細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

多細胞生物では、分泌された可溶性因子がパラクリンシグナル伝達の結果として異なる細胞タイプからの応答を誘発します。インサート共培養システムは、細胞間接触がない場合に分泌された可溶性因子によって媒介される変化を評価する簡単な方法を提供します。

この手順の全体的な目標は、透過性メンブレンを備えたインサートを使用して2種類の細胞の細胞共培養システムを作成し、分泌された可溶性因子の拡散を可能にすることです。これは、1つの細胞タイプを含むインサートを、第2の細胞タイプを含むマルチウェル組織培養プレートに細かく配置する一連のステップによって達成されます。まず、細胞タイプ1のシードをインサートから開始し、細胞タイプ2のシードをマルチウェル組織培養プレートで開始します。

2番目のステップは、細胞タイプ番号2を含むプレートのウェルにインサートを移すことです。最終的に、これにより、2つの細胞タイプとそれぞれの上清を収穫する能力が得られます。したがって、分泌された可溶性因子が目的の細胞種に及ぼす影響を評価することが可能です。

多細胞生物では、分泌された可溶性因子がパラクリンシグナル伝達の結果として、異なる細胞タイプから応答を誘発します。そのため、インサート共培養システムの価値は、細胞間接触がない場合に分泌された可溶性因子によって媒介される細胞パラメータの変化を評価する独自の方法を提供できることにあります。挿入共培養システムは、他の共培養技術に比べてさまざまな利点を提供します。2つの保存された細胞極性;細胞変化の3つの集団特異的検出。

リポ多糖によって分泌されるサイトカインの毒性作用を測定するための特定のプロトコル ニューロンPC12細胞に対するN9ミクログリアは、以下で詳述され、それによりインサート共培養方法論の具体的な理解を提供します。まず、24ウェル組織培養プレートと0.4ミクロンporポリテトラフルオロエチレンインサートをパッケージから取り出します。次に、滅菌ピンセットを使用してインサートの最上端をつかむことにより、インサートを組織培養プレートの空のウェルに配置します。

次に、メンブレンが完全に覆われるまで、インサートにルーチンのN9培地を充填します。インサートを少なくとも1時間、または一晩インキュベートして、細胞の接着能力を改善します。インサートの準備ができたら、ルーチンのN9培地を使用してN9ミクログリアを80〜90%のコンフルエンスで分割し、インサートの播種に使用される細胞懸濁液を取得します。

次に、マイクロピペットの先端でメンブレンに穴を開けないように注意しながら、インサートからルーチン培地を取り出します。次に、各インサートを50マイクロリットルの細胞懸濁液で平方センチメートルあたり60,000細胞で播種するか、またはインサートメーカーのプロトコルに従って播種します。細胞懸濁液を分配する際には、チューブを時々反転させて、細胞懸濁液が均一に保たれるようにします。

すべてのインサートが播種されたら、細胞が均等に分布するように、プレートを前後に、次に左から右に静かに揺らします。円を描くように動かすと、セルがインサートの中央に蓄積するため、避けてください。その後、インサートを含むプレートを24時間インキュベートしてから、N9ミクログリアの活性化を追求します。

まず、10ミリグラムのリポ多糖を計量し、後で使用するために1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに保管します。リポ多糖は強力な炎症誘発性エンドトキシンであり、特定の安全対策が必要なため、眼鏡、手袋、微粒子マスクを強くお勧めします。その後、温かいN9処理媒体を使用してリポ多糖の段階希釈のセットを作成し、ミリリットルあたり4、2、1マイクログラムの作業溶液を取得します。

最後に、細胞を乱さないように注意しながら、インサートから培地の半分を取り出します。次に、25マイクロリットルのリポ多糖作業溶液をインサートにゆっくりと加えて、ミリリットルあたり2、1、または0.5マイクログラムの最終希釈を生成します。プレートをさらに24時間インキュベートしてから、共培養実験を進めます。

このステップでは、1平方センチメートルあたり30,000細胞の分化した介在ニューロンにプレーティングされたPC12細胞と、前のセクションで説明したようにリポ多糖で24時間活性化されたN9ミクログリアが必要です。まず、インサートからすべてのメディウムをそっと取り出し、50マイクロリットルの新鮮で温かいN9トリートメントメディウムと交換します。これは、リポ多糖の痕跡をすべて除去し、活性化されたN9ミクログリアのみを残すために必要です。

