簡単な2Dおよび3D細胞培養を可能にするように設計された革新的な3Dプリントインサート
2023年1月6日
この論文では、新しく設計された3Dプリントインサートを共培養のモデルとして提示し、内皮細胞とケラチノサイト間のパラクリン細胞間コミュニケーションの研究を通じて検証します。
このプロトコルは、多数の培養研究を調査し、直接細胞コミュニケーションを調査するための新しいツールを提供するために使用できます。この新しいデバイスは、培養モデルの確立にかかる時間を大幅に節約し、特定のコーティングを必要とするかどうかにかかわらず、さまざまな細胞タイプに適用できます。実際、3Dプリントされたインサートの4つのコンパートメントにより、異なる細胞タイプを単層で、または異なる組み合わせで同じ方法で3Dで培養することができます。
3Dプリントされたインサートは、より耐久性、柔軟性、拡張性があり、免疫学やアンドロジェネシスなどの生理病理学の研究のための実験モデルの設計に使用できます。まず、製造元の指示に従って、10%エタノール滅菌スパチュラを使用して、キットに付属の70つの成分、食品シリコン、および触媒を70:70の比率で混合します。ピンセットでシリコーンミックスにインサートを適用し、混合物がインサートの下端に均一に分布するようにします。
インサートを6ウェルプレートのウェルに入れ、細胞培養培地の漏れを防ぐために、インサートがプレートに密着するように穏やかな圧力をかけます。プレートを摂氏37度にして、シリコンの凝固プロセスを1時間サポートします。固化後、プレートを70%エタノール浴に30分から1時間浸して、インサートで滅菌します。
次に、ピペッティングによってアルコールを捨て、細胞培養フードでプレートを一晩乾燥させます。外根鞘のケラチノサイトおよびヒト皮膚微小血管内皮細胞を培養するには、フラスコから培地を捨て、5ミリリットルのトリプシンを加えて細胞を剥離する。外根鞘のケラチノサイトを入れたフラスコを摂氏37度で5%二酸化炭素で5分間置き、ヒト皮膚微小血管内皮細胞を入れたフラスコを室温で5分間インキュベートします。
15ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内で、外根鞘のケラチノサイトを含むトリプシン溶液を、5%FBSおよび成長因子を添加した5ミリリットルの間葉系幹細胞培地と混合し、ヒト皮膚微小血管内皮細胞を5%FBSおよび成長因子を添加した5ミリリットルの内皮細胞培地と混合する。外根鞘のケラチノサイトおよびヒト皮膚微小血管内皮細胞懸濁液を200Gで室温で5分間遠心分離する。上清を捨てた後、細胞をそれぞれの培地の2ミリリットルに再懸濁します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルー色素と混合し、10マイクロリットルの混合物を計数スライドのチャンバーに加える。カウントスライドをセルカウントシステムに挿入し、細胞数と生存率を検出します。それぞれの培地中に1ミリリットル当たり50, 000細胞の濃度で細胞懸濁液を調製した後、800マイクロリットル〜1ミリリットルの細胞懸濁液を個々の大きな区画に、そして100〜150マイクロリットルをピペットで個々の小さな区画に分配する。
5%FBSと成長因子を添加した間葉系幹細胞培地中のケラチノサイトと、内皮細胞培地中のヒト皮膚微小血管内皮細胞、5%FBSおよび成長因子を添加した小コンパートメントおよびその他の大きなコンパートメントを参照してください。細胞培養プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度で、または通常の条件下で置き、細胞の接着および/または成熟を可能にします。ピペットを使用して、インサートの異なるコンパートメントの培地を空にします。
次に、大きなコンパートメントで摂氏37度の温かいPBSを1ミリリットル、小さなコンパートメントで200マイクロリットルの細胞をすすぎます。すべての細胞タイプに適合するように選択された3ミリリットルの共通培地を追加します。共培養を含むプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で24〜48時間置きます。
細胞懸濁計数のためにトリプシンを使用して細胞を剥離し、トリパンブルー染色を使用して生存率を確認します。形態を観察した後、インキュベーションの24〜48時間後に光学顕微鏡下で実験中に異なる区画の細胞数をカウントする。まず、実験の最後に6ウェルプレートからインサートを少しひねって取り外し、次にシリコンをインサートから引き抜いて取り外します。
従来の細胞培養用洗剤と洗浄剤でインサートを洗浄します。次に、オートクレーブで将来使用するために、または70%エタノール浴に1時間浸して、インサートを滅菌します。表現型と細胞生存率を比較し、6つのウェルプレートのウェルで90%の生存率が観察され、外根鞘のケラチノサイトの3Dプリントインサートで91%が観察されました。
ヒト皮膚微小血管内皮細胞の生存率は、6ウェルプレートのウェルで85%であったのに対し、3Dプリントインサートでは86%でした。3Dプリントされたインサート内のケラチノサイトと内皮細胞間の間接的な細胞コミュニケーションは、インサートにケラチノサイトが存在する場合、ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖が対照と比較して24時間後に1.5倍、48時間後に3.1倍に有意に増加したことを示しました。しかし、外根鞘条件培地のケラチノサイトは、ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖を24時間後に1.5倍、48時間後に2.1倍に有意に増加させることが示された。
3Dプリントされたインサート共培養モデルを試験して、ヒト皮膚微小血管内皮細胞遊走に対するケラチノサイトの影響を決定した。対照条件では、内皮細胞が遊走し、24時間後に創傷領域の約44%を覆った。ケラチノサイトの存在下では、ヒト皮膚微小血管内皮細胞遊走の有意な増加が観察され、これは創傷領域の43%67%および99%がそれぞれ3時間、12時間および24時間後に覆われたことを示している。
同様に、HDMECsの移動は、外根鞘条件培地のケラチノサイトの存在下で増加する。ある区画から別の区画への細胞の培地の漏れを防ぐために、プレートへのインサートのシールを確実にすることが重要です。増殖、遊走、鎮静形成アッセイDNA、RNA、タンパク質、その他の分析など、いくつかのアプリケーションを行うことができます。
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概要
この研究では、内皮細胞とケラチノサイトの間の傍分泌細胞間コミュニケーションに焦点を当て、共培養システムを調査するための新しい3Dプリントインサートモデルを提示します。このインサートは様々な細胞タイプの研究モデル設計を強化し、ケラチノサイトと共培養した場合に内皮細胞の増殖と移動に顕著な増加を示します。
主要な研究構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- 内皮細胞とケラチノサイトの相互作用
- 3D培養モデル
背景
- 生物学的システムにおける直接的な細胞コミュニケーションの重要性。
- 異なる細胞タイプの培養モデルの確立における課題。
- スケーラブルで柔軟な細胞培養技術の必要性。
使用された方法
- 細胞培養のための3Dプリントインサートの使用。
- ケラチノサイトとヒト真皮微小血管内皮細胞の共培養。
- 移動および増殖アッセイを通じた細胞活性とコミュニケーション効果の分析。
主な結果
