マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

この手順の全体的な目標は、マウスの鋤鼻器官からの急性組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の単一細胞電気生理学的分析を実行することです。この方法は、化学感覚の分野における重要な問題、例えば、シーノーケミカル検出のメカニズムを解明するのに役立ちます。この手法の主な利点は、急性組織切片の感覚ニューロンから記録することにより、これらの細胞を本来の環境で調査できることです。

この手順を開始するには、動物を犠牲にした後、口腔全体に大きな外科用ハサミを挿入して下顎を取り除き、両側の下顎骨と筋肉を別々に切断します。次に、上顎の皮膚と鼻の先端の周りを中型の鉗子で取り除き、切歯へのアクセスを改善します。次に、骨はさみを使用して、吻側方向に45度の角度で切歯の大部分を切り取り、鼻腔からのVNOカプセルの除去を容易にします。

VNOカプセルの先端の損傷を防ぐために、歯の根元を切らないでください。その後、硬い上口蓋の吻側部分を中鉗子でつかみ、平らな角度で慎重に一枚ずつ剥がします。海軍の空洞を氷冷溶液S2で繰り返しすすぎます。次に、マイクロスプリングハサミを使用して、鋤骨の先端と顎の間の骨滲出液をカットします。

はさみの先端は、湾曲した部分がVNOから離れるようにして挿入します。そして、VNOカプセルの外側、左側と右側の両方で骨を細かく刻んで慎重に切断します。VNOカプセルを取り外すには、尾側部分で鋤骨を切断し、中鉗子を使用して鼻腔から鋤骨を慎重に持ち上げます。

直ちにVNOをアイスゲルパック上の実体顕微鏡下の小さなペトリ皿に移し、そこで解剖の残りのステップを実行するべきである。次に、組織が乾燥するのを防ぐために、少量の氷冷したS2でVNOをすすぎます。次に、中程度の鉗子で鋤骨の後ろをつかむことにより、VNO軟部組織を含む軟骨カプセルを分離します。

そのためには、カプセルを背側から見えるように配置し、両方のVNO間の分割が見えるようにします。細い鉗子の先端を使用して、両方の軟骨VNOカプセルを中央の骨から分離し、鋤骨を後部に固定したままにします。以前に鋤骨に付着していた内側軟骨壁が取り除かれていることを確認してください。

VNOの周りの軟骨を切除するときは、軟骨嚢の縁にのみ鉗子を使用してください。そして、繊細な感覚上皮を傷つけないように十分注意してください。残っている軟骨を取り除くには、側面が湾曲したVNOを皿の底に向け、鉗子を使用して片側の軟骨をしっかりと固定します。

次に、2番目の細い鉗子を裏側から軟骨とVNOの間の非常に平らな角度で慎重に動かし、組織と軟骨の間の接続を緩めます。感覚上皮の損傷を避けるために、VNOを尾側の先端に保持して、VNOを軟骨からゆっくりと剥がします。VNOがカプセルから出されたら、残りの軟骨部分がスライスプロセス中に周囲のアガロースから組織を剥離するため、残りの小さな軟骨部分をすべて取り外します。

次に、最初に解剖したVNOに氷のように冷たいS2を少量垂らして、組織の損傷を防ぎます。VNOを埋め込むには、両方の小さなシャーレを溶かしたS3を縁まで満たします。その後、各VNOをアガロースに浸し、水平に数回前後に動かして、細胞外溶液のフィルムとその表面から気泡を取り除きます。吻側が皿の底を向くように、VNOを垂直に配置します。

その後、両方の皿をゲルアイスパックに置き、アガロースが固まるまで待ちます。アガロースが固化し始めたら、周囲のアガロースから組織が剥離するため、VNOの向きを変更しないでください。この手順では、小さなヘラを使用して、小さな皿からアガロースブロックを大きなシャーレの蓋に移し、アガロースを逆さまにして、VNOの吻側先端を上に向けたままにします。

次に、外科用メスを使ってブロックをピラミッド型に切り取り、埋め込まれた組織を傷つけないように注意します。次に、瞬間接着剤を使用して、ピラミッド型のブロックをビブラトーム試料プレートの中心に固定します。そして、接着剤が完全に乾くまで約1分待ちます。

試料を150〜200マイクロメートルの厚さのセクションにスライスします。解剖顕微鏡でスライスの形態を簡単に検査します。次に、使用するまですべてのスライスを酸素化チャンバーに移します。

このステップでは、VNOスライスをイメージングチャンバーに移し、ポイント1ミリメートルの厚さの合成繊維で配線されたステンレス鋼アンカーを使用してスライス位置を固定します。ティッシュスライスを合成繊維の糸で覆わないでください。次に、イメージングチャンバーを記録セットアップに移し、スライスを酸素化S2と室温で連続的にスーパーフュージョンします。

吸引毛細管を溶液の表面に調整して、浴液の絶え間ない交換を作成します。次に、8 in one multi barrel profusion pencilを、血管を含むVNOスライスの非感覚部分の上と近くに調整します。その後、150ミリモルの塩化カリウムで満たされたL字型の寒天ブリッジを使用して、参照電極と浴溶液を接続します。

続いて、パッチピペットにピペット溶液S4を充填します。ヘッドステージに接続された塩化銀コーティング電極にコーティングを剥がさずにピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。次に、お風呂に入る前にパッチピペットにわずかな陽圧を加えます。ピペットを監視し、ピペットが4メガオームから10メガオームの間にあることを確認します。

赤外線最適化DICを使用してCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、蛍光照明と適切なフィルターキューブを使用して、FPR-rs3 i-Venus発現細胞または同様に標識されたニューロンを同定します。ハンドホイールを使用して細胞体に近づき、感度を最大限に高めます。正圧により、ピペットの先端が近づくと、細胞体膜の小さなへこみが見えるようになります。

次に、正圧を解放し、わずかな負圧を加えて細胞膜を吸い込み、1〜20ギガオームの高抵抗シールを獲得します。その後、短く穏やかな吸引を適用して細胞膜を破壊し、細胞全体の構成を確立します。この図では、冠状VNO組織切片の共焦点像が、鋤鼻感覚上皮における蛍光FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンの分布を示しています。

FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンは、管腔境界でノブのような構造で終わる単一の頂端樹状突起を示します。そして、ここに示されているのは、VSN体細胞から行われた全細胞パッチクランプの記録です。以下は、TTX感度高速活性化ナトリウム電流、およびFPR-rs3正のVSNのホールセールパッチクランプ記録からの代表的なトレースです。

制御条件下での電圧ステップ記録では、電圧依存の高速および過渡的な内向き電流が明らかになります。1マイクロモルでのTTX処理により、電流が大幅に減少します。また、ここに示されているデジタル減算されたトレースは、TTXに敏感な電圧依存性ナトリウム電流を示しています。

代表的な電流クランプトレースは、脱分極と過分極、および段階的な正と負の電流注入時に生成される活動電位の列を示しています。一度習得すれば、両方のVNOで全解剖と組織スライスのプロセスを約1時間で完了することができます。この手順に続いて、細胞外ルースパッチ記録やカルシウムイメージングなどの他の方法を実行して、ニューロンのより大きな集団を解析する際のスループットを向上させることができます。

このビデオを見れば、口腔鋤鼻器官から急性組織切片を作成する方法や、鋤鼻感覚ニューロンからシングルセル電気生理学的記録を行う方法についてよく理解できるはずです。