Name: マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶマウス鋤鼻器官の急性組織スライスを用いた感覚ニューロンの電気生理学的解析法。パッチクランプ記録で化学感覚メカニズムを解明し、神経科学と生理学の研究に貢献します。

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私たちは、FPR-rs3-i-venusマウスラインを生成し、彼らの建設的な批評と実りある議論を行ったIvan Rodriguez氏とBenoit von der Weid氏に感謝します。この研究は、フォルクスワーゲン財団(I/83533)、ドイツ研究振興協会(SP724/6-1)、およびドイツ連邦政府と州政府のエクセレンス・イニシアチブの助成金によって資金提供されました。MSは、フォルクスワーゲン財団のリヒテンベルク教授です。

すべての動物の手順は、実験目的のために使用される動物の保護（指令609分の86 / EEC）とで勧告は欧州実験動物学協会連合会（FELASA）によって提唱上のローカルおよび欧州連合の法律を遵守していました。 C57BL / 6マウスとFPR-RS3-I-金星マウスの両方が食料や水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクル上で室温で両性のグループで飼育しました。実験のためのセックスのいずれかの若年成人（6-20週）を使用しました。明らかな性別依存の違いは認められませんでした。 1.溶液の調製<ol><li>細胞外溶液S1を調製する：のCaCl 2、1 145のNaCl、5 KClを、1 4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）は（mM単位）を含有する細胞外溶液を緩衝のMgCl 2、10 HEPES。 pH値= 7.3（NaOHで調整）。 （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。 </li><li> extracellu準備LAR溶液S 2：カルボゲン、酸素（95％O 2、5％CO 2）のCaCl 2、1のMgSO 4 125のNaCl、25（mM単位）のNaHCO 3、5のKCl、1を含有する細胞外溶液、5 BES。 pH値= 7.3; （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。 </li><li>組織の埋め込 ​​みのために4％の低ゲル化温度アガロース溶液（S 3）を準備します。4％の低ゲル化温度アガロース。一緒にマグネチックスターラーを備えた低ゲル化100mlのガラス実験用瓶にS 1 50mlにアガロースを2g溶解します。アガロースを溶融し、約20分間、または撹拌しながら溶液が透明になるまで70℃で（蓋密閉しないで）水浴中にボトルを置きます。クールダウンし、さらに使用するまで42℃で第2の水浴中で溶融したアガロースを保ちます。 </li><li>細胞内溶液S 4準備：（mM単位）143のKCl、2 KOH、1 EGTA、0.3のCaCl 2（= 110 nMの遊離Ca 2+）、10 HEPES、2をMgATP、1 NaGTPを含むピペット溶液を、pH値= 7.1（KOHで調整）。浸透圧= 290ミリオスモル。 </li><li>個々の実験計画（電位活性化電流の特定の種類を分離する例えば 、薬理学的遮断剤）に応じて変更/ S 1の組成物を調整し、S 2、S 4。 </li></ol> 2.ワークスペースの準備<ol><li>継続的に前に解剖、温度およびpH調整のために氷の上の場所や含酸素溶液に、S 2、少なくとも30分で貯蔵室酸素化スライスを埋めます。 </li><li> S 2とのセットアップを記録でスライス灌流のための貯蔵を記入し、継続的に酸素化。 </li><li>解剖の前に、S 2でビブラトーム室を充填し、チャンバの周囲に砕いた氷を手配。また、ビブラトーム室に室を酸素化からスペア氷冷酸素化ソリューションを転送し、継続的に酸素化おきます。 </li><li>手術器具や消耗品を配置します。 </li><li>解剖の下でアイスジェルパックを置きます顕微鏡は、皿の底に凍結からVNO組織を防止するために、紙タオルで覆っています。 </li><li>簡単に70％エタノールと蒸留水ですすぎとビブラトームするマウントしたクリーンかみそりの刃。すべてのスライスセッションのために交換してください。 </li></ol> 3. VNO解剖と埋め込み<ol><li> CO 2への短時間の曝露によって、動物を犠牲にし、鋭い手術用はさみを使って首を切ります。注：氷の上にVNOカプセルを置くことに、動物を犠牲にするから時間が重要であるように、2分未満までの時間を最小限に抑えます。