しかし、彼らは0.1を構成するように、ヒトの血液からのDCの単離に関連するいくつかの困難があります。 現在までに、樹状細胞のインビトロ生成のための十分に確立された方法のいくつかは、22の選別、磁気活性化細胞、蛍光活性化セルソーティングとして単球21,22のプラスチックまたはガラス付着、密度勾配遠心分離23、特定のマーカーに基づく分離で構成され24、デキストラン被覆磁性ナノ粒子25、および完全に自動化された負の細胞選択26を使用して高度に精製された単球の迅速な単離を使用して、CD14 +単球の陽性選択。しかし、選択の最良の方法は、議論の余地が。したがって、DCの生成技術を改善するために、いくつかの方法は、開発されていますこれらの細胞の純度が大きく、末梢血単核細胞（PBMC）27から単離され精製されたCD34 +前駆細胞と単球から分化により増加させることができます。前に述べたように、単球由来樹状細胞（MDDCs）を生成するために広く使用され、人気の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を探ることです。付着方法は、複雑な装置の使用を必要としない迅速かつ簡単な方法です。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、および単球過渡操作28を含みます。付着方法に代わる方法としては、特にネガティブ選択26によってPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キットを使用して、総PBMCから単球の磁気分離です。この手順の間、不要な細胞には、四量体による除去の対象とされています抗体複合体とデキストラン被覆磁性粒子。この分離方法の利点は、不要な標識された細胞は、標的細胞が自由に列を必要とすることなく、新たなチューブに注ぎ出しすることができるが、磁石を用いて分離されることです。現在までに、ユニークな細胞集団にラベルを付けることができ、特定のモノクローナル抗体の利用可能性と、磁気分離技術は、単に追加の方法が、免疫学の分野では珍しい細胞の単離の必要はないとなっています。例えば、市販の常磁性MACS-ナノ粒子とソーティングなど磁気細胞などの技術は、研究と臨床応用22,29のための新たなアプローチの開発を促進しました。さらに、単球の接着およびMACS技術方法からDCの生成を比較した最近の調査研究は、単球22,30分離MACSを使用して、より高いDC純度および生存率を示しました。 現在の研究のプレゼント市販のヒト単球濃縮キットを使用してネガティブ選択により付着および2）単球の単離によって1）単球の単離：PBMCから単離した単球からのヒトDCの生成のための2つの方法の間の比較。この研究は、接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を単離するためのネガティブ選択磁気分離手順は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成することを示す証拠を提供します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。それは同時に、増殖およびCD11cに分化することができる単球を生成するために、両方の技術の能力を実証するため、全体的に、現在の研究では、+上で参照した以前の研究とは異なり彼らの生存能力を損なうことなく、培養中7日後MDDCs（&gt; 70％）。また、現在のアプローチは、フローサイトメトリーを撮像して異なるのCD11c / CD14 MDDCs集団の初回の特徴付けを提供します。 DCは免疫学の分野の研究について焦点役割を果たしているので、それらが誘導されている方法を検討し、どのような方法は、 インビトロでそれらを分離し、培養するために使用されている場合要約すると、異なるパラメータを考慮しなければなりません。そこで、本研究では、二つの異なる単球の単離の方法とどのようにこれらの方法は差動で、最終的に、樹状細胞の生存率、増殖、および表現型に影響を与える単球の生存率および収量に影響を与えるの洞察を提供することを目的とします。これらの知見は、免疫学の分野に大きく貢献するとDCの単離、精製、およびキャラクタリゼーションの詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>RTで使用する必要があります</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep buffer</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト単球濃縮キット</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン(0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2マルチモードリーダーBiotek</td><td></td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTTナトリウム塩バイオ試薬(XTT)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシドバイオ試薬(DMS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド(MTT)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>フェナジンメトサルフェート (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>不活化 (HI) ヒト血清</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

