Name: 干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ 慣性マイクロ流体を用いた細胞工学向けナノ粒子分離法。スパイラルマイクロデバイスでサイズベース分離を実現し、再生医療や大量細胞処理に有用な高スループット技術です。

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>jove_content<Mark Chong博士からのTHP-1細胞の親切な贈り物と、Yuejun Kang博士とNishanth V. Menon博士(南洋理工大学化学生物医学工学部)からのTHP-1細胞の親切な贈り物が大いに評価されました。このプロジェクトは、NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine(南洋理工大学)の資金提供を受けました。H.W.H.は、Lee Kong Chian School of Medicine(LKCMedicine)のポスドクフェローシップの支援を受けました。

間葉系幹細胞と単球の1ナノ粒子（NPS）ラベリング<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養間葉系幹細胞（MSC）は、標識前に≥80％コンフルエントに10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充しました。同様に、約10 6細胞/ mlの密度まで、10％FBSを補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地中で培養THP-1細胞（ATCC）。 </li><li>ロードシリカのNP（〜500μm）で一晩攪拌を使用して、カルセイン染料溶液（200μM）を持ちます。以前に記載されたプロトコルを使用して、PLGA-カルセインAM（CAM）を製作してください。22 <ol><li> 4℃のクロロホルム中に250μgのCAMおよび100mgのPLGA（50:50）に溶解します。 </li><li>室温で高速ホモジナイザー（13,600×gで、60秒）を使用して、単一乳剤のNPを生成します。 （二重distiを洗浄し、遠心分離を用いて収集する前に、化学フード（≥3時間）（5分間3400×gで）でクロロホルムを蒸発させ、満たさ水）は、凍結乾燥およびストレージを-20℃に。 </li></ol></li><li> 20分 - CAM-PLGAのNP（1ミリグラム）または15室温で0.01％のポリ-L-リジン（PLL）溶液中のカルセインシリカのNP（150μgの）をインキュベートします。 </li><li> 5分間、3400×gで遠心分離し、それぞれの培地の1ミリリットル中のNP再懸濁する前に、過剰なPLL上清を除去しました。 </li><li>約24時間（0.1 mgの・ml -1のラベリング濃度）のために-細胞（合計で2×10 6細胞のMSCまたはTHP-1、〜1）でのNPをインキュベートします。 </li><li>解離し、0.25％トリプシン（5分、37°C​​）の2ミリリットルを用いて標識付着MSCを収穫し、DMEMの6ミリリットルでクエンチしました。 （千XG、4分）で細胞をスピンダウンし、10 5の濃度に再懸濁-マイクロ流体処理のために10 6細胞/ ml。直接マイクロフルイディクスの精製の ​​ために- （10 6細胞/ ml 10 5）ラベルされたTHP-1細胞を使用してください。 </li></ol> 2.マイクロ流体デバイスの準備<ol><li> デバイス製造 <ol><li>マイクロ流体スパイラルデバイスを製造（500ミクロン115ミクロン（H）×（W））標準ソフトリソグラフィ工程を用いて市販のキットからのポリジメチルシロキサン（PDMS）を持つ。23 </li><li>ベースプレポリマーの30グラムと秤量ボートに徹底的に硬化剤3グラムを混ぜます。脱ガス気泡を除去するために60分間デシケーター中の混合物。 </li><li> 10ミリメートル - 〜5の高さに慎重に螺旋状のチャネル設計にパターニングされたシリコンウエハーマスターモールド上にPDMSの混合物を注ぎます。 </li><li>脱ガス再び気泡を除去するために60分間デシケーター真空中の混合物。全ての気泡が除去されるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> PDMSが設定されるまで2時間80℃のオーブン中でPDMS混合物を硬化させます。ウェハが一定のデバイスの高さを持つように硬化時に傾いていないことを確認してください。 </li><li>メスを用いてPDMSスパイラル装置を切り取り、慎重にマスターモールドからPDMSスラブの皮をむきます。 </li><li> Trの接合のための滑らかな表面を確保するために、メスで、デバイスのエッジをイム。 </li><li>注入口のための2つの穴（1.5ミリメートル）と1.5ミリメートル生検パンチャーを使用してPDMSデバイス上のコンセントのための2つの穴（1.5ミリメートル）をパンチ。 </li><li>任意の破片を除去し、5分間80℃のオーブン中でデバイスを乾燥イソプロパノール（IPA）で装置を洗浄します。 </li><li>マスキングテープを使用して、（チャネル機能を備えた）PDMSデバイスの底面を清掃してください。 </li><li>マスキングテープを使用して（「3による「2）スライドガラスのクリーン片側。 </li><li>慎重に配置し、プラズマクリーナーのチャンバ内にPDMS装置とスライドガラスの清浄面を露出させ、60秒間真空にそれらをかけます。