Name: 細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶ インサート共培養システムを用いた細胞間パラクリンシグナリングの評価法。透過性膜で細胞を分離し、分泌可溶性因子の影響を解析できます。神経炎症などの研究に応用可能です。

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この作業は、MGMに対するカナダの自然科学工学研究評議会（NSERC）の助成金によって資金提供されました。JRはNSERC-Vanierの学生フェローです。

NB：哺乳動物細胞培養のために必要に応じて、以下のステップの各々は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきです。また、最適な滅菌細胞培養のための一般的なガイドラインは、適用例 、ヒントいつでも彼らは、交差汚染につながる時間細胞の量を減らすことができるの破棄正しく、メディア全体の変更を行うことなく、静かにすべての攪拌時に空気にさらされていますその均質なピペッティングなどを確保するために細胞懸濁液はまた、インサートは特別な処理を必要とするプラスチック製品の一種です。インサートが操作されたときにまず、簡単に涙ため、実験を危険にさらす可能性が脆弱な膜を、触れないように注意してください。膜を穿孔または接着細胞を解離の危険性があるとしても、細胞培養培地の真空吸引を行うためには適していません。次に、インサートは、マルチウェル組織培養プレートに緩くハングし、したがって、注意が時カ月使用しなければなりませんプラスチック製品をヴィングまたは接着細胞を解離避けるためにピペッティングするとき。大細孔サイズのインサートを使用する場合に加えて、細胞培養培地は、したがって、しばしば液体のレベルを監視することが重要であり、膜を通って浸透し、可能性があります。最後に、以下のプロトコルは、接着細胞用に設計されており、浮遊細胞に適したものにするために若干の変更を必要としていることに注意してください。 インサート共培養実験を行うための1.一般的なガイドライン<ol><li>挿入中の播種細胞型の第1位<ol><li>その梱包からの挿入をアンラップ。 </li><li>適切な大きさの空のマルチウェル組織培養プレートにインサートを配置します。これを行うには、グリップピンセットを用いて、インサートの最上端を。 </li><li>付着細胞の付着及び拡散を向上させるために、播種前に細胞培養培地でインサートを条件付けます。そうするために、細胞培養mediu有する膜の表面全体を覆​​いますマイクロピペットを用いてメートル。 注：必要な数の挿入のためにこれを行います。 </li><li>プレートに蓋を交換し、同じ条件下で、少なくとも1時間またはO / Nインキュベート（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li><li>インサートが調整されるときに、マイクロピペットを用いて細胞培養培地の全てを除去します。使用した培地を捨てます。 </li><li>マルチウェルプレートと同様に、新鮮な細胞培養培地中の種子の細胞型＃1。そうするために、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液の適切な量を描き、インサート中の液体を分注します。 注：必要な数の挿入を準備します。 </li><li>すべての挿入を播種した後、静かに細胞を均一に分配するために、次に前後に、左右のプレートを揺らし。これは、細胞がインサートの中心部に蓄積する原因となりますよう、円運動を行わないでください。 </li><li>携帯要件（通常37℃、5〜10％CO通りで指定された板の上に蓋を置き、インキュベート<sub&gt;の2）。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中に播種細胞型＃2 <ol><li>項1に記載の新鮮な細胞培養培地中の種の細胞型＃2。 </li><li>挿入の数のために必要な数のウェルを準備します。細胞が均等にウェル中に分布していることを確実にするために）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li>プレートに蓋を置き、同じ条件下でインキュベートする（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li></ol></li><li>インサートで爽やかミディアム<ol><li>マイクロピペットを用いて、細胞型の＃1を含むインサートで、一部または細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ゆっくりインサートの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、ステップ1.1.4に従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中でさわやかなミディアム<ol><li> micropiを使用しましたpette、一部または細胞型の＃2を含むウェルにおける細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ウェルの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、以前に確立された細胞培養プロトコルに従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞型＃2を含むマルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ＃1を含むインサートを移します。 