樹状細胞(DC)は、リンパ球の反応、宿主防御機構、および炎症の病因に重要な役割を果たす免疫系の抗原提示細胞です。DCの分離と研究は、その独特の特徴から、生物学研究において重要でした。DCは免疫系の重要なメディエーターですが、血液中では非常にまれであり、全血液単核細胞の約0.1〜1%を占めています。したがって、単離法の代替手段は、末梢血単核細胞(PBMC)から単離された単球からのDCの分化に依存しています。簡便性、手頃な価格、高純度、高収率の細胞を組み合わせた適切な単離技術の利用は、検討することが不可欠です。現在の研究では、DC の生成に関する 2 つの異なる方法が比較されます。単球は、接着によって選択されるか、磁気分離手順を使用して負に濃縮され、その後IL-4およびGM-CSFでDCに分化しました。単球およびMDDCの生存率、増殖、および表現型は、生存率色素、MTTアッセイ、およびイメージングフローサイトメトリーによるCD11c / CD14表面マーカー分析を使用して評価されました。磁気分離法は、接着法と比較して、増殖能の高い単球の割合が有意に高かったが、この知見は、両技術が同時に増殖し、培養中の7日間後に生存可能なCD11c+ MDDCに分化する単球を生成する能力を実証した。どちらの方法も>70%のCD11c+ MDDCをもたらしました。したがって、私たちの結果は、ヒトDCの分離と特性評価のための信頼性の高い方法の開発に貢献する洞察を提供します。

<html> 磁気分離により単球の収量は遵守法による単球の収量に比べて高いです PBMCおよび単球の分離の分離の日にトリパンブルー排除法により図1の表示PBMCおよび単球細胞数で示されたデータ。磁気分離により単離された単球がPBMCの最大25％を占めながら、平均して、接着方法によって単離された単球は、全PBMCの約6.2％を占めました。統計分析は、磁気分離により得られた単球の割合が著しく高い（≥4倍）​​であることを明らかにしました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法（0.0005≤p）を比較する場合、単球の収量の有意な差が認められた検定スチューデントのtを使用して統計分析。 1 &quot;&gt; 単球の単離順守によって、および磁気分離によって単球生存率に影響を与えません ：「キ...

この研究では、in vitro樹状細胞(DC)を得るためのヒト単球単離の2つの異なる方法を比較しています。単球は接着によって選択されるか、磁気分離によって負に濃縮されます。単球の収量と生存率、および MDDC 生存率、増殖、および CD11c/CD14 表面マーカーの発現を両方の方法間で比較します。