次に、最大にプラズマ電源をオンにし、室内の色がピンクになるまでチャンバ圧力を下げます。 <ol><li> 60秒間空気プラズマに表面を露出。下剤に持ち込まときにプラズマがタイトな結合を可能にPDMSとガラスの露出面上の反応種を作成します。アル接触。プラズマ電源を切り、デバイスとガラススライドを取得するために、プラズマクリーナーからの圧力を解放します。 </li></ol></li><li>しっかりプラズマ露出面を押すと泡が2つの表面の間に捕捉されていないことを確実にすることによって、一緒にPDMSデバイスとスライドガラスを接着。 </li><li>結合を強化するために2時間80℃に設定したホットプレートを用いて接合デバイスを加熱します。 </li></ol></li><li> 素子動作 <ol><li>入口シリンジ20センチ、各チューブの一端にシリンジチップ（ゲージ23）を取り付け - 〜15のチューブの2枚（1.52ミリメートルのOD）をカットします。 </li><li> 〜5のチューブの2枚（1.52ミリメートルのOD）カット - アウトレット10センチとPDMSデバイスの出口穴に取り付けます。 </li><li>それは出口管から流出するまで70％エタノールを含有するシリンジを用いてプライム手動で、実行中のデバイスをサンプリングする前に。エタノールは、装置を滅菌する1分30秒のために座って許可します。 </li><li>負荷フィルタリングの30ミリリットル（0.2μmの孔径）シース緩衝液（0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS））60ミリリットル注射器へとシリンジポンプにシリンジを固定します。正しい設定（：60ミリリットル、ボリューム：60,000μLシリンジサイズ）にポンプを設定します。 注：PBSのBSAの添加は、細胞 - 細胞結合および細胞およびPDMSデバイスとの間の非特異的結合を最小にすることです。 </li><li>負荷3 mlシリンジへの標識された細胞の3ミリリットルと別々のシリンジポンプにシリンジを固定します。正しい設定（：3ミリリットル、ボリューム：3000μLシリンジサイズ）にポンプを設定します。 </li><li>全く気泡が安定した流れを確保するために、注射器の中に閉じ込めていないことを確認してください。優しくノズルから液体を数滴を吐出することにより、任意の気泡を除去。 </li><li>注射器に流入シリンジのヒントやチューブを接続し、デバイス（シースおよびサンプル入口）のそれぞれの入口に挿入してください。チューブに沿って気泡がないことを確認してください。 </li><li>反転の上にデバイスをマウントします細胞選別プロセス中にリアルタイムイメージングのためのED位相差顕微鏡。 </li><li>小さな廃棄物のビーカーや接着剤を使用して、顕微鏡ステージ上のデバイスに近い2 15ミリリットルのチューブを固定します。 </li><li>廃棄物のビーカーに出口チューブを置きます。 </li><li> 1:10シースバッファへのサンプルのための流量比を設定し、ソート処理を開始するために、両方のシリンジポンプを起動します（例：サンプルシリンジとシースシリンジのための1200μL/分で120μL/分;チャネル流速〜0.38メートル/秒）。 </li><li>流量が安定するのを1.5分間、デバイスを実行します。 （ - ：10-50マイクロ秒秒10,000フレーム（FPS）、露光時間〜5,000）、これは、高速度カメラを用いた位相差と明視野下のチャネルの内壁の近く慣性集束細胞の存在によって確認することができます。 </li><li>セル出口と廃液出口から溶離液を収集するために別のチューブに出口チューブを置きます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+technology+for+tracking+cells%27+status+%26+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Ther%22%5BJournal%5D)">Aptamer technology for tracking cells' status & function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).</li>
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<li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本明細書に記載されDFF細胞精製技術は、ハイスループット様式で標識された細胞の迅速かつ継続的な分離を可能にします。この分離法は、大きな試料体積または高細胞濃度の試料処理のために理想的であり、長期間の使用後に目詰まりを起こしやすい従来の膜ベースの濾過よりも良好です。同様に、親和性に基づく磁気分離は面倒かつ高価である追加の細胞標識のステップを必要とします。精製された細胞は、&lt;（チャンネル内により短い滞留時間に（〜200〜250ダイン/ cm 2のせん断応力τ、）最小限の流れ/せん断によって誘発される効果とよく（ 図3）、その標識された薬剤と細胞の形態を保持していることが示されています1秒）20,24。また、ユーザは、単に所望の媒体または緩衝液とシースバッファー（生理食塩水）を代入することによりソート標識細胞の溶出液を選択することができます。 それはすることが重要です悪セルフォーカシング動作に影響を与えることができ、マイクロチャネル使用前には埃やゴミがありません。これはIPAで十分に入口穴を洗浄、並びにプ...