注：両方の細胞型は、適切な成長段階に達したときに、この手順を実行します。 <ol><li> ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。 注：この時点で、それはインサートメーカーの指示によって指定された両方の区画内のメディアの適切な量を分注することが重要です。 </li><li>グリップ、セルTを含むインサートの最端をピンセットを用いてYPE＃1と優しくウェル細胞型＃2を含む適切なに配置します。 </li><li>すべての挿入を転送した後、インサートの膜の下に気泡が存在するかどうかを確認。 注：気泡がインサートの膜を横切る任意の交換を防止し、実験全体を危険にさらすことができます。 </li><li>気泡が存在する場合、非常に穏やかによく使用ピンセットからインサートを持ち上げて、細胞培養培地に戻って突入。気泡が消えます。彼らはまだ存在している場合は、角度でバック細胞培養培地への挿入を浸漬優しくしてみてください。 注：ノックや接着細胞を解離回避するために、インサートを攪拌しないでください。 </li><li>すべての気泡を除去し、両方の区画内のメディアのボリュームが、プレートに蓋を配置し、インキュベートすることを確認した後。 </li></ol></li><li>共培養系でリフレッシュメディア 注：この膜は容易にインサートとの間のメディアの交換を可能にし、よく、培地をリフレッシュすることで行われますが、拡散のみによって上下コンパートメントで平衡に達するのに要する時間が非常に長くすることができるので、両方の区画。 <ol><li>セルタイプの＃1を含むインサートで爽やか媒体はステップ1.3）と同様に行われます。 </li><li>セルタイプ＃2を含むウェル中の培地をリフレッシュするには、静かにピペットチップを収容するのに十分な広さのスペースを作成する側に挿入部をスライドさせます。 ）ステップ1.4のようにメディアを更新します。 </li><li> ）気泡の有無を確認し、1.5.5を介して手順1.5.3に従ってボリューム）を確認します。 </li></ol></li></ol> 2.例：神経PC12細胞にLPS活性化N9ミクログリアによって分泌されるサイトカインの効果を測定します注：以下の手順はよく特定のフラスコ、皿のサイズのために設計されています。しかし、このプロトコルは任意のプラスチック製品の寸法に合わせてカスタマイズすることができます。メディアや組成の材料表を参照してください。 <ol><li>マルチでのPC12細胞を播種し、差別化ウェル組織培養プレート<ol><li>暖かいルーチンPC12細胞培養培地、37℃の水浴中でPC12分化培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li> 75cm 2のフラスコから60から80までパーセントコンフルエンスでPC12細胞を使用してください。 </li><li> 15 mmのパスツールピペットで、フラスコ中の全細胞培養培地の真空吸引を行います。 </li><li>静かに滅菌リン酸緩衝生理食塩水5mlで細胞単層を洗浄し、パスツールピペットで液体を除去します。この段階で細胞を解離しないように注意してください。 </li><li>トリプシンEDTA 3mlで細胞単層を覆い、37℃で2~3分間インキュベートします。 </li><li>すべての細胞が顕微鏡下で分離されることを確認してください。非常に少数の細胞が浮遊している場合は、5分間の最大のために長い期間インキュベートします。 </li><li>トリプシンEDTAを不活性化するために、ルーチンPC12細胞培養培地10mlを加えます。 </li><li>ほとんどの細胞は、O底から解離していることを確認しながら10ミリリットルピペットで、穏やかに粉砕しますフラスコF。細胞懸濁液中の気泡を作成しないでください。 </li><li>同じ10mLのピ​​ペットを用いて50mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。 </li><li> 3200×gで1分間遠心操作</li><li>ペレットを乱さないように注意しながらパスツールピペットで上清を捨てます。 </li><li> 10ミリリットルピペットでルーチンPC12細胞培養培地の10ミリリットルを追加します。 注：ペレットが非常に小さい、または大きい場合には、この量を調整することができます。 </li><li>ペレットを均質化するために、同じ10ミリリットルピペットで粉砕します。 PC12細胞は、多くの場合、ピペッティング少なくとも20ので、一緒に凝集し、必要なdownare。 注：活発摩砕が必要であるが、細胞懸濁液中の気泡を作成しないように。 </li><li> 1.5mlチューブでは、トリパンブルー中の細胞懸濁液の適切な希釈を準備します。以前に確立されたプロトコール74に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>個別の50mlチューブに、細胞懸濁液を分割PC12分化培地で24ウェルプレートから（3万¢/ cm 2でよく、製造業者のプロトコルに従ってあたり0.6 ml）をウェルに播種するために希釈された細胞懸濁液を適切に得ることができます。 注：以前に確立されたプロトコル75で指定された24ウェルプレートは、以前に、コラーゲンでコーティングされている必要があります。 </li><li>よくマイクロピペットを用いて、あたりの細胞懸濁液0.6ミリリットルを配布します。 </li><li>全てのウェルを播種しているとき、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> PC12細胞の適切な分化は、共培養実験を行う前に、PC12分化培地15,16の5％CO 2の湿潤雰囲気中で37℃で7-9日間、24ウェルプレートをインキュベートすることを可能にします。 </li><li>液体の半分を除去し、新鮮なPC12分化培地の等量それを置き換えることにより、一日おきに培地交換を行います。 </li></ol></li><li>インサートにN9ミクログリアを播種し、LPSで処理します<ol><li>一日の共培養実験を行う前に、1.1.4からステップ1.1.1）以下、細胞接着を最適化するためにルーチンN9細胞培養培地とPTFE0.4μmの細孔インサートを前処理） </li><li> 37℃の水浴中で暖かいルーチンN9細胞培養培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li>一方、後で使用するために1.5mlチューブにLPSの約10mgの重量を量ります。 注：LPSが強力な炎症誘発性内毒素であり、特定の安全上の注意、メガネ、手袋、及び粒子状人工呼吸器を必要とするので、強く推奨されています。 </li><li> 75cm 2のフラスコから80〜90％のコンフルエンスでN9細胞を使用してください。 </li><li> ）2.1.14へのステップ2.1.3）に従います。常にルーチンN9細胞培養培地の代わりに、ルーチンのPC12細胞培養培地を使用します。また、N9ミクログリアが）ので、より少ないピペッティング上下がステップ2.1.13で必要になることがあり、一緒にPC12細胞がそうであるように同じくらいを凝集しないことに注意してください。 </li><li>個別の50mlチューブに、OにN9細胞培養培地で細胞懸濁液を分割24ウェルプレート中で保持するように設計されたインサート（60,000¢/ cm 2で、製造業者のプロトコルに従ってインサートあたりが0.05mL、膜表面積については、メーカーの情報を参照）を播種するための適切な希釈細胞懸濁液btain。 注：これらのインサートは、すでに製造者によって、コラーゲンでコーティングされており、細胞接着のために最適化されます。 </li><li>マイクロピペットを用いて、インサートあたりの細胞懸濁液の0.05ミリリットルを配布します。 </li><li>すべての挿入がシードされている場合、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> 4μgの2 / mlの/ mlであり、1μgの/ mlの作業溶液を得るために、N9の処理媒体を用いて、LPSの連続希釈液を実行します。 </li><li>ピペットを2μg/ mlの最終希釈を得るために、インサートの1組で4 / mlのワーキング溶液0.05ミリリットル。 </li><li>それぞれを1μg/ mlおよび0.5μgの/ mLの最終希釈液を得た異なるセットのインサート内の他の2つの作業のソリューションのための手順を繰り返し2.2.10）。 </li><li>に共培養実験を行う前に、LPSとN9ミクログリアの活性化を可能にするために、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間のインサートを含有するプレートをcubate。 </li></ol></li><li> N9ミクログリアと神経PC12細胞を共培養します<ol><li> PC12細胞を分化の7-9日目に、37℃の水浴中で暖かいN9処理媒体とPC12の処理媒体によって、LPSとのインキュベーションの24時間後N9ミクログリアを活性化させます。 </li><li> N9の処理媒体の0.1ミリリットルによって全体の使用済み培地を交換し、ステップ1.3）のようにN9ミクログリアの総培地交換を行います。すべてのinsert.Thisのためにこれを行うインサートでのみアクティブN9ミクログリアを残して、LPSの痕跡をすべて削除する必要があります。 </li><li>ステップ1.4のように神経PC12細胞の総培地交換を行います）。ステップ1.5のように24ウェルプレートへの挿入を移し）、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間または48時間N9-PC12の共培養を.Incubate。 </li><li> 24後時間または48時間、細胞毒性、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、または他のアッセイのために上清および/または細胞を回収。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

任意の挿入共培養系の実験の最も重要なステップは、実際に使用するための適切な挿入を選択する際に宿ります。孔径及び膜材料が播種される細胞の種類および実験の目的を考慮し忘れることなく、十分な考慮しなければなりません。例えば、走化性アッセイは、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析するために細胞共培養物よりも膜の同じタイプを使用することができます。細胞遊走および細胞 - 細胞接触を防止するために、細胞遊走を可能にするために、前者のために大きいもの、後者のために小さいもの：しかし、実験の両方のタイプは、異なる孔サイズを必要とします。細胞間接触の不在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価するために、彼らはタンパク質のような大きな分子、を可能として、0.4ミクロンまたは3ミクロンの孔サイズは、通常は適切である、やってからほとんどの細胞を横切るが、防止しますそう。膜材料は、大部分の細胞型および細胞培養プロトコルの終了時に使用される技術に依存します。彼らは明確であるが、コラーゲンサポートは、治療するために必要な接着細胞のための問題になることができ、コーティングされていないように簡単に説...

