Name: 誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ誘電泳動を用いたマイクロ流体デバイスにおける細胞とビーズの分離・操作法。プリント基板電極とPDMSチャンネルを組み合わせた実用的なアプローチを解説し、非接触粒子操作の基礎と応用を示す。

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我々は機器のセットアップの彼の援助のためのtrifurcating DEPアクチュエーションのためのチャネルとミッチェルCollensへの提供のためのウジンチャンに感謝の意を表したい。作業は、グラントOISE - 0951647を通じて、グラント99-2911-1-002-007を通じて台湾NSCによる米国NSFによってサポートされています。

機器のセットアップの一般的な図を図1Aに示されています。 PCB -サンプルのアセンブリはさらに、図1Bにおける断面模式で詳述されます。 1。 PCBの電極の準備： <ol><li>不均一な電界を生成するために、目的の形状に設計PCB電極。カスタマイズされたPCBの電極チップは、商業の製造設備（図1C）を介して注文することができます。 </li><li>印刷された各金属電極（図1D）の最後に半田付け、16ゲージのワイヤでのプレハブPCB電極を準備します。 <ol><li>電極の端の上に線を置きます。ワイヤを加熱するホットはんだごてによるPCBの金属部分の所定の位置にワイヤーを保持する。 </li><li>半田で線を埋めるために電熱線にはんだ少量の餌。 </li><li>線が半田で充填した後、はんだの温度が下がる一方な場所にワイヤーを保持している、はんだごてを削除します。 </li></ol></li><li> PCB上の各電気的な接続（図1D）のためのはんだ付けプロセスを繰り返します。 </li></ol> 2。マイクロ流体チャネルを準備します。 <ol><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのマイクロ流体チャネルをPDMSエラストマー、ダウコーニングからSylgard 184を用いて調製される。チャネルを定義するマスター金型は、通常シリコンウェハとSU - 8フォトレジストを使用して標準的な微細加工プロセスを経て作成されます。 </li><li> 5分間10:1の比で硬化剤に主剤を混ぜる。 </li><li>プレハブSU - 8マスター鋳型に液状PDMSを注ぎ、数分間真空に液体PDMSを公開することにより、気泡を取り除く。完全にすべての気泡を除去するために必要に応じて真空プロセスを繰り返します。 </li><li> 70 PDMS℃で2時間を治す。 </li><li>ウェハを壊さないように注意して、カミソリの刃を持つウェハからマイクロ流体チャネルをPDMSのスラブを削除します。 </li><li>マイクロ流体デバイスに体液と細胞を導入するためのパンチ穴。 （注：シリンジポンプ、重力や表面張力ベースのフローがすべてのDEPを使用することができます。） </li><li>それは、ほこりやごみの自由であることを保証するためにマイクロ流体デバイスを検査する。 PDMSのクリーニングは簡単に3Mスコッチマジックテープを使用して達成することができます。 </li><li>クリーンNo.0の厚さ（80〜130μm）のカバースリップの血漿結合はPDMSマイクロ流体チャネル。 15分の最小値は100℃でカバースリップ - マイクロアセンブリを加熱する。 </li></ol> 3。低導電性のメディアを準備します。 <ol><li>低導電性媒体は、8.5％ショ糖を混合して調製された脱イオン（DI）水で+ ​​0.3％グルコース（w / v）の1。 注：我々は以前に細胞が短い期間（約30分）のために低い伝導性にさらされた後、従来の細胞培養培地で日間培養することができることが示されている11。 </li></ol> 4。 PCBの電極上にマイクロ流体チャネルを組み立てます。 <ol><li> PCBとカバーガラスの間に緊密な接触を確保するため、PCB上にミネラルオイルを少量（約10μL）に置きます。 注：電極の可視化を減少させるためのオプションの手順では、黒の油性マジックや塗料の非常に薄い層で被覆するには、PCBの表面です。 </li><li>カバースリップは、石油（カバースリップダウン）との接触を形成するとともに、油を塗ったPCB上にカバースリップ-マイクロ流体チャネルのアセンブリを置きます。ゆっくりと良好な接触を確保し、細胞とビーズの可視化を損なうことができる空気の気泡を最小限に抑えるためにカバースリップ - マイクロアセンブリを押し込みます。完成したデバイスの例は、図1Dに示されています。 </li></ol> 5。ソートするとDEPを使用してビーズとセルを集中。 <ol><li> DI水または低伝導率のメディアとマイクロ流体チャネルを充填します。プラズマボンディングプロセスが一時的に通常は疎水性のPDMS表面を親水性にすることで、マイクロ流体チャネル内に水溶液を簡単にロードを容易にします。 </li><li>チャンネルリザーバー（図1C）に細胞および/またはポリスチレンビーズをご紹介。ここでは、ヒト大腸腺癌（HT - 29）細胞を使用してください。 </li><li> AC電源のアンプの入力にファンクションジェネレータの出力を接続し、電極の配線にアンプの出力を接続する。衝撃への潜在的な暴露からユーザーを保護するために電気テープを使用してセットアップのすべての電気配線と表面を覆う。機器のセットアップの概略図を図1Aに示されています。 </li><li> 1.0から1.5 MHzの正弦波出力を生成するためにファンクションジェネレータを設定します。出力の振幅は、PCBを80 - 100Vの出力を生成するRFパワーアンプ用に調整する必要があります。この作業でRFパワーアンプは、220から330 mVの周りの入力電圧を必要とします。別々のセルとビーズに、層流の速度は、ターゲットチャネルにメインチャネル（幅w =100μmの、高さh = 27μmの）内のセルとビーズを移動させる（幅w =100μmのDEPの力に準拠している必要があります、高さh = 27μM）。 注意：mを決定するためにPCBの製造業者に相談このようなPCBの過熱や溶融などの問題を回避するためにaximum動作電圧。安全な動作設定を決定するファンクションジェネレータとパワーアンプのメーカーの機器の製造元の仕様を確認してください。 </li><li>ソートの細胞とビーズにDEPを開始する。ポリスチレンビーズは、指定された周波数内で不均一な電場で負のDEPを体験し、一方のセルは、正DEPを経験する。これは、DEP力活性化のbioactuationと細胞と電極として手頃な価格で再利用可能なプリント基板を使用してマイクロ流体デバイス内の他の粒子の分離が可能になります。 </li></ol> 6。代表的な結果： DEPが作動細胞または粒子で効果的であるときは、不均一な電場内で堅牢なアラインメントは、静的なバスまたは低速流体の速度のために観察される。高い流体速度の条件下では、細胞または粒子挙動は電場の軸流と流速の相対的な向きに依存する。さらに、細胞と粒子の挙動も、電界強度および電場内の非均一性の程度に依存しています。細胞または粒子の典型的な行動は、"真珠のチェーン、"サイクリング、失速、または回転などがあります。 妥協または廃止DEPは、流体、弱電界の強さ、過度の流速、厚すぎるカバーガラス、またはカバースリップとPCBの電極間の導電性溶液中の塩または他のイオン性分子の存在を含めることを条件（例えばクラックカバースリップが誘発することができます）水と鉱物油の混合。 ここで、0番厚みのカバースリップ（80〜130μm）との電極間隔（231μm）を使用しているとき、電界強度の二乗の勾配は、HT - 29細胞とビーズに適用さが2の間と推定される-8〜6-8 V 2 /μmの3 1 DEPの力は、静的な流体（図2A - B）にDEPによって操作される粒子の速度を、測定することによって推定することができる。粒子の小さな慣性とマイクロ流体チャネルの粘性の高い環境のために、流体抵抗力が等しくなるが、DEPの力と反対の方向です。低導電性媒体における平均的なビーズ速度は、DEPの93 Vppの電圧と1.5 MHzの34.5μm/ sのです。流体抗力は次式で計算することができます。1 F ドラッグ =6πηRv 20℃の低導電性の媒体の平均粘度η° Cは1.27 mPa ・•sでビーズ半径Rは7.5μmである。ポリスチレンビーズのための流体抵抗力が6.19 pNのと推定される。 （図2C - F）マイクロ流体チャネル内にビーズを作動させる能力を示すために、我々は、表面張力の媒介の流れを用いることによって、低導電性の媒体の流れを開始した。