イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

この研究の全体的な目標は、in vitro で樹状細胞を生成するためのヒト単球単離の 2 つの異なる方法を比較し、イメージング フロー サイトメトリーによって得られた単球由来集団の CT11c、CT14 細胞表面発現を特徴付けることです。これらの単球単離プロトコルは、研究および臨床応用のためのヒト樹状細胞の精製のための信頼性の高い方法の開発に貢献することができます。これらのプロトコルの主な利点は、ヒト単球の単離および生存可能で機能的な単球由来細胞への分化を促進することです。

さらに、これは、シングルセルイメージングフローサイトメトリーによって単球由来樹状細胞の特定の集団を特徴付ける最初の研究です。この方法は、他の希少細胞を適切な収量で単離するための代替手段としても適用できます。これらの方法を視覚的にデモンストレーションすることは、適切な指導と経験なしに血液サンプルを安全に取り扱うことが難しい場合があるため、非常に重要です。

まず、血液サンプルをT75フラスコでPBSと1対1の比率に希釈します。次に、15ミリリットルの密度勾配溶液を50ミリリットルの遠心分離チューブに加え、希釈した血液の25〜30ミリリットルを勾配上に慎重に重ねます。末梢血単核細胞を適切に分離するには、血液を密度勾配溶液に迅速に、しかし慎重に、層を混合せずにロードします。

遠心分離によって細胞を分離し、続いて白血球界面層を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。細胞をPBSで2回洗浄し、最終ペレットを10ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解緩衝液に摂氏4度で15分間再懸濁します。次に、PBSで細胞をさらに2回洗浄します。

付着法により単球を単離するために、得られたPBMCペレットの7つの細胞に対して、完全な培地10ミリリットルあたり10の5倍を新しいT75フラスコで37°Cおよび5%の二酸化炭素で加湿インキュベーター内で2時間培養する。インキュベーションの終了時に、非接着性の浮遊細胞を廃棄し、接着細胞をPBSで2回穏やかに洗浄します。次に、接着細胞にヒトGMCSFとIL4を添加した完全細胞培養培地を投入し、培養物をインキュベーターに5〜7日間戻します。

磁気分離により単球を単離するためには、密度勾配分離によりPBMCを採取した後、白血球層を5ミリリットルのポリスチレンチューブに移し、PBS中の細胞を1ミリリットルあたり10〜7細胞の濃度の5倍で再懸濁する。次に、1ミリリットルあたり50マイクロリットルのヒト単球濃縮カクテルを細胞に加え、混合して細胞をカクテルと摂氏4度で10分間インキュベートします。次に、細胞1ミリリットルあたり50マイクロリットルの磁性粒子を慎重に混合し、細胞を摂氏4度で5分間インキュベートします。

2回目のインキュベーションの終わりに、PBSを細胞に添加して総量を2ポイント5ミリリットルにし、ピペッティングを2〜3回行って混合します。次に、ポリスチレンチューブを室温の適切な磁気装置に入れます。2分半後、チューブを磁石に入れたまま、精製した単球画分を新しい15ミリリットルの円錐形チューブにデカントします。

次に、精製した単球と、GMCSFとIL4を添加した完全な細胞培養培地を、先ほど示したように5〜7日間培養します。分化の7日後、単球由来樹状細胞の6つの細胞分注に1回10を適切な数の1ポイント5ミリリットルチューブに分注し、各サンプルに50マイクロリットルの熱不活化ヒト血清を加えて、非特異的所見をブロックします。10分後、細胞を遠心分離し、光から保護された摂氏4度で20分間、適切な蛍光標識一次抗体にペレットを再懸濁します。

次いで、細胞を1ミリリットルのPBSで2回洗浄し、ペレットを1×10個につき10個のPBSで6個の細胞に再懸濁する。分析の直前に、各チューブに1マイクロリットルのDAPIを追加します。次に、製造元の指示に従って、シングルセルイメージングフローサイトメーターでサンプルを読み取ります。

平均して、アドヒアランス法によって単離された単球は、総末梢血単球細胞(PBMC)集団の約6.2%を占め、磁気分離によって単離された単球は、総PBMCの最大25%を占めます。どちらの方法でも単離された単球は、同等に生存可能です。両方の方法で精製された単球から分化したMDDCは、最初に全単一細胞からのDAPI陰性細胞または生存細胞に基づいてゲーティングされ、続いて各細胞集団のゲーティングが行われました。

どちらの単離方法も、単一のCD14陽性集団は低く、両方の方法が高総CD11c陽性集団をもたらした。さらなる表現型解析を全てのCD11c陽性細胞について行い、磁気的単離により二重陽性CD11c陽性CD14陽性細胞の割合が高かったにもかかわらず、この効果はアドヒアランス法と比較した場合には有意ではなかった。これらの二重陽性CD11c陽性、CD14陽性細胞は、CD14単球マーカーをまだ低下させていない初期段階の分化型MDDCであってもよい。

単一のCD11c陽性細胞を分析する場合、接着法はCD11c陽性細胞、CD14陰性細胞の最高の収量を提供します。これらの単一陽性細胞は、後期の分化型MDDCである可能性があります。一度習得すると、接着技術と磁気絶縁技術は、適切に実行されれば、それぞれ3〜4時間、1〜2時間で完了できます。

この手順を試行する際には、培地が補充される48時間ごとに新鮮な樹状細胞分化サイトカインを用意することを覚えておくことが重要です。血液などのバイオハザード液体を扱う作業は、非常に有害である可能性があるため、これらの手順を実行するときは、常に適切な個人用保護具と廃棄方法を使用する必要があります。この研究は、免疫学の分野の研究者が治療治療のためのヒト単球および樹状細胞の使用を探求するための道を開きます。

このビデオを見れば、in vitroで単球由来細胞のさまざまな集団を生成するためにヒト単球単離を最適化する方法について十分に理解できるはずです。