ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

この手順の全体的な目標は、標準的な実験装置を使用して、ヒトマクロファージを大量かつ高品質に生成することです。これは、最初にFIコールグラジエントでバフィーコートからの血液を遠心分離し、P BMCscsを収集することによって達成されます。次に、通話ごとの勾配で、単球がリンパ球から分離されます。

次に、単球をテフロンコーティングした細胞培養バッグに播種し、分化させます。6〜7日後、マクロファージを収穫し、その後の研究のために播種します。得られた細胞は、成熟マクロファージの典型的なマーカーを発現し、腫瘍細胞との共培養またはLPSによる刺激などの種々の刺激に応答すべきであり、この技術の主な利点は、向流、遠心分離、または磁気活性化細胞選別などの既存の方法よりも、高価な試薬または器具を必要とせずに標準的なリップ機器で生成できることである。

この方法は簡単に実行できますが、この方法を初めて使用する人は、密度勾配で異なる細胞集団を視覚化して分離するのに苦労するかもしれません。したがって、これらの手順を視覚的に示すことで、これらの困難を克服するのに役立ちます。このプロトコルは、ローターのバランスを取りやすくするために、二重に実行されます。

層状血液からバフィーコート画分の2袋を消毒することから始めます。次に、バフィーコートを各バフィーコートの2本の50ミリリットルチューブに移します。15ミリリットルの室温FIコール溶液を1ミリリットルあたり1.077グラムで3本の50ミリリットルチューブを準備します。

次に、ゆっくりと慎重に、FIコールの各チューブに30〜35ミリリットルのふくらんでいるコートを重ねます。層は、400 Gで30分間壊れることなく、これらのチューブを遠心分離して混合してはなりません。2つのフェーズ間の室温では、末梢血単核細胞の白いリングが形成されます。

プラスチックピペットでこれらの層を取り除きます。各ドナーからの3本のチューブの層を、ドナーごとに2本の50ミリリットルチューブに結合します。採取した細胞を40ミリリットルラインまで1ミリモルのP-B-S-E-D-T-Aを加えて洗浄し、その後、室温で壊れることなく300Gで10分間遠心分離します。

次に、上清を吸引して捨てます。次に、洗浄を繰り返し、P-B-S-C-D-T-Aを再懸濁して、各ドナーからのペレットとフェノールレッドを含まない20ミリリットルのRPMIとFCSをプールします。これで、ドナーごとに1本の細胞チューブが存在するはずです。

次に、50ミリリットルのチューブに23.13ミリリットルの室温の室温溶液と1.87ミリリットルの10XPBSを混合した2番目の密度グラジエントを調製します。2つのサンプルごとに1本のチューブを準備します。次に、23ミリリットルの混合物を新しい50ミリリットルのチューブに移します。

次に、27ミリリットルのRPMIとFCSとフェノールレッドを加えます。その結果、コールあたりの浸透圧ソリューションは 46% です。次に、ドナーの転送ごとに、46%溶液の25ミリリットルを50ミリリットルのチューブに取り、細胞混合物を慎重に重ねます。

2つのフェーズは、切れ目なく色で区別できる必要があります。室温で30分間細胞を遠心分離し、550 G.Aで単球の白いリングが2つの面の間に溜まります。これらの細胞をプラスチック製のピペットで50ミリリットルのチューブに集めます。

単球を1ミリモルのP-B-S-E-D-T-Aで洗浄し、50ミリリットルのマークまで充填します。次に、室温で10分間壊さずに400Gで遠心分離し、上清を廃棄し、ペレット化した単球を20ミリリットルの培地に再懸濁します。その後、次のセクションに進みます。

このプロトコルでは、FEPテフロンコーティングされた培養バッグを培養チャンバーとして使用します。収集された単球の数を推定することから始めます。単球は大きく、しばしば不規則な形をしています。

小さいリンパ球は数えないでください。1人のドナーの細胞が1億から1億5000万個ある場合は、180ミリリットルのRPMIを補給しておきましょう。細胞数が少ない場合は、3,000万〜5,000万個の細胞ごとに30ミリリットルの培地を準備します。

20ミリリットルのアリコートで、調製した培地の180ミリリットルに細胞を慎重に混合します。次に、培養バッグのプラグに取り付けられた50ミリリットルのPerfuシリンジで細胞を培養バッグにロードします。シリンジを取り外し、残りの空気を押し出し、プラグをコーンでキャップします。

次に、バッグを5%の二酸化炭素で6〜7日間インキュベートします。6〜7日間のインキュベーション後、培養バッグを氷に移して細胞を採取し、バッグを氷に完全に浸し、1時間から3時間冷まして細胞を剥離させます。次に、バッグを端から約10回そっと引っ張ります。

次に、バッグの外側を徹底的に消毒します。プラグコーンを50ミリリットルの注射器と交換します。次に、細胞懸濁液を引き出し、50ミリリットルのチューブに移します。

すべてのチューブが収集されたら、室温で400Gで10分間スピンダウンし、上清を吸引し、すべての細胞を10ミリリットルのRPMIとFCSにプールします。次に、前と同じようにセルを数えます。マクロファージは、残存リンパ球が存在する可能性があるため、カウントするだけです。

次に、目的のアプリケーションに細胞を使用して、培養バッグを再利用します。70%エタノールで2回洗います。次に、50ミリリットルの70%エタノールでそれらを満たし、翌日室温で一晩インキュベートし、滅菌PBSでバッグを3回すすいでください。

次に、それらを滅菌紙で包み、オートクレーブします。バッグは密度勾配の10倍で簡単に再利用できます。遠心分離により、リンパ球と単球を含む白色界面が得られます。

ここでは、最初の密度勾配を調べます。5月Grunwald。これらの細胞の染色は、リンパ球に典型的な高い核細胞質比と、単球に典型的な豆またはリング状の核の両方を示しています。

これらの染色は、2番目のグラジエントの結果を示しています。各バフィーコートは約1億5000万個の単球を産出し、約7000万個のマクロファージに分化することができます。20回の調製で、単球の47%がマクロファージになりました。

精製されたマクロファージは、プラスチック表面への付着によってさらに濃縮されますが、これは汚染細胞にはない特徴です。めっきされると、ほとんどのマクロファージは目玉焼きの形態を示しますが、他のマクロファージは表現型のような引き伸ばされた紡錘体を持っています。細胞は、いくつかのマーカーの発現によって特徴

成熟したマクロファージに典型的です。CD 11 Bの発現は、CD 2 0 9の発現の欠如と同様に、樹状突起の分化に反論しています。分化後、細胞は5〜7日間機能的および代謝的に活性なままです。

生細胞のカルシウム染色は、腫瘍細胞から放出された赤色標識の細胞外小胞を取り込む能力を示しています。さらに、マクロファージを活性化することができ、例えば、リポ多糖による刺激により、いくつかの炎症誘発性遺伝子が発現する。この手順に続いて、単離されたマクロファージは、健康と疾患におけるマクロファージ生物学に関する基本的な質問に答えるために、膨大な機能アッセイを受けることができます。

このビデオを見れば、ヒトマクロファージを大量に生成する方法を十分に理解できるはずです。ただし、感染の可能性がある人間の血液サンプルを扱っていることを覚えておくことが重要です。