個々のチャネル内の平均速度が565μmの/秒（図2C）に減少したのに対し、単一の入力チャネルの平均ビーズ速度は、1540ミクロ​​ン/秒であった。 DEPを開始することによって、ビーズはむしろサイドチャネルに放出されているよりも中央のチャネル内に保持された。従って、これらの条件下で、DEP軍は2つのサイドチャンネルに流体の抗力に打ち勝つのに十分であった。 同じ原理は、単にDEPの電極（図2E - F）のようにチャンネルとビーズの流れの向きを変更することにより、中央の運河からのシングルサイドチャネルにビーズをそらすために使用されていました。ビーズは三つの部分に分かれることのポイントに近づくとDEPが開始された単一の入口チャネル、の側に金属電極を釣りことにより、ビーズをチャネルの側面に導かれた。そこに、DEP軍は層流がチャネル（図2F）がそれらを推進するために続け側のチャンネルの一つにビーズを引っ張るために十分であった。 細胞とポリスチレンビーズが不均一な電界で分極し、作動させる能力に明らかな違いを持っ​​ているので、我々は同時に、細胞とビーズのオンチップ分離を実行する能力を実証するためにDEP使用。我々は、図2E - Fで設定した同じ流体チャネルの構造と基板電極を使用するが、単一の入口チャネル（図3）に、低導電性の媒体でHT - 29細胞とビーズの懸濁液を導入しました。ビーズは右上の個々の出力チャネルに保持されたのに対し、DEPが導入されている場合、およびこれらの条件下で、HT - 29細胞は、2つの左出力チャンネルに保持された。それらは左出力チャネルで収集されるここで細胞が特徴的な"真珠チェーン"の動作を示す。時折ビーズと細胞は、それらはしばしば細胞の出力チャンネルで、一緒に回収された一緒に添付さになる。この実験かららのデータは、我々は713分あたりの粒子（細胞とビーズ）、または20分に14260細胞とビーズの同等のようにソート率を決定する。取得された細胞とビーズの数は、分子生物学、イメージング、生化学およびラボオンチップアプリケーションに関連すると便利です。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。マイクロ流体チャネルの細胞および粒子のPCBベースのDEP。（A）DEPベースの作動のための機器のセットアップは、の信号強度を高めるためにして、パワーアンプを電気信号の周波数と振幅を定義するためにファンクションジェネレータで始まるPCB上で生成される電界。 （B）サンプルの作動のためのマイクロ流体デバイスアセンブリは、不可逆的に無にバインドされたPDMSマイクロ流体チャネルから構成されます。細胞および/またはビーズを入浴するには、0の厚さの酸素プラズマを介してカバースリップ（80〜130ミクロン）、非導電性の媒体。 （C）PCBの電極は、電極が強力な不均一な電界を生成するために櫛歯されている2つの領域から構成されてここで使用。 （D）完成した装置：シングルカバースリップ上でtrifurcatedマイクロ流体デバイスとPCBは、挿入図は、電極ワイヤで全デバイスを示しています。 （CD）のスケールでは、PCBの測定値は8.4センチ（L）、2.1 CM（w）は、5ミリ幅の電極としています。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 DEPアクチュエーション前および実行中にチャネルの細胞とビーズの代表的な画像。（）層流のないPDMSマイクロ流体チャネル、（時間経過、1.23秒）内の低伝導率のメディアソリューションで15μmの蛍光ポリスチレンビーズ。 （B）DEP開始されると、ビーズは、電極（時間経過、8.18秒）の間にPCBの電極パターン（ブラックストライプ）ではなく、向かって移動。 （C）層流の下で同じチャンネル内のビーズが3つのチャンネル（経過時間、5.3秒）の間で分割され、DEPが（D）開始されるとき、ビーズは中央のチャネルにのみ流れるように作動している（時間経過、4.3秒）。 （E）PCBの電極へのチャネルの向きを変更することにより、ビーズを差動ではなく、（D）に示すような中央のチャンネルよりもDEPを使用する側のチャネル（F）に向けることができる。 （EF）の経過時間はそれぞれ、8.23秒と5.16秒です。すべてのスケールバー= 100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。