干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換

この手順の全体的な目標は、ナノ粒子を使用した細胞工学に従って、細胞から遊離ナノ粒子を分離するための、便利で効率的、かつ高スループットのマイクロ流体精製技術を実証することです。この技術の主な欲求は、未結合のナノ粒子を迅速かつ効率的に除去できるようにすることです 細胞の労働手順の後、私たちはすべてのses-fa-tionを収集します。このマイクロ流体細胞精製技術は、スパイラルマイクロデバイス内の細胞とナノ粒子の慣性集束効果の違いにより、効率的なサイズベースの分離を実現します。

1milあたり最大1,000万個の細胞を処理でき、再生医療やラッチボリューム細胞処理に非常に役立ちます。この技術は、ナノ粒子を用いて細胞を加工することが多い細胞工学分野で、イメージングや機能制御のために高い期待が寄せられています。この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるHui Min Tay氏と、Xi教授の研究室の博士研究員であるDavid Yeo博士です。

間葉系幹細胞を6ウェルプレート上で80%以上のコンフルエント度まで培養してから、ナノ粒子で細胞を標識します。同様に、THP-1細胞を1ミリリットルあたり100万個の細胞の密度で培養します。次に、1ミリグラムのシリカナノ粒子を1ミリリットルの200マイクロモルカルシウム染料溶液に溶解します。

そして、粒子を一晩攪拌します。また、ここに示す参考文献に記載されている方法を使用して、PLGAカルシウムAMナノ粒子を作製します。1ミリグラムのPLGAカルシウムAMナノ粒子または150マイクログラムのシリカカルシウムナノ粒子を水中の01%poly-l-リジン溶液にピペッティングして、溶液を1分間上下にピペッティングして混合します。

その後、室温で15〜20分間インキュベートします。次に、ナノ粒子を遠心分離します。余分なポリ-l-リジン上清を除去し、標識する細胞タイプに適した培養培地1ミリリットルにナノ粒子を再懸濁します。

標識されたナノ粒子を、培養中の細胞100万個につき1ミリリットルの培地に加えます。細胞、ナノ粒子、培地の混合物を1分間完全にピペットで挟みます。そして、混合物を約24時間インキュベートします。

標識したら、幹細胞を解離して収穫し、マイクロ流体処理のためにミリリットルあたり100、000〜1、000、000細胞の濃度に再懸濁します。標識されたTHP-1細胞を同じ濃度で使用してください。マイクロ流体スパイラルデバイスを作製するためには、まず標準的な微細加工技術を用いてシリコーンウェーハマスターモールドを作製します。

次に、ベースPDMSプレポリマー30gと硬化剤3gを計量ボートで十分に混合します。混合物を真空下で60分間脱気し、気泡を取り除きます。PDMS混合物を、スパイラルチャネル設計でパターン化されたマスターモールドに、5〜10ミリメートルの高さまで慎重に流し込みます。

次に、混合物を60分間脱気して、気泡を取り除きます。すべての気泡が除去されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、ウェーハをオーブンに入れ、硬化中にウェーハが傾かないようにして、デバイスの高さが一定になるようにします。

PDMSを摂氏80度で2時間硬化させます。冷めたら、メスを使用してPDMSスパイラルデバイスを切り取り、マスターモールドからPDMSスラブを慎重に剥がします。次に、メスを使用してデバイスの端をトリミングし、接着用の滑らかな表面を確保します。

次に、1.5mmの生検パンチを使用して、インレット用に2つの穴とアウトレット用に2つの穴を作成します。デバイスをイソプロパノールで洗浄して、破片を取り除きます。そして、デバイスを摂氏80度のオーブンで5分間乾燥させます。

次に、マスキングテープを使用して、PDMSデバイスの底面とスライドガラスの片側を清掃します。スライドガラスとPDMSデバイスを、きれいな表面が露出したプラズマチャンバーに慎重に配置します。プラズマ出力を最大にし、チャンバーがピンク色に変わるまでチャンバー圧力を下げ、コンポーネントを60秒間露出させます。

次に、スライドとPDMSデバイスをチャンバーから取り外します。そして、プラズマにさらされた表面をしっかりと押し付けて、それらを結合します。2つの表面の間に気泡が挟まっていないことを確認します。

接着したデバイスを80°Cに設定したホットプレートで2時間加熱し、接着を強化します。インレット用に長さ15〜20センチメートルのチューブを2本カットし、各チューブの一方の端に23ゲージの針を取り付けます。次に、同じチューブをコンセント用に長さ5〜10センチメートルの2つを切り取り、デバイスの出口穴に取り付けます。

サンプルを実行する前に、70%エタノールを含むシリンジで、出口チューブから流れるまでデバイスを手動でプライミングします。エタノールをデバイス内に少なくとも30秒間置いて滅菌します。次に、30ミリリットルのろ過されたPBSと1%BSAを60ミリリットルのシリンジにロードします。

また、標識された細胞を3ミリリットルのシリンジにロードし、どちらのシリンジにも気泡が閉じ込められていないことを確認します。ノズルから数滴の液体をそっと噴射して、気泡を取り除きます。インレットシリンジチップとチューブをシリンジに接続し、シリンジをシリンジポンプに固定します。

チューブをデバイスのそれぞれの入口に挿入し、チューブに沿って気泡がないことを確認します。流路系をセットアップしたら、デバイスを逆位相コントラスト顕微鏡に取り付けて、細胞ソーティングプロセス中のリアルタイムイメージングを行います。小さな廃棄物ビーカーと2本の15ミリリットルチューブを顕微鏡ステージ上の装置の近くに固定します。

デバイスの両方の出口からの出口チューブを廃棄物ビーカーに配置します。次に、サンプルシリンジの流量を毎分120マイクロリットルに設定し、シースシリンジを毎分1,200マイクロリットルに設定して、サンプルとシースバッファーの流量比を1〜10に設定します。デバイスを1分半運転して、流量が安定するチャンスを与えます。

ハイスピードカメラを使用して、位相コントラストのある明視野下でチャネル内壁付近の慣性集束セルの存在を確認します。定常状態の流れが達成され、デバイスが正しく動作しているときは、出口チューブを異なるバイアルに配置して、細胞出口と廃棄物出口から別々の溶離液を収集します。このデバイスは、蛍光シリカナノ粒子からTHP-1単球細胞の標識懸濁液を正しく選別することができます。

高速イメージングとフローサイトメトリー解析の両方で確認された高い分離効率が得られました。シングルステップ精製戦略により、標識された懸濁液および新鮮な緩衝液に懸濁した付着細胞を遠心分離を必要とせずに連続的に回収できます。このデバイスは、シリカとPLGAの両方のナノ粒子で高効率に分離でき、1ミリリットルあたり最大1,000万個の細胞を同じ高効率で分離できます。

このビデオを見れば、ナノ粒子で細胞を標識する方法を十分に理解できるはずです。また、専用のマイクロ流体デバイスを使用して余分な未結合粒子を除去することにより、標識された細胞を精製する方法も重要です。