エージェントにロードされたマイクロ/ナノ粒子（NPS）によって細胞を操作するには、バイオイメージング能力を高め、再生医療において、ネイティブの治療特性を補う/強化するために、単純な、ゲノム組込みフリーで、かつ汎用性の高い方法。1-3携帯修正は標識することによって達成されますエージェントにロードされたNPの過剰濃度の形質膜や細胞質は結合部位を飽和させます。しかし、この方法の主な欠点は、潜在的に、粒子操作された細胞の正確な同定を混乱させるまたは治療結果を複雑にすることができる細胞標識工程の後に溶液中に残存する未結合の粒子のかなりの量である。また4,5、変革を含むのNPへの曝露過度に高濃度の薬剤（成長因子、コルチコステロイド、 等）は、非標的細胞に意図しない結果を誘導し得る細胞毒性および誤った露出を引き起こす可能性があります。 Oを備えても粒子状キャリアF「生体適合性」材料[ 例えば 、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、PLGA]は同様に、一定の条件の下で強力な免疫細胞応答を扇動することができます。6これは、免疫障害（ 例えば 、関節リウマチ）、潜在的な遅延を有する個体において特に危険です全身ナノ粒子のクリアランス。7したがって、従来の粒子-操作された細胞の導入に自由粒子の効率的な除去は、毒性プロフィールを最小化し、in vivoでのエージェントにロードされた粒子に見当違いの露出を減らすために非常に重要です。 従来勾配遠心分離は、多くの場合、自由粒子から操作された細胞を分離するために使用されるが、面倒であり、バッチモードで操作されます。また、高速遠心分離中に細胞および細胞の完全性および/ ​​または影響の細胞の挙動を損なう可能性密度勾配媒質の成分が経験するせん断応力は、8マイクロフルイディクスは、SEVで魅力的な代替手段であります決定論的横変位（DLD）9を含むERAL分離技術、10,11を dieletrophoresisと小さな粒子の分離およびバッファ交換用に開発12を acoustophoresis。しかしながら、これらの方法は、（分・1-10μL - 1）低いスループット苦しむとの問題を目詰まりを起こしやすいです。このような誘電泳動に基づく方法のような活性の分離はまた、分離を達成するために固有の誘電細胞表現型または追加の細胞標識手順の違いを必要とします。全体の粒子または細胞の横方向の移動をその高い流動条件と優れたサイズの解像度に起因する高レイノルズ数（Re）が13で支配的な揚力（F L）に別個の位置に集中する合理化-より多くの有望なアプローチは、慣性マイクロフルイディクスを伴います。それは、多くの場合、サイズに基づく細胞分離14,15とバッファ交換用途のために利用されている。16-18 Howeve分離した細胞は、通常、元のと新しい緩衝液との間の境界に近い残るように、R、バッファ交換性能が~10-30％、汚染物質溶液で貧しいまま。16-18さらに重要なのは、標的細胞のサイズ分布を達成することは似ているように持っています正確な慣性は、フォーカシング、特にそのような間葉系幹細胞（MSC）のような不均質なサイズの細胞型の処理に問題を提起し、元の緩衝液からの分離。19 我々は以前、新しい慣性マイクロ流体セルソーティング技術は、2-入口、2-アウトレットスパイラルマイクロチャネルデバイスを使用して、循環腫瘍細胞（CTCの）全血から20および細菌21を単離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ばれる開発しました。このビデオプロトコルでは、我々は、標識THP-1（ヒト急性単球性白血病細胞株）懸濁単球細胞（〜15ミクロン）およびカルセイン-LでのMSC（10-30ミクロン）の処理について説明しますoadedのNP、標識された細胞と結合していないNPの除去を効率的に回収するためのDFFのスパイラルマイクロデバイスの製造および操作が続く。22この一段階精製戦略は、標識されたサスペンション、遠心分離することなく、新鮮な緩衝液に懸濁接着細胞の連続的な回復を可能にします。また、10万個の細胞・ml -1の、再生医療用途のために適した細胞密度まで処理することができます。