前にDEP、ヒト大腸腺癌の混合溶液（HT - 29）3つの個別出力チャネルに1つのチャネルからの細胞とビーズの流れを開始する前とDEP作動中。チャンネル （AB） の細胞とビーズの代表画像 。オープン矢印は層流とチャネルの方向は方位と明確化のための破線で囲まれている識別します。特定されるように（CD）誘導DEPにより、ビーズと細胞が選択的に別々のチャンネルに作動している。ビーズは右チャンネルを終了するのに対し、HT - 29細胞は、中央と左チャンネルを終了します。ビーズと細胞の特徴的な真珠のチェーンは、DEP作動中に観察される。マイクロチャネル中の細胞とビーズの（A、C）微分干渉コントラストイメージングは​​、ビーズが簡単に見えるレンダリングします。同じDIC画像（、C）のグロースケールの強度画像（B、D）は、チャネル中の細胞の可視化を向上させる。反射金属電極（（A、C）の光のストライプと（B、D）黄色と緑色）効果的なDEPベースの作動のために電極にマイクロチャネルを揃えるための著名なランドマークを提供する。スケールバー= 100μmの。

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<li>Li, H. B., Zheng, Y. N., Akin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+modeling+of+a+microfluidic+dielectrophoresis+filter+for+biological+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+Syst%22%5BJournal%5D)">Characterization and modeling of a microfluidic dielectrophoresis filter for biological species.</a> J. Microelectromech. Syst. 14, 103-103 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マイクロ流体デバイスの細胞操作では、ソートまたは単一細胞の選択的配置、または人口調査のための望ましい2層流をマイクロ流体デバイス内のセルを操作するためのバルブとポンプと組み合わせて使用されている。しかし、単独でこれらのメソッドは、チャレンジングなものであり、詳細な製造プロセスやスキルを必要とする3遠心分離は、セルの配置のための要求を簡素化することができますが、同時イメージングが課題となって、希望する操作と考えると効果を設計する際に、さらに、遠心分離用チャネルのアーキテクチャは、慎重に検討する必要があります。求心力の4レーザーピンセットは、セルの配置に使用することができますが、方式はコストとハイスループット細胞選別のための従順ではない。しかし、5、DEPが有効なセル配置のための"電気ピンセット"の効果的なシステムとして実証されている、特性評価と操作。6,7 特に、DEPは、細胞塊の測定のために共鳴センサーの細胞を収集するための7-10と、選択的に生活と死細胞のオンチップ処理のために細胞を捕捉し、ソートするために使用されています。11我々は以前にDEPを増やすことによっていることを実証した流体抗力上記細菌またはビーズ上での力、ポリスチレンビーズ及びリステリアモノサイトゲネスV7のオンチップ濃度とトラッピングを達成することができる。E. 12混合集団は、 大腸菌とL.リステリア菌の細菌はまた、DEPのパルスによって誘導し、リリースすることができます。小さ ​​な粒子が捕捉されていませんが、流体の流れで削除されるのに対し、さらに、より大きな粒子は、差動、大きな粒径に基づいて、電極上に捕捉、濃縮することができます。13 DEPの力が粒子上に流体ドラッグする力を克服していないときは、ビーズや細胞がキャプチャではなく、流体ストリーム内で移動されていません。図2Cに示すように、ビーズは中央のチャネルでビーズを保持するのに十分な流体の流れの中央部に集中することができます。これは、DEPが強制的に、これらの組み合わせ、または他のいくつかの未定義の効果をドラッグするよりも大きい流体速度の電界内の粒子間の粒子の影響の相乗効果が原因である可能性があります。 非接触DEPの新しい進歩は、このようにDEP操作中に、最大限に、細胞の種類を保護する、必要最小限のフィールドで、セルのキャプチャと操作を最大化を可能にする。