細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

この手順の全体的な目的は、透過性メンブレンを備えたインサートを用いて2種類の細胞による細胞共培養システムを構築し、分泌される可溶性因子の拡散を可能にすることです。これは、2種類目の細胞を含むマルチウェル組織培養プレートに、1種類目の細胞を含むインサートを精密に配置する一連のステップによって達成されます。まず、インサートに細胞タイプ1を播種し、マルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ2を播種することから開始します。

第2ステップでは、インサートを細胞タイプ2を含むプレートのウェルへと移します。これにより、最終的に2種類の細胞タイプおよびそれぞれの超上清を回収することが可能になります。したがって、分泌された可溶性因子が標的となる細胞タイプに及ぼす影響を評価することができます。

多細胞生物において、分泌される可溶性因子はパラクリンシグナリングの結果として、異なる細胞型から応答を誘発します。そのため、インサート共培養システムの価値は、細胞間接触がない状態で、分泌可溶性因子によって媒介される細胞パラメータの変化を評価する独創的な手法を提供できる点にあります。インサート共培養システムは、他の共培養技術と比較して、次のようなさまざまな利点があります。1つ目は方向性のあるシグナリングであること、2つ目は細胞の極性が維持されること、そして3つ目は個々の集団における細胞変化を特異的に検出できることです。

リポポリサッカライドで活性化させたN9ミクログリアから分泌されるサイトカインが、神経細胞であるPC12細胞に及ぼす毒性影響を測定するための具体的なプロトコルを以下に詳しく説明し、これによりインサート共培養法の具体的な理解を深めます。まず、24ウェル組織培養プレートと0.4 µmポアのポリテトラフルオロエチレン製インサートをパッケージから取り出します。次に、滅菌ピンセットでインサートの上端を掴み、組織培養プレートの空のウェルにインサートを配置します。

次に、膜が完全に覆われるまで、ルーチンのN9培地をインサートに満たします。細胞の接着能を高めるため、インサートを少なくとも1時間、または一晩インキュベートします。インサートの準備が整ったら、ルーチンのN9培地を用いて、コンフルエンスが80〜90%に達したN9ミクログリアを剥離し、インサートへの播種に使用する細胞懸濁液を得ます。

次に、マイクロピペットのチップでメンブレンを突き破らないように注意しながら、インサートから通常培地を除去します。続いて、細胞懸濁液 50 µL を用いて、各インサートに 1 cm² あたり 60,000 個の細胞を播種するか、またはインサートメーカーのプロトコルに従って播種します。細胞懸濁液を分注する際は、時折チューブを反転させ、懸濁液が均一な状態に保たれるようにしてください。

すべてのインサートに播種した後、細胞を均等に分散させるため、プレートを前後、次に左右にゆっくりと揺らします。この際、細胞がインサートの中央に集まってしまうため、円を描くような動きは避けてください。その後、インサートが入ったプレートを24時間インキュベートし、N9ミクログリアの活性化へと進みます。

まず、10 mgのリポ多糖を量り取り、後で使用するために1.5 mLのエッペンドルフチューブに保存します。リポ多糖は強力な炎症性エンドトキシンであり、特別な安全対策が必要であるため、ゴーグル、手袋、および粒子用呼吸用保護具の着用を強く推奨します。その後、温めたN9処理培地を用いてリポ多糖の段階希釈を行い、4 µg/mL、2 µg/mL、および1 µg/mLのワーキングソリューションを調製します。

最後に、細胞を乱さないように注意しながら、インサートから培地を半分取り除きます。次に、リポポリサッカライド作業溶液25 µLをインサートに緩やかに加え、最終濃度を2、1、または0.5 µg/mLにします。共培養実験に進む前に、プレートをさらに24時間インキュベートします。

このステップでは、30,000 cells/cm²の密度で播種し分化させたPC12細胞の間質ニューロンと、前節で述べた通りリポポリサッカライドで24時間活性化したN9ミクログリアを使用します。まず、インサート内の培地をすべて慎重に除去し、温めた新鮮なN9処理培地50 µLに置換します。これにより、リポポリサッカライドを完全に除去し、活性化したN9ミクログリアのみの状態にします。