<table><tbody><tr><td>細胞株 &培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>間葉系幹細胞(MSC)</td><td>ロンザ</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」Lonza</td><td></td> <td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 単球細胞 (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Reagents &原材料</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01% ポリ-L-リジン (PLL)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>302113</td> 3 <td>ml ルアーロック</td></tr><tr><td>60 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309653</td><td>シリンジ 60 ml ルアーロック</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td> <td>#P/7507/17</td><td>HPLC グレード 2.5 L</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1 mm3</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>ダウコーニング</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td>3M</td><td>21200702044</td><td>18mm×25m</td></tr><tr><td>シリカNPs(&sim;200 &mu;m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>細孔径 4 nm</td></tr><tr><td>シリンジチップ</td><td>JEC 技術</td><td>7018302</td><td>23 G 0.013 x 0.25</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td> <td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0.02 x 0.06" 100</td></tr><tr><td>Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsyパンチ</td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1.50 mm</td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>ファントム&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコンエ</td><td>クリプスTi</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

活性成分ロードマイクロ/ナノ粒子を有する細胞を操作する（NPS）は、ネイティブの治療特性を向上させるバイオイメージングを可能にし、細胞表現型を制御するために、ますます一般的な方法になってきています。クリティカルまだ不十分な対処の問題は容易に従来の遠心分離によって除去することができない細胞標識後に結合しないままの粒子のかなりの数です。これは、バイオイメージング、バックグラウンドノイズの増加をもたらし、隣接する非標的細胞に変革効果を付与することができます。このプロトコルでは、我々は効率的に高スループットの方法で遊離のNPから標識細胞を分離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ば慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略を提示します。未結合の蛍光色素又は染料装填のNP（SILの&gt; 95％の枯渇を達成しながら開発スパイラルマイクロデバイスは、新たな緩衝液に懸濁精製細胞（THP-1およびMSC）の連続的な回収（&gt; 90％の細胞回復）を容易にしますICAまたはPLGA）。このシングルステップ、サイズに基づく細胞の精製戦略は、高いセル処理能力（10 6細胞/分）を可能にし、干渉のない臨床応用を実現するために、マイクロ/ナノ粒子操作された細胞の大容量セルの精製に非常に有用です。

一晩バイオイメージング剤を装填したNPで細胞を標識した後、（自由粒子を含む）標識された細胞を回収し、単一ステップのプロセス（ 図1A）に無料のNPを除去するために、DFFのスパイラルマイクロデバイスによって精製しました。 2-入口、2-コンセントスパイラルマイクロチャネルは、SU-8フォトレジストを用いたエンジニアリングソフトウェアによって設計され、微細加工されています。パターニングされたシリコンウェハは、次いで、ソフトリソグラフィー技術（ 図1B）を使用してPDMSレプリカ成形用の鋳型として使用されます。内壁入口は細胞サンプル流を挟むために、より高い流量（1:10）で、新鮮な緩衝液を実行しながら、細胞選別を行うために、細胞試料は、スパイラルマイクロデバイスの外壁の入口に圧送されます。分離は慣性が内壁と外壁（ 図2A）に向かって小さな未結合のNPのディーンによって誘発される再循環でより大きな標識細胞のフォーカシングによって達成されます。装置は、第一アプリでしたカルセイン（...