1,9接触DEPは、ソートのためのマイクロ流体のコミュニティへの約束、収集とポジショニングの細胞を提供していますマイクロ流体デバイス内で。我々は、増加の需要、およびマイクロ流体デバイス内で操作するためのDEPの実装で、更なる発見と技術革新がDEP力の理解と影響力を拡大すると予想している。 PCBは、その実用化のための良いプラットフォームを作り、迅速な製造の所要時間と手頃な価格で大量生産工程を経て製造することができる。さらに、PCB類は使いやすく、オンチップ細胞操作やソートのための分野の範囲での科学者のためにアクセス可能です。 PCBの電極のレイアウトを設計する際に、考慮が必要な粒子/細胞軌道に与えられるべきである。検討のための主要な要因は、粒子サイズと種類（ビーズおよび/または細胞）、細胞型、マイクロサイズ、流速、電極間隔（電界強度を決定する）、カバーの厚さ、および流体の導電性が含まれています。これらの要因は、粒子または細胞、および最終的には分離効率を操作するために必要な、利用可能な力に影響を与える。ここで紹介する我々のプロトコルは、ミクロスフェアおよび細胞分離のためにDEPを開始するための効果的なセットアップを示しています。潜在的なアプリケーションの場合、ユーザーは各アプリケーションの効率を最適化するために、細胞とビーズの所望の流路だけでなく、電極パターンとマイクロ流体チャネルの設計のアーキテクチャと一致している必要があります。電極間隔とカバーガラスの厚みは、マイクロ流体チャネルのレイアウトを設計する以前に報告されたガイドラインに従って使用することができます1。 細胞はそのまま維持しながら細胞/粒子と周囲の媒体の導電率と誘電率は、正または負のDEPを容易にするために十分異なっている必要があります。球状​​粒子のDEPの極性は、DEPの電圧の周波数ωで、次のクラウジウス - Mosotti因子の複雑な値の実数部から決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）"> 式（1） この式のεに、誘電率、σは導電性であり、そしてε*は複素誘電率である。添え字のpとmそれぞれ、粒子やメディアを表す。セルがメディアよりも高い誘電率を持っている、またはクラウジウス - Mosotti係数の実部が正になるときは、粒子は周囲の媒体よりも偏光になります。不均一な電界により、粒子の偏光が不均一になり、これは、より高い電界強度を持つ地域に向けてセルを描画するポジティブDEP（+ DEP）力を作成します。細胞が周囲の媒体よりも低い誘電率、またはクラウジウス - Mosotti因子負になるの実部を持つ場合、それは負のDEPを（- DEP）受けることになる、とセルは最小限のフィールド領域に向かって強制される。セルとメディアがほぼ同じ複素誘電率を持っている場合、力はセルを操作するために生成することはできません。このような理由から、純粋な水は、DEP粒子操作用の優先メディアです。しかし、純水からの細胞に浸透圧ストレスを回避するために、低導電率のメディアは、導電率を据え置くことを定式化したが、細胞に浸透圧ストレスを減少させるために浸透圧を増加させる。従来の細胞培養培地やDMEMまたはPBSのような生理的緩衝液は、DEPの操作には適していない高導電率を、持っている。 我々はまた、以前に細胞が低導電性の媒体を使用してDEPを持つセンサーで捕捉することができることを実証した。細胞接着のための短い期間の後、低導電率のメディアは、日間、細胞の成長をサポートするために必要な細胞培養培地に置き換えることができます。11 我々の経験から、蛍光ビーズは生細胞の蛍光に関して非常に明るい、従ってそれは生きていると蛍光セルの強さにビードの強度に合わせて、挑戦することができます。細胞とビーズの両方の可視化を改善するために、我々は、イメージング用正立顕微鏡の両方でDIC顕微鏡を使用していました。細胞とビーズを表示するには、我々は、見やすくするための幅広い色スペクトルのデータを保持する強度グロースケール画像、内のデータを発表した。従って、関心の研究を設計する際に、画像パラメータおよびリソースを考慮する必要があります。 要約すると、我々は選択的にDEPを使用して別々のチャンネルにビーズと細胞を作動させる能力を示す。細胞生物学、生化学および生物工学のアプリケーションのためのマイクロ流体チャネルの増加ユーティリティを使用すると、DEPは、セルのコレクション、配置、および並べ替えのための望ましいオプションです。 