in vitroでの組織、器官またはシステムの研究では、多細胞生物を構成するいくつかの細胞のサブタイプの間に存在する非常に複雑な関係を簡略化しようとする試みです。実際、in vitro研究により、単一の細胞集団の詳細な理解を獲得することを可能にします。 1）細胞間相互作用を低減し、かつ容易に細胞環境を操作する2）能力：二つの主要なインビトロ実験で行う利点があります。したがって、これらの2つの利点が、科学者は、生物全体に外因性の影響の結果を調節する能力をもたらす、 インビボで特定の細胞型の挙動を予測することができています。その意味で、in vitroでの細胞培養は、多くの場合、基礎および応用生命科学を結ぶブリッジとして動作します。それにもかかわらず、in vitroでの作業のいくつかの欠点もありますが、最も重要なのは、特定の予約は、生理的に住むことがされていること観察された表現型のアルの関連性。実際には、単一の細胞型は、容器内で成長させた場合、培養物は、様々な程度に、失う、他の細胞型、組織および起源の生物、およびアンカー内から体液環境への貢献との細胞間接続細胞機能のために、時には重要な特定の三次元構造を維持することを可能にし、組織。 細胞間の関係の問題は、混合培養技術の開発によって対処されてきました。この方法では、2つ以上の細胞集団は、同一の培養容器中で一緒に増殖させます。しかし、これらの混合培養物は、重要な不具合を負うものとします。一方で、いくつかの細胞サブタイプは、物理的起源の組織で互いに相互作用しないと分泌可溶性因子と近くの受容体によって持続的なパラクリン通信のみに依存しています。これは、近位のサイトカインシグナル伝達に依存するいくつかの炎症過程の場合です。混合Cでultures、物理的な相互作用は不可避であり、それが不可能変更された結果を得ることができ、細胞 - 細胞接触の不在下でパラクリン通信を研究することを可能にします。一方、混合集団内の細胞特異的な解釈を達成することはかなりの結果に影響を与える可能性があり、過酷な分離技術を使用せずに実現不可能となります。 これらの重要な問題を解決するために、馴化培地の使用は、区画の文化とパラクリンシグナル伝達の研究を可能にする技術として開発されてきました。この方法は、細胞の他の集団を含むウェルに、従って培地馴化名前、一つの細胞型の上清の転送を必要とします。しかし、重要な欠点は短命分子が​​細胞の第二集団のウェルに転送する馴化培地中で十分に長く生存しないということです。でも寿命の長い分子が大きく拡散による時間をかけて希釈されます。さらに、両方のセル集団は一方向のみパラクリン通信ではなく、アクティブな双方向通信に参加しています。これは、 生体内に存在したように正確な多の関係を再作成に不可欠であるフィードバックシグナル伝達の欠如につながります。 結果として、より良いインビトロ細胞環境におけるインビボ条件で原稿をシミュレートする必要性によって駆動される、細胞培養技術におけるいくつかの進歩が長年にわたって達成されました。最も重要な進歩の一つは、1953年にGrobsteinによって初めて使用される細胞培養物を区画化するための微多孔膜と通気性支持体の使用であった1。このような透過性の支持体は、多数の細胞型に対応するために、使用することが長年にわたって調整されています複数の異なるアプリケーションインチ今日では、これらの支持体は、マルチウェル組織培養プレートまたはcircuのウェルに載るように設計されているように、中空のインサートを存在しますLAR料理。ウェルまたはディッシュが自分の体液性の環境（ 図1）上の細胞の二つの異なる集団の寄与を研究することができ、他の細胞集団が含まれているのに対し、共培養系では、インサートは、1セルタイプが含まれています。その結果、（頂端分泌または信号受信対側底）の細胞極性は、このように、インサート共培養システムを混合培養し、馴化培地技術より重要な利点を付与する、保存されています。膜材料のいくつかの種類は、ポリエステル（PET）、ポリカーボネート（PC）またはコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が最も一般的なもので入手可能であり、それらは0.4ミクロンから12.0ミクロンの範囲の異なる細孔サイズで存在します。材料および細孔サイズのこれらの種類は、これらに限定されない使用し、以下のためのさまざまなレベルで、それらを実用的に光学特性、膜の厚さと細胞接着に関連する変数の機能を発揮するインサートのスペクトルを提供します。 -studying透過膜を介して、走化性アッセイによる細胞分化、胚発生、腫瘍転移および創傷修復。 透過性の支持体上で培養上皮細胞または内皮単層を通ってそれらの輸送​​を評価することによって、薬剤の浸透を-evaluating、と。 -performing細胞の共培養は、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析します。 この論文の目的は、インサート共培養系を用いて、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価することで、上述した第三の機能を果たすために、一般的な方法論のガイドラインを記述することです。