細菌、腸、免疫細胞における毒物学的および免疫調節療法のための非同期システムを開発するための3Dフリップウェル工学

私たちは腸内粘膜環境を模倣した3D共培養システムを開発し、シリアルクロストークを研究し、薬物スクリーニングや粘膜細胞相互作用の理解に活用できる薬物応答の評価を目指しています。異なるグループは、非常に複雑なバイオエンジニアリング技術を用いて腸粘膜環境をモデル化するために複数の異なる培養システムを開発してきました。しかし代わりに、より安価な材料で作りやすい共培養システムを開発しました。

共培養システムは、タンパク質生成薬剤が腸内細菌、上皮細胞、免疫細胞間で協調反応を引き起こし、細菌代謝物と共に宿主免疫を活性化し、種間コミュニケーションを媒介していることを明らかにしました。好気性および無気性細菌株とその代謝物を研究し、免疫調節効果を明らかにし、細菌代謝物に基づく新たな免疫治療戦略の道を切り開くことを目指しています。まずは、ペトリ皿の蓋を開けて脇に置いてください。

ペトリ皿の底の端にメスの刃を置きます。滅菌ピンセットを使い、インサートを優しく底から上に掴んで包装から取り出します。もう一方の手では、滅菌メスの刃をインサートに近づけます。

C字型の動きで膜の端を貫き、メスの刃をインサートの底部に優しく滑らせ、プラスチックの壁に近づけます。PET膜を切り取り、2セット目のピンセットで取り除きます。その後、メスの刃で白い膜の削り屑をこそげ取り、インサートの縁と縁をきれいにします。

次に、2〜3ミリのシリコンビーズをインサートの底全体に優しく広げますが、膜に触れないように注意してください。2セット目の滅菌鉗子を手に取り、膜なしで最初の挿入物を保護パックから慎重に取り出します。2つのインサートを底から底まで合わせて、底縁が揃うようにします。

フリップウェルスタックを接着したら、元の滅菌パックか深いペトリ皿に入れて72時間乾燥させます。指定されたペトリ皿の蓋を使ってスタックアセンブリを覆います。スタックアセンブリを滅菌するには、滅菌鉗子を使ってフリップウェルスタックを指定された深いペトリ皿の縁に吊るします。

次に、バイオセーフティキャビネットのガラスサッシを閉めて紫外線を点灯します。コラーゲンコーティング前に漏れを検査するには、まず500マイクロリットルの無菌PBSまたは無菌脱イオン水を加えます。翌日、テスト用の液体を吸引してから、バイオセーフティキャビネット内で1〜2時間乾燥させます。

膜をコラーゲンでコーティングするには、ペトリ皿の蓋を開けてフリップウェルをペトリ皿の縁から垂らします。インサートスタックの片側に慎重に200マイクロリットルのコラーゲン溶液を加えます。1時間後にコラーゲン溶液を吸引し、その後200マイクロリットルの無菌PBSをピペットで吸い込みます。PBSを吸引した後、ペトリ皿に蓋をして膜をキャビネット内で60分間乾燥させます。

膜が乾いたら、滅菌ピンセットやピンセットを使い、フリップウェルを反対側に反らせてペトリ皿の縁からぶら下げさせます。細菌用インサートを作るには、滅菌鉗子を2セットと24ウェルインサートをバイオセーフティキャビネット内に設置します。滅菌ピンセットでインサートを滅菌パックから持ち上げます。

2セット目のピンセットや鉗子で、インサートの底にある小さなプラスチックの足を折り取ります。24ウェルインサートは、無菌のFlipwell共培養インサートスタックのいずれか、または元の12ウェルインサートのいずれかに挿入してテストしてください。フリップウェルの種まきを始めるには、フリップウェルの頂端側の両側に上皮細胞系を500マイクロリットルずつ播種します。

組み立て物をペトリ皿の蓋で覆い、37度の温度で5%二酸化炭素を加えて一晩培養し、細胞が付着するまで待つ。ペトリ皿の蓋を開けて、Flipwellスタックの頂端側からDMEM媒体を吸引します。滅菌鉗子を使ってフリップウェルをフックで慎重に持ち上げ、180度回転させます。