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

本研究の目的は、in vitroでの樹状細胞生成に向けた2種類の異なるヒト単球分離法を比較し、得られた単球由来細胞集団のCT11cおよびCT14の細胞表面発現をイメージングフローサイトメトリーによって特性解析することです。これらの単球分離プロトコルは、研究および臨床応用のためのヒト樹状細胞精製における信頼性の高い手法の開発に寄与します。これらのプロトコルの主な利点は、ヒト単球の分離と、それに続く生存能および機能を有する単球由来細胞への分化を容易にできる点にあります。さらに、本研究は、シングルセルイメージングフローサイトメトリーを用いて、単球由来樹状細胞の特定の集団を特性化した初めての研究です。この手法は、下流の研究アプリケーションに十分な収量で他の希少細胞を単離するための代替手段としても適用可能です。適切な指示と経験なしに血液サンプルを安全に取り扱うことは困難であるため、これらの手法を視覚的に提示することは極めて重要です。まず、T75フラスコ内で血清サンプルをPBSで1:1の比率に希釈します。次に、50 mL遠心チューブに密度勾配溶液を15 mL加え、その上に希釈した血液を25〜30 mL、慎重に重層させます。末梢血単核細胞を適切に分離させるため、層が混ざり合わないよう、迅速かつ慎重に血液を密度勾配溶液に重層させてください。遠心分離により細胞を分離し、白血球の界面層を新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。細胞をPBSで2回洗浄し、最終的なペレットを10 millilitersの塩化アンモニウムカリウム溶血緩衝液に再懸濁し、4 degrees celsiusで15分間置きます。その後、細胞をさらに2回PBSで洗浄します。接着法により単球を単離するには、得られたPBMCペレットから5×10⁷個の細胞を、完全培地10 mLと共に新しいT75フラスコに入れ、加湿インキュベーター内（37 °C、5% CO₂）で2時間培養します。インキュベーション終了後、非接着の浮遊細胞を除去し、接着細胞をPBSで2回静かに洗浄します。その後、ヒトGMCSFおよびIL4を添加した完全細胞培養培地を接着細胞に添加し、インキュベーターに戻して5〜7日間培養します。磁気分離により単球を単離するため、密度勾配遠心法でPBMCを回収した後、白血球層を5 mLのポリスチレンチューブに移し、PBSを用いて5 × 10⁷ cells/mLの濃度で細胞を再懸濁します。次に、細胞1 mLあたり50 µLのヒト単球濃縮カクテルを加えて混合し、4 °Cで10分間インキュベートします。その後、細胞1 mLあたり50 µLの磁気粒子を慎重に加えて混合し、4 °Cで5分間インキュベートします。2回目のインキュベーション終了後、PBSを細胞に加え、全量を2.5 mLとしてピペッティングで2〜3回混ぜ合わせます。次に、ポリスチレンチューブを室温で適切な磁気デバイスに設置します。2.5分後、チューブをマグネットに置いたまま、精製された単球分画を新しい15 mLコニカルチューブにデカントします。次に、精製した単球を、先に示した通り、GMCSFおよびIL4を添加した完全細胞培養培地で5〜7日間培養します。7日間の分化後、単球由来樹状細胞を1×10⁶個ずつ適切な数の1.5mLチューブに分注し、非特異的結合をブロックするために、各サンプルに熱不活化ヒト血清50µLを加えます。10分後、細胞を遠心分離し、ペレットを適切な蛍光標識一次抗体で再懸濁し、遮光下、4°Cで20分間反応させます。次に、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄し、細胞1×10⁶個あたり100 µLのPBSでペレットを再懸濁します。解析の直前に、各チューブに1 µLのDAPIを添加します。その後、製造者の指示に従い、シングルセルイメージングフローサイトメーターでサンプルを測定します。平均して、接着法で単離された単球は末梢血単核球（PBMC）全集団の約6.2%を占めるのに対し、磁気分離法で単離された単球はPBMC全集団の最大25%を占めます。いずれの方法で単離された単球も生存率は同等です。両方の方法で精製された単球から分化させたMDDCは、まず全単一細胞からDAPI陰性または生存細胞に基づいてゲートをかけ、続いて各細胞集団のゲーティングを行いました。どちらの分離方法においても、CD14陽性細胞群は低割合であり、CD11c陽性細胞群の総数は高割合であった。すべてのCD11c陽性細胞に対してさらに表現型解析を行ったところ、磁気分離法ではCD11c陽性かつCD14陽性の二重陽性細胞の割合が高かったが、この効果は接着法と比較して有意ではなかった。これらのCD11c陽性、CD14陽性の二重陽性細胞は、単球マーカーであるCD14がまだ消失していない、分化初期段階のMDDCである可能性がある。単一のCD11c陽性細胞を解析したところ、接着法によってCD11c陽性かつCD14陰性細胞を最も高い収率で得られました。これらの単一陽性細胞は、分化後期のMDDCである可能性があります。習熟すれば、適切に実施することで、接着法は3〜4時間、磁気分離法は1〜2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、培地を補充するたびに48時間ごとに新鮮な樹状細胞分化サイトカインを用意することが重要です。血液などのバイオハザード流体を扱うことは非常に有害である可能性があるため、これらの操作を行う際は常に適切な個人用保護具の使用と廃棄方法を遵守してください。本研究は、免疫学分野の研究者が治療目的でヒト単球および樹状細胞を利用することを検討するための道を開くものです。このビデオを視聴することで、in vitroでさまざまな単球由来細胞集団を生成するためのヒト単球分離の最適化方法について、十分に理解することができます。

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

ここでは、ヒトの抗凝固血液の密度勾配遠心分離後に、末梢血単核細胞からの磁気ビーズ分離によって単球がどのように単球を単離されるかを示します。5日間のインキュベーション後、ヒト単球は未成熟樹状細胞に分化し、非臨床環境での実験手順の準備が整います。...

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

ここで全血フローサイトメトリーによる単球サブセットを特徴付けるためのプロトコルを提案する.これには、サブセットのゲートおよび表面マーカーの発現を評価する方法を概説し、(炎症性) M1 と M2 マーカー (抗炎症)...

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro...

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。...

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。...

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

シアリダーゼ処理を使用して、単離された末梢血単核細胞(PBMC)から脱シアル化ヒト単球由来樹状細胞(mo-DC)を生成するための独自の包括的なプロトコルが提示されます。さらに、mo-DCの表現型および機能特性を評価し、シアリダーゼ処理がmo-DCの成熟レベルをどのように改善するかを評価する方法が記載されている。...

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

薬理学的薬剤がナイーブ単球由来樹状細胞からin vitro...

ヒトCD14+ 単球から寛容性樹状細胞を作製するための免疫調節剤を試験するための簡便で効率的な方法

学ぶイメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け。接着法と磁気分離法の二つの単球分離プロトコルを比較し、生存率と表面マーカー発現を評価する方法です。

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

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