研究のいくつかの異なるフィールドは、細胞の集団に分泌された可溶性因子の影響に関連した質問に答えるために、インサート共培養システムを利用します。実際、さまざまなレベルで細胞の挙動を調節パラクリンシグナル伝達は、全ての組織において適切ですインサート共培養システムを持つシステムでは、これらの分野の進歩を確保するために欠かせません。逆に、そのシグナル伝達を確認することができるインサートの使用は、直接細胞 - 細胞接触によってではなく、分泌された因子によるものです。インサートの最も重要な用途の一つは、炎症の研究分泌されるサイトカインの効果は、免疫の種々の細胞の選手で評価され2-14です。特に、中枢神経系（CNS）の炎症の研究は大きく、より良い神経炎症15-21を駆動におけるニューロンとミクログリアの明確なパラクリン役割を定義することができましたインサート共培養研究から利益を得ています。これらのシステムはまた、炎症誘発因子22〜26の分泌を低減または阻害する能力に依存している分子の抗炎症の可能性を研究するために考案されました。血管新生32-34のメカニズムとinflammati特に癌27-31に関連する研究、腫瘍形成における35-42に、また挿入共培養システムから利益を得ます。また、可溶性因子は、分化を駆動プロセスで最も重要であり、いくつかの研究は、その特定のフィールド43-50で質問に答えるためにインサートを使用しています。 CNSにおいて、神経組織は、非常に限られた再生能力を有しているように見て、neurotrophism及び神経保護の研究は基本的であり、広く共培養システム51-56における幹細胞の使用によって保証されています。また、インサートはまた、腎臓57,58、内皮相互作用及び血管新生59-62、63-65シグナル伝達、アポトーシス、肥満やメタボリックシンドローム22,23,66-67の炎症、内耳有毛細胞の保護といったさまざまな分野で利用されています68,69、さらには菌の病原性70,71と寄生虫72,73インチこの記事では、experimを設定するために一般的な方法論的なガイドラインを提供していますインサート共培養系を用いて、分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価した図で​​ENT。特に、我々は神経細胞の共培養し、神経炎症過程を研究する上でのそれらの使用上の注意を焦点を当てます。パイロットに可能に挿入された実験の非常に広大なスペクトルを考えると、この細胞培養技術のあらゆる側面をカバーするために耐え難いです。一例として、特定のプロトコルは、インサート共培養方法の具体的な理解を提供し、詳細に説明するリポ多糖（LPS）によって分泌されるサイトカインの効果は神経PC12細胞上N9ミクログリアを付活測定します。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 ミディアム</td><td>シグマ</td><td>R8755</td><td>ウォーム 37 °;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>ダルベッコ 'のモディファイドイーグル」s ミディアム/ニュートリエント混合物 F-12 ハム</td><td>シグマ</td><td>D6421</td><td>ウォーム 37 &deg;使用前にCウォーターバスは、0.365 gm / L L-グルタミン</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>37 >Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>37°Cで温めます。マウス</td></tr><tr>の下顎腺<td>シグマ</td><td>N0513</td><td>からの神経成長因子-7S</td>を使用する前にCウォーターバス <td>凍結乾燥粉末を緩衝生理食塩水または0.1&ndashを含む組織培養培地の溶液に再構成します。1.0%ウシ血清アルブミンまたは1-10%血清</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>シグマ</td><td>T3924</td>ウォーム<td>37°C;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>リポ多糖類から&nbsp;大腸菌&nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>24</td></tr><tr><td>ウェルプレート用毒性細胞培養インサート</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &mu;m 