2セット目の滅菌鉗子で、もう一方のフックを上に向けてフリップウェルスタックを掴みます。次に組み立て物をペトリ皿に戻し、フックをペトリ皿の縁にかけます。共培養インサートスタックの頂端側にTHP-1細胞懸濁液500マイクロリットルを加えます。

大腸上皮細胞用にHT-29培地を調整し、深い井戸の培養皿に培地を加えます。気泡を取り除くには、フリップウェルスタックを無菌鉗子で腕に持って固定してください。慎重にガベージュ針をインサートのアセンブリの下に下ろし、柔らかい先端を気泡の方に優しく当てます。

慎重に、そして非常にゆっくりとシリンジプランジャーを引き上げて、気泡がゆっくりと消えていくのを見守ってください。次に、フリップウェルから慎重に針と注射器を取り出します。ガベージ針で気泡を取り除いた後、細胞培養インキュベーターで両方の細胞を培養します。

鉗子を使ってインサートを無菌のペトリ皿に入れ、蓋をかぶせます。フリップウェル付きのペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに移し、反対側に細菌入りのインサートと一緒に置いてください。フリップウェルの頂端側からDMEM培地を300マイクロリットで抽出し、細菌の挿入物を入れてからペトリ皿の蓋をかぶせます。

次に、24ウェルの細菌挿入に50〜100マイクロリットルのバチルス・サブティリス培養液を加え、フリップウェルの上部に挿入します。アームを回転させて、Flipwellのコカルチャーインサートスタックの縁から吊るします。2セット目の滅菌鉗子でスタックを保持してください。

3時間の培養後、滅菌鉗子を使ってフリップウェルから細菌挿入物を取り出します。フリップウェルを分解せずに50ミリリットルの円錐形チューブ内に挿入します。電子顕微鏡でフリップウェルを分解するには、両手で持ち、接着されたスタックの各部分をねじって切り落とします。

インサートを膜と一緒に回転させ、膜を上に向けて置きます。インサートを持ち、メスの刃で膜を慎重に切り取り、パラフォームアルデヒド溶液を含む1.7ミリリットルのチューブに入れます。共焦点顕微鏡検査では、先端側に300マイクロリットルの無菌PBSを追加してください。

PBSをピペットで取り出した後、慎重にペトリ皿からスタックを取り出してください。次にFlipwellを裏返し、Flipwell共培養インサートスタックの上向きのRPMI側に300マイクロリットルのPBSを加え、リン酸塩緩衝生食塩水を吸引します。200マイクロリットルのピペットを使い、大きなPBS液滴を作ります。

インサートアセンブリをねじって外してインサートに分離させます。次に、THP-1セルを搭載したフリップウェルスタックを200マイクロリットルのPBS滴の上に慎重に配置します。大腸上皮細胞とともに200マイクロリットルの透過性緩衝液を表面に加え、10分間放置します。

免疫蛍光染色のために、挿入物の上部に300マイクロリットルの一次抗体をピペットで投与します。12ウェルプレートのウェルに一次抗体300マイクロリットルを加え、インサートをウェル内の滴の上に置きます。抗体をしっかり覆いましょう。

染色検査では、セピアプテリン処理後の腸上皮区画における粘液分泌が劇的に増加し、上皮マーカータンパク質CK20および粘膜タンパク質MUC2の増加が示されました。THP-1単一培養では、セピアプテリン処理によりM1マクロファージマーカーCD80の発現が有意に増加し、M2マクロファージマーカーCD163がダウンモグルでM1分極を示しました。走査型電子顕微鏡により、セプセル処理共培養における上皮細胞からの粘液分泌の増加が明らかになりました。

セピアプテリン処理により、単一培養および共培養の両方でM1表現型に似たマクロファージ形態が誘導されます。セピアプテリン処理単一培養中の細菌細胞は、バイオフィルム形成に特徴的なしわのある表面を示しました。