マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

本手順の全体的な目的は、マウスの鋤鼻器（きびき）から作製した急性組織切片において、特定の感覚ニューロン集団の単一細胞電気生理学的解析を行うことです。この手法は、化学物質検出のメカニズムなど、化学受容分野における重要な課題の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、急性組織切片内の感覚ニューロンから記録を行うことで、これらの細胞を本来の環境下で調査できる点にあります。

この手順を開始するには、動物を犠牲にした後、大きな外科用ハサミを口腔内に挿入して下顎を取り出します。その際、両側の下顎骨と筋肉を個別に切断してください。次に、切歯にアクセスしやすくするため、中型ピンセットを用いて上顎と鼻先周囲の皮膚を除去します。その後、骨剪刀を使用して、切歯の大部分を吻側に向かって45度の角度で切断し、鼻腔からVNOカプセルを取り出しやすくします。

VNOカプセルの先端への損傷を防ぐため、歯根を切断しないでください。その後、中型鉗子で硬口蓋の吻側部を掴み、平坦な角度で慎重に一気に剥離します。鼻腔を氷冷した溶液S2で繰り返し洗浄します。次に、マイクロスプリングシザーを使用して、鋤骨の先端と顎の間の骨流出部を切断します。

ハサミの先端を、曲面がVNOとは反対側を向くように挿入します。そして、VNOカプセルの外側で、左右両方の骨を慎重に少しずつ切断します。VNOカプセルを取り出すには、鋤骨（じこつ）の後端を切断し、中型鉗子を用いて鋤骨を鼻腔から慎重に持ち上げます。

直ちにVNOを、氷冷ジェルパック上の実体顕微鏡下にある小型シャーレに移し、以降の解剖手順を行います。次に、組織の乾燥を防ぐため、少量の氷冷S2でVNOを洗浄します。その後、中鉗子で鋤骨の後方を把持し、VNOの軟組織を包む軟骨莢を分離します。

そのために、両側のVNOの間の裂け目が見えるように、カプセルを背面から見える位置に配置します。微細鑷子の先端を使用して、後方の篩骨をピンで固定したまま、両側の軟骨VNOカプセルを中心骨から分離させます。以前に篩骨に付着していた内側の軟骨壁が除去されていることを確認してください。

VNO周囲の軟骨を除去する際は、軟骨被膜の縁のみを鉗子で把持してください。また、繊細な感覚上皮を損傷しないよう十分注意してください。残りの軟骨を除去するには、VNOを反転させて側面の湾曲した部分をディッシュの底に向け、片側の軟骨を鉗子でしっかりと固定してください。

次に、組織と軟骨の間の接続を緩めるため、2本目の精密ピンセットを軟骨とVNOの間に非常に浅い角度で背面から慎重に挿入します。感覚上皮を損傷させないよう、VNOの尾端を持って、軟骨からゆっくりと剥離させます。VNOがカプセルから切り離されたら、残っている小さな軟骨片をすべて取り除きます。軟骨片が残っていると、スライス工程中に組織が周囲のアガロースから剥離してしまうためです。

次に、組織の損傷を防ぐため、最初に解剖したVNOに氷冷したS2を少量滴下します。VNOを包埋させるために、2つの小型ペトリ皿の縁まで溶融したS3を満たします。その後、各VNOをアガロースに浸し、表面の細胞外液の膜や気泡を取り除くため、水平方向に数回往復させます。VNOを垂直に配置し、吻側端が皿の底を向くようにします。

続いて、両方のディッシュをゲルアイスパックの上に置き、アガロースが凝固するまで待ちます。アガロースの凝固が始まった後は、VNOの向きを変えないでください。向きを変えると、組織が周囲のアガロースから剥離してしまいます。この手順では、小さなスパチュラを使用して、小型ディッシュからアガロースブロックを大型ペトリ皿の蓋に移し、アガロースを上下反転させて、VNOの吻側端が上を向くようにします。

次に、外科用メスを用いてブロックをピラミッド状に切り出します。この際、包埋された組織を損傷させないよう注意してください。その後、瞬間接着剤を使用して、ピラミッド状のブロックをビブラトーム試料プレートの中心に固定します。接着剤が完全に乾くまで、約1分間待ちます。

試料を150から200 µmの厚さにスライスします。実体顕微鏡下でスライスの形態を簡潔に確認してください。その後、使用するまですべてのスライスを酸素供給チャンバーに移します。

このステップでは、VNOスライスをイメージングチャンバーに転送し、厚さ0.1 mmの合成繊維で固定したステンレス製アンカーを用いてスライスの位置を固定します。合成繊維で組織スライスを覆わないようにしてください。次に、イメージングチャンバーを記録装置に移し、室温で酸素飽和S2液をスライスに連続灌流させます。

吸引キャピラリーを溶液の表面まで調整し、浴液が常に交換されるようにします。次に、8連マルチバレル灌流ペンシルを、血管を含むVNO切片の非感覚部位の直上かつ近接した位置に調整します。その後、150 millimolar 塩化カリウムを満たしたL字型アガルスブリッジを用いて、参照電極と浴液を接続します。

続いて、パッチピペットにピペット溶液S4を満たします。コーティングを削り取らないように注意しながら、ヘッドステージに接続された塩化銀コーティング電極の上にピペットをセットし、しっかりと固定します。次に、バスに導入する前にパッチピペットにわずかな正圧をかけます。ピペットの抵抗値をモニタリングし、4 MΩから10 MΩの間にあることを確認してください。

赤外線最適化DICを用いて、CCDカメラでVNOスライスを可視化し、蛍光照明と適切なフィルターキューブを使用して、FPR-rs3 i-Venusを発現している細胞または同様に標識されたニューロンを特定します。感度を最大にするため、ハンドルを用いて細胞体に近づけます。正圧により、ピペット先端が近接すると細胞体膜に小さなへこみが現れます。

次に、正圧を解除し、わずかな負圧をかけて細胞膜を吸い込み、1〜20gΩの高抵抗シールを形成します。その後、短く緩やかな吸引を行い、細胞膜を破壊してホールセル構成を確立します。この図では、冠状のVNO組織切片の共焦点画像により、鋤鼻感覚上皮における蛍光FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンの分布が示されています。

FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンは、管腔側の境界にノブ状の構造で終わる単一の頂端樹状突起を有しています。そして、ここにVSN細胞体から行われたホールセルパッチクランプ記録を示します。ここでは、FPR-rs3陽性VSNにおけるTTX感受性高速活性化ナトリウム電流のホールセルパッチクランプ記録の代表的なトレースを示しています。

対照条件下での電圧ステップ記録により、電位依存的な速い一過性の内向き電流が認められます。1 µMのTTX処理により、この電流は著しく減少します。ここに示すデジタル減算波形は、TTX感受性の電位依存性ナトリウム電流を示しています。

代表的なカレントクランプ記録波形は、段階的な正および負の電流注入によって誘発された脱分極、過分極、および一連の活動電位を示しています。習熟すれば、両側のVNOにおける摘出および組織切片作成の全工程を約1時間で完了させることができます。本手順の後、より大規模なニューロン集団を解析してスループットを向上させるために、細胞外ルースパッチ記録やカルシウムイメージングなどの他の手法を実施することが可能です。

このビデオを視聴することで、口側鋤鼻器官から急性組織切片を作製する方法、および鋤鼻感覚ニューロンから単一細胞電気生理学的記録を行う方法について十分に理解することができます。