インサートは組織培養プレートのウェル内で緩んでおり、先端が壁に強く押し付けられすぎると動き回る可能性があることに注意してください。このステップは、空気との長時間の接触による細胞の乾燥を防ぐために、一度に1つのインサートで実行する必要があります。その後、ニューロンPC12細胞培地を完全に取り除き、0.6ミリリットルの新鮮で温かいPC12治療培地と交換します。

細胞が乾燥しないように、これを一度に1つずつよく行います。ピンセットを使用して、インサートの最上端をつかみ、ニューロンPC12細胞を含むウェルにそっと置きます。すべてのインサートが転送されたら、インサートのメンブレンの下に気泡が存在するかどうかを確認します。

気泡は、インサートのメンブレンを横切る交換を妨げ、実験全体を危険にさらす可能性があります。ピンセットを使用してインサートをウェルから非常に静かに持ち上げ、細胞培養培地に戻すことにより、気泡を取り除きます。ただし、気泡が持続する場合は、インサートを細胞培養培地に斜めにゆっくりと浸してみてください。

インサートをノックしたり、攪拌したりしないでください、これは接着細胞の解離を引き起こす傾向があるからです。その後、インサートとウェルの両方のメディアの量を確認すると、両方のコンパートメントの液体がほぼ同じレベルになっているはずです。すべての気泡が除去され、培地の量が適切になったら、プレートをインキュベートします。

その後、細胞、培地、またはその両方を回収して、N9ミクログリアとニューロンPC12細胞との間のパラクリンシグナル伝達の影響を測定することができます。酵素結合免疫吸着アッセイを下部コンパートメントの細胞培養培地で実施し、炎症誘発性サイトカインを定量しました。その結果、活性化期間の24時間後、リポ多糖類1ミリリットルあたり2マイクログラムで処理したN9ミクログリアは、治療されなかったミクログリアと比較して、インタールケン-6、腫瘍壊死因子-α、インターフェロンガンマなどの炎症誘発性サイトカインが有意に多く分泌されたことを示しています。

さらに、リポ多糖類1ミリリットルあたり1マイクログラムで処理したN9ミクログリアは、24時間後により多くのインターフェロンガンマを分泌しましたが、インタールケン-6および腫瘍壊死因子-αの細胞培地レベルの有意な増加が見られるのに48時間かかりました。対照的に、0.5マイクログラム/ミリリットルの条件では、活性化期間の24時間後と48時間後の両方で、N9ミクログリアのサイトカイン発現を増強できませんでした。さらに、ミリリットルあたり2マイクログラムのグループで24時間後のデータは、ミクログリア症、つまりミクログリア人口の増加があったことを示唆しています。

しかし、セルラー数が大幅に増加したのは48時間後でした。最後に、サイトカイン分泌の増強とミクログリオスにつながるミクログリアの活性化の結果を評価するために、共培養したニューロンPC12細胞の細胞毒性を評価しました。損傷細胞から放出される細胞外乳酸デヒドロゲナーゼのレベルを測定することにより、N9細胞のリポ多糖濃度が増加するにつれて、ニューロンPC12細胞はより多くの細胞死を示すことがわかりました。

このように、これらの結果は、分泌された可溶性因子が共培養インサートの膜を通過でき、細胞間接触がない場合にニューロンPC12細胞に細胞傷害性損傷を引き起こす可能性があることを示しています。ここではインサート共培養のシナリオを1つだけ紹介しましたが、これは非常に柔軟な手法です。このプロトコルでは、1つの細胞型を、インサートをウェルに移すと第2の細胞型の挙動に影響を与える可溶性因子の分泌を減少させる役割を担う分子で前処理しました。

しかし、共培養システム内で両方の細胞タイプを一緒にインキュベートして、一方または両方の細胞集団の後の処理に対する弱さまたは耐性の増加を検出することが可能です。この手法では、処理を行わずにインキュベートした2つの細胞集団を単純に利用して、例えば、パラクリン基底の相互シグナル伝達を評価することができます。ここで示したように、神経炎症の分野で評価されているだけでなく、インサート共培養システムは、腫瘍の再生、神経ラチリスマ、アポトーシスシグナル伝達、またはパラクリンシグナル伝達の成分を持つその他のトピックに関連する幅広い質問に答えるために使用できます。

このビデオを見た後、挿入共培養システムが分泌された可溶性因子によって媒介される変化を評価する簡単な方法をどのように提供できるかを十分に理解しているはずです。そして、細胞間接触がない場合の多細胞パラクリンシグナル伝達の研究において、このインサート共培養システムの高い可能性をお客様にご理解いただけたことを願っています。