このプロトコルは、非結合粒子を効率的に枯渇してマイクロ/ナノ粒子操作された細胞を精製するために、慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略の使用を記載しています。

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

この手順の全体的な目的は、ナノ粒子を用いた細胞エンジニアリングの後、細胞から遊離ナノ粒子を分離するための、簡便で効率的かつハイスループットなマイクロ流体精製技術を実証することです。この技術の主な目的は、細胞操作の手順後に、結合していないナノ粒子を迅速かつ効率的に除去することです。操作後、すべてのサンプリング分画を回収します。このマイクロ流体細胞精製技術は、スパイラル型マイクロデバイス内における細胞とナノ粒子の慣性集束効果の差を利用することで、効率的なサイズベースの分離を実現します。この装置は、1mLあたり最大1,000万個の細胞を処理することが可能であり、再生医療や大量の細胞処理に非常に有用です。この技術は、イメージング目的や機能制御のためにナノ粒子を用いて細胞にラベルを付けることが多い細胞工学分野で強く求められています。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアシスタントであるHui Min Tay氏と、Xi教授の研究室のポストドクトラル研究員であるDavid Yeo博士が行います。ナノ粒子で細胞を標識する前に、間葉系幹細胞を6ウェルプレートでコンフルエンシー80%以上にまで培養します。同様に、THP-1細胞を1 mLあたり100万個の密度まで培養します。次に、1 mgのシリカナノ粒子を200 µMのカルシウム染料溶液1 mLに溶解させます。そして、粒子を一晩撹拌します。また、ここに示した参考文献に記載の方法を用いて、PLGAカルシウムAMナノ粒子を作製します。1 mgのPLGAカルシウムAMナノ粒子、または150 µgのカルシウムシリカナノ粒子のいずれかを、水溶性0.1%poly-l-lysine溶液に混合し、ピペッティングで1分間混ぜ合わせます。その後、室温で15〜20分間インキュベートします。次に、ナノ粒子を遠心分離します。過剰なpoly-l-lysineを含む上清を除去し、ラベル付けする細胞タイプに適した培養液1 mLでナノ粒子を再懸濁します。培養細胞100万個につき、ラベル化ナノ粒子1 milligramsを培地1 milliliterに加えてください。細胞、ナノ粒子、および培地の混合液をピペットで1分間十分に混ぜ合わせます。その後、混合液を約24時間インキュベートします。標識後、幹細胞を解離および回収し、マイクロ流体処理用に1 mLあたり100,000から1,000,000個の濃度で再懸濁します。同様の濃度の標識済みTHP-1細胞を使用します。マイクロ流体スパイラルデバイスを製作するために、まず標準的な微細加工技術を用いてシリコンウェーハマスターモールドを準備します。次に、30 gのベースPDMSプリポリマーと3 gの硬化剤を計量皿に入れ、十分に混合します。混合物を真空状態で60分間脱気し、気泡を除去します。スパイラルチャネルデザインがパターン形成されたマスターモールド上に、PDMS混合物を高さ5～10 mmになるまで注意深く注ぎます。その後、混合物を60分間脱気し、気泡を除去します。すべての気泡がなくなるまでこの操作を繰り返します。次に、ウェハーをオーブンに入れ、デバイスの高さを一定に保つため、キュアリング中にウェハーが傾かないようにしてください。PDMSを80 °Cで2時間硬化させます。冷却後、メスを使用してPDMSスパイラルデバイスを切り出し、マスターモールドからPDMSスラブを慎重に剥離します。次に、ボンディング用の表面を滑らかにするため、メスでデバイスの端をトリミングします。次に、1.5 millimeterのバイオプシーパンチを使用して、入口用に2つの穴、および出口用に2つの穴を開けます。デバイスをイソプロパノールで洗浄して残渣を取り除きます。その後、80 degree Celsiusのオーブンで5分間デバイスを乾燥させます。次に、マスキングテープを使用して、PDMSデバイスの底面とガラススライドの片面を清浄にします。清浄な面を外側にして、ガラススライドとPDMSデバイスを慎重にプラズマチャンバーに入れます。プラズマ出力を最大にし、チャンバー内がピンク色になるまでチャンバー圧を下げ、各コンポーネントを60秒間曝露させます。次に、チャンバーからスライドとPDMSデバイスを取り出します。そして、プラズマ処理した表面同士を強く押し付けて接合させます。2つの表面の間に気泡が閉じ込められていないことを確認してください。接合したデバイスを80 °Cに設定したホットプレートで2時間加熱し、接合を強化します。入口用に長さ15～20 cmのチューブを2本切り出し、それぞれのチューブの一端に23Gの針を取り付けます。次に、出口用に同じチューブを5～10 cmの長さで2本切り出し、デバイスの出口穴に取り付けます。サンプルを流す前に、70%エタノールを入れたシリンジを用いて、デバイスの出口チューブから液体が流出するまで手動でプライミングを行います。デバイスを滅菌するため、エタノールを入れた状態で少なくとも30秒間放置します。その後、1%BSAを含むフィルター済みPBS 30 millilitersを60 milliliterシリンジに充填します。また、ラベル付けした細胞 3 mL を 3 mL シリンジに充填し、どちらのシリンジにも気泡が混入していないことを確認します。ノズルから液体を数滴静かに排出して、気泡を除去してください。インレットシリンジのチップとチューブをシリンジに接続し、シリンジをシリンジポンプに固定します。チューブをデバイスのそれぞれの入口に挿入し、チューブ内に気泡がないことを確認します。流路系のセットアップが完了したら、細胞分取プロセスのリアルタイムイメージングを行うため、デバイスを倒立位相差顕微鏡に装着します。顕微鏡ステージ上のデバイスの近くに、小型の廃棄ビーカーと15 milliliterチューブ2本を固定します。デバイスの両方の出口からの排水チューブを廃棄ビーカーに入れます。次に、サンプルシリンジの流量を120 µL/minに、シースシリンジの流量を1,200 µL/minに設定し、サンプル液とシースバッファーの流量比を1:10に設定します。流量を安定させるため、デバイスを1分30秒間作動させます。高速カメラを用いて、明視野位相差観察下でチャネル内壁付近に慣性集束した細胞が存在することを確認します。定常流に達し、デバイスが正常に動作していることが確認できたら、流出チューブをそれぞれ異なるバイアルに配置し、細胞流出口と廃棄流出口から別々の溶出液を回収します。本デバイスは、標識されたTHP-1単球細胞の懸濁液を、蛍光シリカナノ粒子から正確に分取することが可能です。高速イメージングとフローサイトメトリー分析の両方により、高い分離効率が得られたことが確認されました。この一段階精製戦略により、遠心分離を行うことなく、新鮮な緩衝液中に懸濁させたラベル付きの懸濁細胞および接着細胞を連続的に回収することが可能です。本デバイスは、シリカおよびPLGAナノ粒子の両方で高効率な分離が可能であり、1 mLあたり最大1,000万個の細胞を同様に高い効率で分離することができます。このビデオを視聴することで、ナノ粒子を用いて細胞を標識する方法について十分に理解できるはずです。また、専用のマイクロ流体デバイスを使用して、結合しなかった過剰な粒子を取り除き、標識細胞を精製する方法についても習得できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイス内でビーズと細胞操作と分離を示しています。...