細孔</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>使用前にコラーゲンをコーティング</td></tr><tr><td>ルーチンPC12細胞培養培地</td><td></td><td></td><td>ルーチンN9細胞培養培地</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;85% RPMIミディアム</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;90% DMEM-F12 ミディアム</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;10%熱不活化ウマ血清</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;10%熱不活化ウマ血清</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5%熱不活性化ウシ胎児血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12分化培地</td><td></td><td></td><td>N9治療培地</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;99% RPMIミディアム</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;99% DMEM-F12 ミディアム</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;1%熱不活化ウシ胎児血清</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;1%熱不活化ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50 ng / mL神経成長因子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12治療培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;99% RPMIミディアム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;1% 熱不活化ウシ胎児血清</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

細胞応答の変更における分泌可溶性因子の役割は、すべての組織とシステムの研究において繰り返されるテーマです。多細胞生物を構成するいくつかの細胞サブタイプ間の非常に複雑な関係を解明するために、研究者が単一細胞集団の詳細な理解を得るのに役立つin vitro技術が開発されました。これらの技術の1つは、分泌された可溶性因子を拡散させる透過性メンブレンを備えたインサートを使用する。したがって、インサートで増殖した細胞の集団を、細胞間接触がない場合のパラクリンシグナル伝達後の細胞変化を評価するために、異なる細胞タイプを含むウェルまたはディッシュで共培養することができる。このようなインサート共培養システムは、他の共培養技術に比べて、双方向シグナル伝達、保存された細胞極性、および細胞変化の集団特異的な検出など、さまざまな利点を提供します。これらの共培養システムは、炎症、がん、血管新生、分化の分野で利用されるだけでなく、中枢神経系に存在するさまざまな細胞サブタイプ間に存在する複雑な関係の研究、特に神経炎症の文脈において最も重要です。この記事では、インサート共培養システムを使用して分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価するための実験を設定するための一般的な方法論的ガイドラインを提供します。さらに、リポ多糖で活性化されたN9ミクログリアがニューロンPC12細胞に分泌するサイトカインの神経炎症効果を測定するための特定のプロトコルが詳細に説明され、インサート共培養の方法論を具体的に理解することができます。

インサート共培養システムの使用は、CNSの異なる細胞プレイヤー間パラクリン関係を披露神経炎症プロセスの研究に特に適切です。 CNSにおける免疫は彼らの安静分岐した状態（ 図2A）でその環境を監視し、検知乱れが可能であるミクログリアと呼ばれる常駐細胞によって主に達成される可能性がトラブルの適切な神経機能76-78のために必要な非常に貴重な恒常性。ミクログリアの活性化、アメーバ状の形状（ 図2B）の採用を特徴とした細胞集団の増殖は、サイトカインなどの炎症誘発性メディエーターの放出が続く、小膠細胞（ 図3）と呼ばれるが、神経炎症79の主側面を構成します。サイトカイン放出は、有害な攻撃に対してニューロンを保護する崇高な目的を果たすとCLOSですエリー監視しました。神経炎症は、この厳格な制御をエスケープするときしかし、それは破壊的な性質を採用し、真剣にCNSを傷つけることがあります。神経組織は非常に限られた再生能力を持っている限りは、CN...