- ケラチノサイトは24時間後に1.5倍、48時間後に3.1倍内皮細胞の増殖を大幅に促進しました。
- ケラチノサイトの存在下で内皮細胞の移動は顕著に改善され、24時間で傷の面積の最大99%をカバーしました。
- 3Dプリントインサートでは従来の培養方法と比較して高い細胞活性が観察されました。
結論
- この研究は、直接的な細胞相互作用と培養を促進する3Dプリントインサートの有効性を示しています。
- この発見は細胞コミュニケーションの理解に影響を与え、様々な生理病理学の研究に役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient modeling of direct and indirect cell communication is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. The 3D-printed insert system enables multiplexed co-culture of up to four cell types in both 2D and 3D formats, supporting physiologically relevant assays and accelerating hypothesis-driven research. This flexible platform enhances predictive confidence and streamlines the transition from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of paracrine and direct cell-cell interactions in a controlled, multi-compartment format.
- Supports functional target validation by allowing simultaneous analysis of multiple cell types and conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling physiopathological communication pathways.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated co-culture systems for quantitative proliferation and migration assays.
- Standardizes assay conditions across compartments, enhancing reproducibility and scalability.
- Enables parallel testing of reagents or conditions for robust compound evaluation.
- Supports platform reuse for diverse cell types and assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant intercellular communication for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling physiologically relevant co-culture conditions.
- Reduces risk of late-stage biological failure by providing more predictive in vitro data.
Pipeline & Workflow Integration
The 3D-printed insert system bridges early discovery, screening, and translational research by enabling multiplexed, physiologically relevant co-culture assays within standard plate formats.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cell-cell communication and pathway modulation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for proliferation and migration endpoints.
- Analytics: Facilitates independent collection and analysis of RNA, protein, and viability data from each compartment.
- Translational Research: Models disease-relevant interactions for biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Provides a durable, sterilizable platform adaptable to various cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell communication studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and co-culture assay design.
- Needs access to standard cell culture instrumentation and analytical tools for viability and molecular analysis.
- Demands rigorous sealing and sterilization protocols to prevent cross-contamination between compartments.
- Adaptable to a range of adherent cell types and compatible with both 2D and 3D culture formats.
- Practical limitations include careful handling to maintain compartment integrity and prevent medium leakage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Placement of the Sterilized Insert in the 6‐Well Plates
1:59
Seeding of the Cells
4:21
Implementation of the Co‐Culture, Cell Observation, Counting, and Scraping
5:12
Insert Cleaning for Recycling
5:41
Results: Paracrine Intercellular Communication Between Endothelial Cells and Keratinocytes
7:38
Conclusion
