干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換
July 10th, 2016
このプロトコルは、非結合粒子を効率的に枯渇してマイクロ/ナノ粒子操作された細胞を精製するために、慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略の使用を記載しています。
この手順の全体的な目標は、ナノ粒子を使用した細胞工学に従って、細胞から遊離ナノ粒子を分離するための、便利で効率的、かつ高スループットのマイクロ流体精製技術を実証することです。この技術の主な欲求は、未結合のナノ粒子を迅速かつ効率的に除去できるようにすることです 細胞の労働手順の後、私たちはすべてのses-fa-tionを収集します。このマイクロ流体細胞精製技術は、スパイラルマイクロデバイス内の細胞とナノ粒子の慣性集束効果の違いにより、効率的なサイズベースの分離を実現します。
1milあたり最大1,000万個の細胞を処理でき、再生医療やラッチボリューム細胞処理に非常に役立ちます。この技術は、ナノ粒子を用いて細胞を加工することが多い細胞工学分野で、イメージングや機能制御のために高い期待が寄せられています。この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるHui Min Tay氏と、Xi教授の研究室の博士研究員であるDavid Yeo博士です。
間葉系幹細胞を6ウェルプレート上で80%以上のコンフルエント度まで培養してから、ナノ粒子で細胞を標識します。同様に、THP-1細胞を1ミリリットルあたり100万個の細胞の密度で培養します。次に、1ミリグラムのシリカナノ粒子を1ミリリットルの200マイクロモルカルシウム染料溶液に溶解します。
そして、粒子を一晩攪拌します。また、ここに示す参考文献に記載されている方法を使用して、PLGAカルシウムAMナノ粒子を作製します。1ミリグラムのPLGAカルシウムAMナノ粒子または150マイクログラムのシリカカルシウムナノ粒子を水中の01%poly-l-リジン溶液にピペッティングして、溶液を1分間上下にピペッティングして混合します。
その後、室温で15〜20分間インキュベートします。次に、ナノ粒子を遠心分離します。余分なポリ-l-リジン上清を除去し、標識する細胞タイプに適した培養培地1ミリリットルにナノ粒子を再懸濁します。
標識されたナノ粒子を、培養中の細胞100万個につき1ミリリットルの培地に加えます。細胞、ナノ粒子、培地の混合物を1分間完全にピペットで挟みます。そして、混合物を約24時間インキュベートします。
標識したら、幹細胞を解離して収穫し、マイクロ流体処理のためにミリリットルあたり100、000〜1、000、000細胞の濃度に再懸濁します。標識されたTHP-1細胞を同じ濃度で使用してください。マイクロ流体スパイラルデバイスを作製するためには、まず標準的な微細加工技術を用いてシリコーンウェーハマスターモールドを作製します。
次に、ベースPDMSプレポリマー30gと硬化剤3gを計量ボートで十分に混合します。混合物を真空下で60分間脱気し、気泡を取り除きます。PDMS混合物を、スパイラルチャネル設計でパターン化されたマスターモールドに、5〜10ミリメートルの高さまで慎重に流し込みます。
次に、混合物を60分間脱気して、気泡を取り除きます。すべての気泡が除去されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、ウェーハをオーブンに入れ、硬化中にウェーハが傾かないようにして、デバイスの高さが一定になるようにします。
PDMSを摂氏80度で2時間硬化させます。冷めたら、メスを使用してPDMSスパイラルデバイスを切り取り、マスターモールドからPDMSスラブを慎重に剥がします。次に、メスを使用してデバイスの端をトリミングし、接着用の滑らかな表面を確保します。
次に、1.5mmの生検パンチを使用して、インレット用に2つの穴とアウトレット用に2つの穴を作成します。デバイスをイソプロパノールで洗浄して、破片を取り除きます。そして、デバイスを摂氏80度のオーブンで5分間乾燥させます。
次に、マスキングテープを使用して、PDMSデバイスの底面とスライドガラスの片側を清掃します。スライドガラスとPDMSデバイスを、きれいな表面が露出したプラズマチャンバーに慎重に配置します。プラズマ出力を最大にし、チャンバーがピンク色に変わるまでチャンバー圧力を下げ、コンポーネントを60秒間露出させます。
次に、スライドとPDMSデバイスをチャンバーから取り外します。そして、プラズマにさらされた表面をしっかりと押し付けて、それらを結合します。2つの表面の間に気泡が挟まっていないことを確認します。
接着したデバイスを80°Cに設定したホットプレートで2時間加熱し、接着を強化します。インレット用に長さ15〜20センチメートルのチューブを2本カットし、各チューブの一方の端に23ゲージの針を取り付けます。次に、同じチューブをコンセント用に長さ5〜10センチメートルの2つを切り取り、デバイスの出口穴に取り付けます。
サンプルを実行する前に、70%エタノールを含むシリンジで、出口チューブから流れるまでデバイスを手動でプライミングします。エタノールをデバイス内に少なくとも30秒間置いて滅菌します。次に、30ミリリットルのろ過されたPBSと1%BSAを60ミリリットルのシリンジにロードします。
また、標識された細胞を3ミリリットルのシリンジにロードし、どちらのシリンジにも気泡が閉じ込められていないことを確認します。ノズルから数滴の液体をそっと噴射して、気泡を取り除きます。インレットシリンジチップとチューブをシリンジに接続し、シリンジをシリンジポンプに固定します。
チューブをデバイスのそれぞれの入口に挿入し、チューブに沿って気泡がないことを確認します。流路系をセットアップしたら、デバイスを逆位相コントラスト顕微鏡に取り付けて、細胞ソーティングプロセス中のリアルタイムイメージングを行います。小さな廃棄物ビーカーと2本の15ミリリットルチューブを顕微鏡ステージ上の装置の近くに固定します。
デバイスの両方の出口からの出口チューブを廃棄物ビーカーに配置します。次に、サンプルシリンジの流量を毎分120マイクロリットルに設定し、シースシリンジを毎分1,200マイクロリットルに設定して、サンプルとシースバッファーの流量比を1〜10に設定します。デバイスを1分半運転して、流量が安定するチャンスを与えます。
ハイスピードカメラを使用して、位相コントラストのある明視野下でチャネル内壁付近の慣性集束セルの存在を確認します。定常状態の流れが達成され、デバイスが正しく動作しているときは、出口チューブを異なるバイアルに配置して、細胞出口と廃棄物出口から別々の溶離液を収集します。このデバイスは、蛍光シリカナノ粒子からTHP-1単球細胞の標識懸濁液を正しく選別することができます。
高速イメージングとフローサイトメトリー解析の両方で確認された高い分離効率が得られました。シングルステップ精製戦略により、標識された懸濁液および新鮮な緩衝液に懸濁した付着細胞を遠心分離を必要とせずに連続的に回収できます。このデバイスは、シリカとPLGAの両方のナノ粒子で高効率に分離でき、1ミリリットルあたり最大1,000万個の細胞を同じ高効率で分離できます。
このビデオを見れば、ナノ粒子で細胞を標識する方法を十分に理解できるはずです。また、専用のマイクロ流体デバイスを使用して余分な未結合粒子を除去することにより、標識された細胞を精製する方法も重要です。
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概要
このプロトコルは、エンジニアリングされた細胞から遊離ナノ粒子を効率的に分離するために設計されたマイクロ流体精製技術を説明しています。この方法は、慣性マイクロ流体力学を利用してサイズベースの分離を実現し、再生医療に特に有用です。
主要な研究要素
科学分野
- マイクロ流体工学
- 細胞工学
- ナノ粒子精製
背景
- 細胞工学では、ナノ粒子がしばしば使用されます。
- 未結合ナノ粒子の効率的な除去は、正確な結果を得るために重要です。
- この技術により、細胞の高スループット処理が可能になります。
- 1ミリリットルあたり最大1000万細胞の濃度を処理できます。
研究目的
- 便利で効率的な精製方法を実証すること。
- エンジニアリングされた細胞と未結合ナノ粒子を分離することを強化すること。