PCBの電極の製造が安価で便利ですが、電極は使いやすく、そして迅速な製作時間は、DEPの実装に最適です。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 キット (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>16 awg フックアップワイヤ</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>ゴールドシール カバーガラス</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>No. 0 厚さ, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Miltex 生検パンチ</td><td>VWR international</td><td>95039-104</td><td>Miltex, 各種サイズ</td></tr><tr><td>カスタム PCB 電極</td><td>Bay Area Circuits</td><td>カスタムパーツ</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>施設内 DI 水供給装置</td><td>なし</td><td>ろ過済み DI 水を使用</td></tr><tr><td>D-グルコース 無水顆粒 AR 級</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖, 結晶</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ポリマー微小球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>15&amp;#x03BC;m Dragon green 微小球</td></tr><tr><td>HT-29 細胞株</td><td>ATCC</td><td>HTB-38D</td><td>ヒト結腸腺癌</td></tr><tr><td>0.05% EDTA 含有トリプシン</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600FN 正立顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Phantom V310 高速イメージングカメラ</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>BX51 正立研究用顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>SpotFlex 高解像度カラーカメラ</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>関数発生器</td><td>Agilent Technologies</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>RF パワーアンプ</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

マイクロ流体デバイスは、細胞を選別し、計数、操作、勉強のためにセルの規模で動的な流体環境を提供することにより、細胞の研究を進めてきた。しかし、流体領域内のセルを操作することが課題のままとバルブと電極を形成するための複雑な製造プロトコルを必要とする、または光ピンセットのような特殊機器を必要とします。ここで、我々は（PCB）は、従来のプリント回路基板を示すbioactuationするため、およびマルチチャネルマイクロ流体の細胞とビーズの分離のための層流の分野でのビーズと細胞操作のための採用誘電泳動（DEP）による細胞の非接触操作に使用することができますデバイス。最初に、我々は、DEPの電極とマイクロ流体デバイスの組み立て、およびDEPのために細胞を調製するためのプロトコルを提示する。その後、我々は、ポリスチレンビーズでDEPの動作を特徴付ける。最後に、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイスのビーズと細胞分離の代表的な結果を示す。要約すると、DEPは、マイクロ流体デバイス内での粒子（ビーズまたはセル）を操作するための効果的な方法です。

誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイス内でビーズと細胞操作と分離を示しています。

マイクロ流体デバイスは、細胞スケールでダイナミックな流体環境を提供することで、細胞の研究、操作、分取などの細胞研究を推進してきました。

本手順の全体的な目的は、プリント回路基板（PCB）を用いた誘電泳動（DEP）により、マイクロ流体デバイス内の細胞およびビーズを操作することです。まず、PCB電極とマイクロ流体チャネルを設計し、作製します。次に、PCBマイクロ流体アセンブリ、ならびにビーズおよび細胞の溶液を調製します。手順の第3ステップは、チャネルに低電導度培地を満たし、次にビーズと細胞をロードすることです。手順の最終ステップは、PCBアセンブリをパワーアンプおよびファンクションジェネレータに接続し、DEPを開始することです。最終的に、DEPを用いることで、マイクロ流体デバイス内での細胞とビーズの分離および操作を示す結果を得ることができます。一般的に、この手法を初めて導入する方は、目的の細胞やビーズの操作に適したマイクロ流体デバイス向けの効果的な電極を開発するために、DEPの原理を理解する必要があるため、困難に直面することがあります。一方で、PCBを電極として使用することで、マイクロ流体デバイスにおける細胞やビーズの駆動を、幅広い科学分野で取り組みやすいものにできます。本手順の最初のステップは、不均一電界を発生させるために、所望の形状を持つプリント基板（PCB）電極を設計することです。設計が完了したら、商用の製造施設を通じてカスタマイズされたPCB電極チップを注文します。特注のPCBが届いたら、開封して本デモンストレーションのための点検を行います。PCBのサイズは、長さ8.4 centimeters、幅2.1 centimetersです。金属電極の幅は5 mmです。この例では、電極は2本の長い金属ストリップと、電極が櫛形に組み合わされた（インターディジテートされた）長さ4.5 mmのクロス領域2箇所で構成されています。これらのインターディジテート領域は、強力な不均一電界を発生させ、刺激装置からPCB電極への接続を形成します。16ゲージのワイヤーを電極の端に配置します。加熱した半田ごてを使用して、PCBの金属部分にワイヤーを固定します。これにより、ワイヤーが加熱されます。はんだを加熱されたワイヤに当て、少量のはんだをワイヤに流し込みます。ワイヤにはんだが充填されたら、はんだが冷えるまでワイヤを固定したまま、はんだごてを離します。PCB上のもう一方の電気接続部についても、同様にはんだ付けの手順を繰り返します。次のステップは、目的の分岐パターンを持つマイクロ流路を作製することです。標準的な微細加工技術を用い、シリコンウェハーとSU-8フォトレジストを使用して、流路を定義するためのマスターモールドを作製します。このマスターモールドは、1つの入口流路と3つのターゲット流路で構成されています。チャネルの幅は100 micrometers、高さは27 micrometersです。マスターモールドを作成後、ポリメチルシリロキサン（PDMS）エラストマーと硬化剤を重量比10:1で混合し、5分間待ちます。液状のPDMSをあらかじめ作製したSU-8マスターモールドに流し込み、液状PDMSを3分間真空状態にさらして気泡を除去します。必要に応じて真空脱気工程を繰り返し、すべての気泡を完全に除去します。必要であれば、窒素ガスを吹き付けることで余分な気泡を除去することも可能です。PDMSを70 °Cのオーブンで2時間硬化させます。カミソリの刃を使用して、マイクロ流路を備えたP-D-M-S-Sラボをウェハーから取り除きます。流路部分を上にした状態で、ウェハーを破損させないよう注意してください。バイオプシーパンチを使用して、マイクロ流体デバイスに液体と細胞を導入するための穴を開けます。端を整えます。余分なPDMSを取り除きます。マイクロ流体デバイスを確認し、ほこりやゴミが付着していないことを確かめてください。3Mスコッチマジックテープを使用してPDMSを清掃します。PDMSチャネルと、洗浄済みの厚さ80～130 µmのNo.0カバーガラスをプラズマガスに1.5分間曝露させます。