多細胞生物では、分泌された可溶性因子がパラクリンシグナル伝達の結果として異なる細胞タイプからの応答を誘発します。インサート共培養システムは、細胞間接触がない場合に分泌された可溶性因子によって媒介される変化を評価する簡単な方法を提供します。

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

この手順の全体的な目的は、透過性メンブレンを備えたインサートを用いて2種類の細胞による細胞共培養システムを構築し、分泌される可溶性因子の拡散を可能にすることです。これは、2種類目の細胞を含むマルチウェル組織培養プレートに、1種類目の細胞を含むインサートを精密に配置する一連のステップによって達成されます。まず、インサートに細胞タイプ1を播種し、マルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ2を播種することから開始します。第2ステップでは、インサートを細胞タイプ2を含むプレートのウェルへと移します。これにより、最終的に2種類の細胞タイプおよびそれぞれの超上清を回収することが可能になります。したがって、分泌された可溶性因子が標的となる細胞タイプに及ぼす影響を評価することができます。多細胞生物において、分泌される可溶性因子はパラクリンシグナリングの結果として、異なる細胞型から応答を誘発します。そのため、インサート共培養システムの価値は、細胞間接触がない状態で、分泌可溶性因子によって媒介される細胞パラメータの変化を評価する独創的な手法を提供できる点にあります。インサート共培養システムは、他の共培養技術と比較して、次のようなさまざまな利点があります。1つ目は方向性のあるシグナリングであること、2つ目は細胞の極性が維持されること、そして3つ目は個々の集団における細胞変化を特異的に検出できることです。リポポリサッカライドで活性化させたN9ミクログリアから分泌されるサイトカインが、神経細胞であるPC12細胞に及ぼす毒性影響を測定するための具体的なプロトコルを以下に詳しく説明し、これによりインサート共培養法の具体的な理解を深めます。まず、24ウェル組織培養プレートと0.4 µmポアのポリテトラフルオロエチレン製インサートをパッケージから取り出します。次に、滅菌ピンセットでインサートの上端を掴み、組織培養プレートの空のウェルにインサートを配置します。次に、膜が完全に覆われるまで、ルーチンのN9培地をインサートに満たします。細胞の接着能を高めるため、インサートを少なくとも1時間、または一晩インキュベートします。インサートの準備が整ったら、ルーチンのN9培地を用いて、コンフルエンスが80〜90%に達したN9ミクログリアを剥離し、インサートへの播種に使用する細胞懸濁液を得ます。次に、マイクロピペットのチップでメンブレンを突き破らないように注意しながら、インサートから通常培地を除去します。続いて、細胞懸濁液 50 µL を用いて、各インサートに 1 cm² あたり 60,000 個の細胞を播種するか、またはインサートメーカーのプロトコルに従って播種します。細胞懸濁液を分注する際は、時折チューブを反転させ、懸濁液が均一な状態に保たれるようにしてください。すべてのインサートに播種した後、細胞を均等に分散させるため、プレートを前後、次に左右にゆっくりと揺らします。この際、細胞がインサートの中央に集まってしまうため、円を描くような動きは避けてください。その後、インサートが入ったプレートを24時間インキュベートし、N9ミクログリアの活性化へと進みます。まず、10 mgのリポ多糖を量り取り、後で使用するために1.5 mLのエッペンドルフチューブに保存します。リポ多糖は強力な炎症性エンドトキシンであり、特別な安全対策が必要であるため、ゴーグル、手袋、および粒子用呼吸用保護具の着用を強く推奨します。その後、温めたN9処理培地を用いてリポ多糖の段階希釈を行い、4 µg/mL、2 µg/mL、および1 µg/mLのワーキングソリューションを調製します。最後に、細胞を乱さないように注意しながら、インサートから培地を半分取り除きます。次に、リポポリサッカライド作業溶液25 µLをインサートに緩やかに加え、最終濃度を2、1、または0.5 µg/mLにします。共培養実験に進む前に、プレートをさらに24時間インキュベートします。このステップでは、30,000 cells/cm²の密度で播種し分化させたPC12細胞の間質ニューロンと、前節で述べた通りリポポリサッカライドで24時間活性化したN9ミクログリアを使用します。まず、インサート内の培地をすべて慎重に除去し、温めた新鮮なN9処理培地50 µLに置換します。これにより、リポポリサッカライドを完全に除去し、活性化したN9ミクログリアのみの状態にします。インサートは組織培養プレートのウェル内で固定されておらず、チップで壁面を強く押しすぎると動いてしまう可能性があることに注意してください。細胞が長時間空気に触れて乾燥するのを防ぐため、この操作はインサート1つずつに対して行ってください。