- 再生医療の進歩を支援すること。
使用方法
- サイズベースの分離のための慣性マイクロ流体力学。
- 差動慣性フォーカシングのためのスパイラルマイクロデバイス。
- 高スループット処理能力。
- 関連する研究所の研究者による実証。
主な結果
- 遊離ナノ粒子からエンジニアリングされた細胞の精製に成功。
- 大量の細胞処理の効率を実証。
- マイクロ流体技術の有効性を検証。
- 再生医療と細胞工学への潜在的な応用。
結論
- マイクロ流体精製方法は効果的で効率的です。
- この技術は細胞工学アプリケーションに大いに役立ちます。
- 将来の研究により、さまざまな生物医学分野での使用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Unbound nanoparticles after cell labeling introduce background noise and off-target effects that compromise data integrity and therapeutic safety in nanoparticle-based cell engineering workflows. This microfluidic buffer exchange strategy enables high-throughput, size-based separation of labeled cells from free nanoparticles, supporting interference-free applications in regenerative medicine and cell therapy development. The approach addresses a critical purification bottleneck, improving predictive confidence in downstream functional assays and imaging applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of nanoparticle-labeled cells by removing confounding signals from unbound particles.
- Operational Value: Provides a centrifugation-free method for rapid purification of engineered cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified cell suspensions in fresh buffer for consistent, low-noise readouts in phenotypic and functional screening.
- Operational Value: Supports high-throughput processing at 106 cells/min, enabling scalable assay preparation for large-volume studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains phenotypic integrity of engineered THP-1 and MSCs during purification, supporting reliable preclinical evaluation.
- Operational Value: Facilitates transition from discovery to preclinical workflows by providing interference-free cell products for biodistribution and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the nanoparticle cell engineering workflow post-labeling and pre-analysis, enabling clean transition to functional validation, imaging, or therapeutic testing stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by eliminating nanoparticle-derived background that could obscure true cellular responses.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible removal of unbound silica and PLGA nanoparticles (>95% depletion).
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry and imaging with reduced false-positive signals from free dye or dye-loaded nanoparticles.
- Translational Research: Promotes continuity by delivering cells in fresh buffer suitable for in vivo tracking or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Reusable spiral microfluidic device design allows standardization across cell types and nanoparticle formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing nanoparticle-induced artifacts in neighboring non-target cells.
- Operational Value: Achieves >90% cell recovery and >95% nanoparticle depletion in a single step, improving workflow efficiency.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling high-volume processing without multiple centrifugation cycles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by improving data reliability in lead identification and candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and operation, including PDMS bonding and syringe pump setup.
- Depends on access to spiral microchannel fabrication tools and high-speed imaging for validation.
- Necessitates standardization of flow rates (1:10 sample:sheath ratio) across teams for reproducible separation.
- Adaptation may be needed for varying cell sizes or nanoparticle types beyond silica and PLGA.
- Practical limitation: Device clogging risk at very high cell concentrations or with aggregates, requiring pre-filtration.