プラズマクリーナーからPDMSスラブとカバーガラスをペトリ皿に取り出し、PDMSマイクロ流路チャネルをカバーガラスの上に合わせ、プラズマ接合させます。このカバーガラスとマイクロ流路の組み立て体を、100 °Cに設定したホットプレート上で最低15分間加熱します。マイクロ流体デバイス作製の最終ステップは、PDMSチャネルとカバーガラスをPCBの電極の上に配置することです。まず、PCB上にミネラルオイルを約10 µL滴下します。PCBとカバーガラスを密着させるため、カバーガラス付きのマイクロ流体チャネルアセンブリをオイルを塗布したPCBの上に配置します。オイルに接触させながらカバーガラスマイクロ流体アセンブリを軽く押し下げ、密着性を高めて、細胞やビーズの可視化を妨げる気泡の混入を最小限に抑えます。もう一つの重要なステップは、脱イオン水を用いて、重量対容量比で8.5%スクロースおよび0.3%グルコースを含む低導電率培地ミックスを調製することです。これでマイクロ流体デバイスの使用準備が整いました。ピペットを用いて、必要に応じて各マイクロ流体チャネルに15から20 µLの低導電率培地を満たします。真空吸引を用いて、チャネル内の気泡を除去してください。次のステップは、テスト粒子をマイクロ流体デバイスに導入することです。本デモンストレーションでは、低導電性媒体に1µLあたり550個のポリスチレンビーズを分散させた懸濁液を使用します。ビーズは時間の経過とともに沈殿する場合があるため、攪拌して再懸濁させてください。次に、ピペットを使用して、ポリスチレンビーズ懸濁液200µLをチャネルに導入します。次のステップでは、電極を準備し、ファンクションジェネレーターの出力をAC電源アンプの入力に接続します。次に、アンプの出力を電極線に接続します。ユーザーが感電するリスクを防ぐため、すべての電線と装置の表面を絶縁テープで覆います。ファンクションジェネレーターを、1から1.5 MHzの正弦波を出力するように設定します。このセットアップで細胞とビーズの分級を開始するため、DEPを起動します。右側に入口チャネルがあり、3つのターゲットチャネルが三叉分岐点で分かれています。PCB電極は、層流がなくDEPもかかっていない状態の黒いストライプに対応しています。DEPを開始すると、流れがない状態ではビーズはほぼ静止しています。層流が流れているときは、ビーズはPCB電極に向かって移動し、電極間の空間から遠ざかります。DEPがオフの状態では、流入チャネルを流れるビーズは3つのターゲットチャネルに分散されます。DEPが開始され、層流が形成されると、ビーズは中央チャネルのみを流れるように駆動されます。以降のビデオでは、マイクロ流体デバイスをPCB電極の上で回転させ、チャネルの向きを変更しています。PCB電極に関して。以前はPCB電極に対して垂直であった入口チャネルは、層流状態ではほぼ電極と平行になります。しかし、DEPがオフの状態では、ビーズは3つのターゲットチャネルすべてに均等に入ります。DEPを開始すると、ビーズが三叉分岐点に近づき、DEP力によってビーズが電極上のサイドチャネルへと引き込まれます。ビデオの次の図では、ヒト結腸腺がん細胞（HT 29細胞）と蛍光ビーズの混合物がマイクロ流体デバイス内にある様子を示しています。このDIC画像において、開いた矢印は層流の方向を示しており、チャネルは破線で囲まれています。反射金属電極は明るい背景のストライプとして確認できます。ビーズのイメージングにはDIC顕微鏡が使用されており、輝度スケールを調整することで細胞をより可視化しています。この図は別の図と同じ画像ですが、グロースケールの強度画像として表示されており、ビーズだけでなく細胞も可視化されています。この図では、反射性の金属電極が黄色と緑色の縞模様として現れています。DEP（誘電泳動）を用いると、DIC画像に示されているようにビーズは右側のチャネルから流出しますが、HT 29細胞は、DEP開始前のグロースケール画像に示されているように、中央および左側のチャネルから流出します。細胞とビーズの混合溶液が、1つの入口チャネルから3つの独立したターゲットチャネルへと流れています。DEPを誘導した後、ビーズと細胞を選択的に異なるチャネルへと駆動させます。このビデオを視聴することで、マイクロ流体デバイス内での細胞およびビーズの操作に向けたダイアル電気泳動の実装方法について、十分に理解できるはずです。

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