その後、ニューロンPC12細胞の培地を完全に除去し、0.6 millilitersの新鮮で温めたPC12処理用培地と交換します。細胞が乾燥しないよう、一つずつ丁寧に行ってください。ピンセットを使用してインサートの上端を掴み、ニューロン様PC12細胞が入ったウェルにそっと配置します。すべてのインサートを移し終えたら、インサートのメンブレン下に気泡がないかを確認してください。気泡が存在すると、インサートのメンブレンを介した物質交換が妨げられ、実験全体に支障をきたす可能性があります。ピンセットでインサートをウェルから非常にゆっくりと持ち上げ、再び細胞培養液の中に戻すことで、ほとんどの気泡を除去してください。それでも気泡が消えない場合は、インサートを斜めにしながら、ゆっくりと細胞培養液に浸してください。接着細胞が解離する可能性があるため、インサートを叩いたりかき混ぜたりしないでください。その後、インサート内とウェル内の両方の培地量を確認し、両方のコンパートメントの液面がほぼ同じ高さになるようにします。すべての気泡が除去され、培地量が適切であることを確認した後、プレートをインキュベートします。その後、細胞、培養液、またはその両方を回収し、N9ミクログリアと神経細胞であるPC12細胞との間のパラクリンシグナル伝達の影響を測定できます。炎症性サイトカインを定量化するため、下層コンパートメントの細胞培養液を用いて酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を実施しました。その結果、活性化期間から24時間後において、2 µg/mLのリポ多糖（LPS）で処理したN9ミクログリアは、未処理のミクログリアと比較して、interleukin-6、tumor necrosis factor-alpha、interferon gammaなどの炎症性サイトカインを有意に多く分泌していることが示されました。さらに、1 µg/mLのリポポリサッカライドで処理したN9ミクログリアでは、24時間後にインターフェロンγの分泌が著しく増加しましたが、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子-αの細胞培地レベルに有意な増加が見られるまでには48時間かかりました。対照的に、0.5 µg/mLの条件下では、活性化期間から24時間および48時間後のいずれにおいても、N9ミクログリアのサイトカイン発現は促進されませんでした。また、2 µg/mL群の24時間後のデータは、ミクログリア数が増加するミクログリオシスが起こっていたことを示唆しています。しかしながら、細胞数が有意に増加したのは48時間後になってからであった。最終的に、サイトカイン分泌の亢進およびミクログリア症へとつながるミクログリア活性化の影響を評価するため、共培養した神経系PC12細胞において細胞毒性を評価した。損傷した細胞から放出される細胞外乳酸脱水素酵素のレベルを測定した結果、N9細胞へのリポポリサッカライドの濃度が高くなるにつれて、神経系PC12細胞の細胞死が増加することが明らかになった。このように、これらの結果は、分泌された可溶性因子が共培養インサートのメンブレンを通過でき、細胞間接触がない状態でも神経系PC12細胞に細胞毒性ダメージを与え得ることを示しています。ここではインサート共培養の1つのシナリオのみを提示しましたが、これは非常に柔軟な手法です。本プロトコルでは、一方の細胞種を、可溶性因子の分泌を抑制させる分子で前処理し、その後インサートをウェルに転移させることで、もう一方の細胞種の挙動に影響を及ぼさせています。しかしながら、2種類の細胞を共培養システムで一緒にインキュベートすることで、その後の処理に対する一方または両方の細胞集団の脆弱性の増大、あるいは耐性を検出することが可能です。この手法は、例えば、単純に2つの細胞集団を処理なしに共インキュベートさせ、基底状態におけるパラクリン的な相互シグナル伝達を評価するために利用できます。ここで示したように神経炎症の分野で有用であることに加え、共培養システムは、腫瘍の再生、神経炎症、アポトーシスシグナル伝達、あるいはパラクリンシグナル伝達の要素を含むその他のあらゆるトピックに関する幅広い疑問を解決するために使用できます。このビデオをご覧いただいたことで、インサート共培養システムが、分泌される可溶性因子によって媒介される変化を評価するための簡便な手法となり得ることが十分にご理解いただけたかと思います。また、細胞間接触がない状態での多細胞パラクリンシグナリングの研究において、このインサート共培養システムが高い潜在能力を持っていることをお伝えできたと考えております。

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JoVE Journal

Biology

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