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

このビデオは、磁性ナノ粒子ベースの免疫測定法のためのマイクロ流体システムを示しています。検出システムは、チャネル内に磁気トラップを組み込んだマイクロ流体デバイスを利用しています。一次抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体に結合した抗原被覆磁性ナノ粒子からなる、あらかじめ形成された免疫複合体をチャネルに導入します。免疫複合体は、外部磁場を印加すると多孔質磁気トラップに捕捉されます。ペルオキシダーゼによる触媒作用により蛍光を発する蛍光性基質を用いて、捕捉された免疫複合体を顕微鏡で検出します。...

マイクロ流体デバイスを用いた磁性ナノ粒子を用いたイムノアッセイ

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

このプロトコルは、マイクロ流体デバイスを使用して自動化された小容量(0.15–1.5...

マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

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コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

関係なく、動作条件、ICP帯の伝播を停止することができる新規なイオン濃度分極（ICP）プラットフォームのためのプロトコルを説明します。プラットフォームのこのユニークな能力は、ICP現象の2極性があるイオン減少および濃縮を、マージを使用することにあります。...

偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ

本プロトコルは、効率的な微粒子濃縮に使用できる空気圧マイクロ流体プラットフォームを記述している。...

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磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

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マイクロエンボス加工:ナノセルロース紙ベースのマイクロ流体工学でマイクロ流路を作製するための便利なプロセス

このプロトコルは、個々のヒト末梢血単核細胞のサイトカイン分泌動態を定量的に測定するための高度なマイクロ流体プラットフォームを説明しています。このプラットフォームは、例としてリポ多糖で刺激された個々の細胞ごとに最大3つのサイトカイン(IL-6、TNFα、およびIL-1β)を並行して測定します。...

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ 

学ぶ 慣性マイクロ流体を用いた細胞工学向けナノ粒子分離法。スパイラルマイクロデバイスでサイズベース分離を実現し、再生医療や大量細胞処理に有用な高スループット技術です。

干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換

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