インサートは組織培養プレートのウェル内で固定されておらず、チップで壁面を強く押しすぎると動いてしまう可能性があることに注意してください。細胞が長時間空気に触れて乾燥するのを防ぐため、この操作はインサート1つずつに対して行ってください。その後、ニューロンPC12細胞の培地を完全に除去し、0.6 millilitersの新鮮で温めたPC12処理用培地と交換します。

細胞が乾燥しないよう、一つずつ丁寧に行ってください。ピンセットを使用してインサートの上端を掴み、ニューロン様PC12細胞が入ったウェルにそっと配置します。すべてのインサートを移し終えたら、インサートのメンブレン下に気泡がないかを確認してください。

気泡が存在すると、インサートのメンブレンを介した物質交換が妨げられ、実験全体に支障をきたす可能性があります。ピンセットでインサートをウェルから非常にゆっくりと持ち上げ、再び細胞培養液の中に戻すことで、ほとんどの気泡を除去してください。それでも気泡が消えない場合は、インサートを斜めにしながら、ゆっくりと細胞培養液に浸してください。

接着細胞が解離する可能性があるため、インサートを叩いたりかき混ぜたりしないでください。その後、インサート内とウェル内の両方の培地量を確認し、両方のコンパートメントの液面がほぼ同じ高さになるようにします。すべての気泡が除去され、培地量が適切であることを確認した後、プレートをインキュベートします。

その後、細胞、培養液、またはその両方を回収し、N9ミクログリアと神経細胞であるPC12細胞との間のパラクリンシグナル伝達の影響を測定できます。炎症性サイトカインを定量化するため、下層コンパートメントの細胞培養液を用いて酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を実施しました。その結果、活性化期間から24時間後において、2 µg/mLのリポ多糖（LPS）で処理したN9ミクログリアは、未処理のミクログリアと比較して、interleukin-6、tumor necrosis factor-alpha、interferon gammaなどの炎症性サイトカインを有意に多く分泌していることが示されました。

さらに、1 µg/mLのリポポリサッカライドで処理したN9ミクログリアでは、24時間後にインターフェロンγの分泌が著しく増加しましたが、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子-αの細胞培地レベルに有意な増加が見られるまでには48時間かかりました。対照的に、0.5 µg/mLの条件下では、活性化期間から24時間および48時間後のいずれにおいても、N9ミクログリアのサイトカイン発現は促進されませんでした。また、2 µg/mL群の24時間後のデータは、ミクログリア数が増加するミクログリオシスが起こっていたことを示唆しています。

しかしながら、細胞数が有意に増加したのは48時間後になってからであった。最終的に、サイトカイン分泌の亢進およびミクログリア症へとつながるミクログリア活性化の影響を評価するため、共培養した神経系PC12細胞において細胞毒性を評価した。損傷した細胞から放出される細胞外乳酸脱水素酵素のレベルを測定した結果、N9細胞へのリポポリサッカライドの濃度が高くなるにつれて、神経系PC12細胞の細胞死が増加することが明らかになった。

このように、これらの結果は、分泌された可溶性因子が共培養インサートのメンブレンを通過でき、細胞間接触がない状態でも神経系PC12細胞に細胞毒性ダメージを与え得ることを示しています。ここではインサート共培養の1つのシナリオのみを提示しましたが、これは非常に柔軟な手法です。本プロトコルでは、一方の細胞種を、可溶性因子の分泌を抑制させる分子で前処理し、その後インサートをウェルに転移させることで、もう一方の細胞種の挙動に影響を及ぼさせています。

しかしながら、2種類の細胞を共培養システムで一緒にインキュベートすることで、その後の処理に対する一方または両方の細胞集団の脆弱性の増大、あるいは耐性を検出することが可能です。この手法は、例えば、単純に2つの細胞集団を処理なしに共インキュベートさせ、基底状態におけるパラクリン的な相互シグナル伝達を評価するために利用できます。ここで示したように神経炎症の分野で有用であることに加え、共培養システムは、腫瘍の再生、神経炎症、アポトーシスシグナル伝達、あるいはパラクリンシグナル伝達の要素を含むその他のあらゆるトピックに関する幅広い疑問を解決するために使用できます。

このビデオをご覧いただいたことで、インサート共培養システムが、分泌される可溶性因子によって媒介される変化を評価するための簡便な手法となり得ることが十分にご理解いただけたかと思います。また、細胞間接触がない状態での多細胞パラクリンシグナリングの研究において、このインサート共培養システムが高い潜在能力を持っていることをお伝えできたと考えております。