組織の生存率を維持するために、30分未満でアガロースの両方で完全解剖VNOsを埋め込みます。 </li><li>大きな手術用ハサミで下顎を削除します。口腔を介して入力し、個別に各側の下顎の骨と筋肉をカット。 </li><li>大きなペトリ皿に逆さまヘッドの残りの部分を配置します。 </li><li>へのより良いアクセスを得るために培地鉗子で上顎のと鼻の先端の周りの皮膚を引き離します門歯。 </li><li>吻側方向（ 図1A）で〜45°の角度で切歯の大部分を切り取るために骨のはさみを使用してください。これは、鼻腔からVNOカプセルの除去を容易にします。 注：VNOカプセルの先端の損傷を防ぐために歯の根に切断しないでください。 </li><li>メディア鉗子でその吻側部で剛性上口蓋をつかみ、慎重に平らな角度（ 図1B）で一体に戻って皮をむきます。 注：繰り返しの氷冷S 2で洗い流してください。 </li><li>鋤骨の骨と顎の先端との間の骨の融合をカットするマイクロ春のはさみを使用してください。先端の湾曲部が外側に離れてVNOから指し示すとはさみのヒントを挿入し、慎重にVNOカプセルに横方向の左右両側に小さなステップで骨を切りました。 </li><li> VNOカプセルを削除するには、尾部に鋤骨の骨を切断するために、マイクロ春のはさみを使用して、慎重にn個のうち、鋤骨の骨を持ち上げますメディア鉗子を使用してASAL空洞。すぐに解剖の残りのステップが実行されるアイスジェルパックのステレオ顕微鏡下で小さなペトリ皿にVNOを転送します。 </li><li>乾燥から組織を防止するために、氷冷S 2少量のVNOをすすぎます。 </li><li>メディア鉗子で鋤骨の骨の後ろをつかむことにより、VNO軟組織が含まれている軟骨カプセルを分離します。位置VNOs両方の間の分割は（ 図1D i）を見えるように背ビュー用カプセル。 </li><li>後部に釘付け鋤骨の骨を維持しながら、中央の骨の両方から軟骨VNOカプセルを分離するために微細な鉗子の先端を使用してください。 注：唯一の軟骨カプセルの縁に鉗子を使用し、繊細な感覚上皮が損傷しやすいように、軟骨を貫通しないよう十分に注意してください。 </li><li> 2 VNOsが分離されたら、もみをカプセル化軟骨の除去を開始トンVNO。 </li><li> 1微細な鉗子でカプセルの上縁をつかみ、以前鋤骨の骨（内側）に取り付けた軟骨壁を離れて分割します。 </li><li>軟骨は、皿の底に、その湾曲した側面とVNOを回し、しっかりと鉗子を使用して1つの側に軟骨を突き止める残り削除します。慎重組織と軟骨との間の接続を緩めるために軟骨とVNOの間に非常に平坦な角度で背面側から第二の微細鉗子を移動します。 </li><li>ゆっくりと感覚上皮の損傷を避けるために、その尾の先端にそれを保持することによって離れて軟骨からVNOの皮をむきます。 </li><li> VNOがカプセルからレバレッジされると、スライス工程中にアガロース周囲から組織を切り離します軟骨の任意の残りの部分のように、残りのすべての小さな軟骨部分を削除してください。 </li><li>組織の損傷を防止するために、最初の解剖VNO氷のように冷たいS 2の小滴を置きます。側面ウィルに大きな血管lは器官が無傷のままであり、肉眼で解剖（ 図2A II）中に破損しなかったことを示す目に見えるようになります。血管が損傷してしまった場合、まだ限り、全体的な形態が明らかに損なわれていなかったとしてVNOをスライスして上に運ぶために価値があるだろう。 </li><li>すぐに第二VNOを分析。 </li><li> VNOsを埋め込 ​​むには、溶融したS 3とリムに小さなペトリ皿の両方を満たす（42℃の水浴中に保存され、1.3を参照してください）。 </li><li>感覚上皮への損傷を避けるために、微細なピ​​ンセットで広い尾の端にVNOを保持します。 </li><li>アガロースにVNOを浸し、細胞外液のフィルムだけでなく、その表面から任意の気泡を除去するために、前後に水平に数回移動します。 </li><li>皿の底に直面して、尾の先端に垂直にVNOを置きます。代わりに、直接鉗子でVNOをつまんで、近くproximi鉗子先端部を移動させることにより、向きを調整VNOにTY。 注：それは実験中の感覚ニューロンにスライス面とアクセシビリティを決定するように埋め込む時のオリエンテーションは非常に重要です。 </li><li>ゲルアイスパック上の皿を置き、アガロースが固化するまで待ちます。 注：アガロースは、これは、周囲のアガロースから組織を離脱するように固化開始した後VNOの向きを変更しないでください。 </li></ol> 4.冠状VNO組織スライス<ol><li>大きなペトリ皿のふたに小さな皿からアガロースブ​​ロックを削除するには、小さなへらを使用して、逆さまに上向きVNOの尾の先端を残してアガロースを反転。 </li><li>手術用メス（先端で3〜4ミリメートル、底部に8〜10ミリメートル）を使用して、角錐状にブロックをカット。埋め込まれた組織を傷つけないように注意してください。 </li><li>ビブラトーム試料プレートの中央にピラミッド型のブロックを固定し、接着剤が完全に乾燥するために〜1分を待つように瞬間接着剤を使用してください。 </li><li>スライスcに試料プレートを転送hamberそれに応じて、第二VNOを準備します。使用するまで4℃で第2の検体とプレートを保管してください。 </li><li>厚さ：：次の設定で振動ブレードミクロトームを使用して150〜200ミクロン。スピード：3.5 AU = 0.15ミリメートル/秒。周波数：7.5 AU = 75 Hzの。簡単に解剖顕微鏡下でスライス形態を検査した後に使用するまで酸素供給室にスライスを転送します。スライスは、いくつかの時間のために保持することができます。 </li></ol> 5.単一細胞電気生理学的記録<ol><li>記録のために、水浸対物レンズ、Dodtまたは赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）、およびエピ蛍光だけでなく、冷却CCDカメラを搭載した直立固定ステージ顕微鏡を使用しています。データ収集のために、パッチクランプアンプ、ヘッドステージ、AD / DAインターフェースボードと（記録ソフトウェアを含む）は、PCを使用しています。 </li><li> 10月20日パッチピペット（4-7MΩ）の株式を準備します。プルピペットホウケイ酸ガラスキャピラリーから（1.50ミリメートルOD / 0.86ミリメートルID）usinマイクロフォージとGAのマイクロピペットプラーと火ポリッシュ。 注：かなり小さいのVSNにパッチを適用する際の火災はピペットチップを研磨することは非常に重要です。これは、高抵抗シールを得るために、負圧を適用する際に、細胞膜を破裂防止するのに役立ちます。ピペット開口部を研磨した後、1μm程度であるべきです。 </li><li>使用するまで損傷や埃の蓄積を防止するために、ピペット保存瓶にピペットを保管してください。 </li><li>ソリューションの貯水池を充填し、実験計画に従ってチューブにより灌流システムを準備します。 注：彼らは強く電気生理学的記録を妨害するように完全にチューブから気泡を除去します。 </li><li> 〜3ミリリットル/分の流量を達成するための圧力を調整します。 注：高圧力が電気生理学的記録の組織切片の動きだけでなく、終了の原因となります。 </li><li>イメージング室にVNOスライスを移し、厚さ0.1mmのSYNTで配線ステンレス鋼のアンカーを使用して、スライス位置を修正hetic繊維（ 図2B - C）。 注：合成繊維糸のいずれかの組織切片ではなく、スライスを囲むアガロースをふさがないでください。 </li><li>バスアプリケーションを介して、室温で酸素S 2に設定し、継続的に表面かん流するスライスを記録への転送撮像チャンバ。 </li><li>浴溶液の一定の交換のためのゆっくりと吸引を作成するために、溶液の表面に吸着キャピラリーを調整します。 8イン1マルチバレル「灌流鉛筆」を調整して、上記と血管（ 図2C、3A）50 が含まれているVNOスライスの非感覚の部分に近接しています。反対方向からのスライスに直面する灌流鉛筆と記録ピペットを配置することが有益です。 </li><li> （150mMのKClで満たされている）L字型の寒天ブリッジを使用して参照電極と浴溶液を接続します。 </li><li>ピペット溶液S 4でパッチピペットを埋めます。 </li><li>コー​​ティングを掻き落とすことなく、ヘッドステージに接続された塩化銀でコーティングされたパッチ電極の上にピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。 </li><li>お風呂に入る前に、パッチピペットに若干の正圧（10ミリリットルのプラスチックシリンジに約1ミリリットル）を適用します。 </li><li> （ 図2D）、それを押すことなく目標を沈めることができるように十分マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを下ろします。 </li><li>ヘッドステージに接続された電気生理学ソフトウェアを使用して、（4-7MΩ間のR ピップ 、）ピペット抵抗を監視します。 注：R ピップがある場合は、&lt;4MΩガラスチップが壊れています。 R ピップは &gt; 10MΩの場合、先端が最も可能性の高い目詰まりやピペットの交換が必要です。 </li><li>赤外線最適化された微分干渉コントラスト（DIC）を使用したCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、FPR-RS3-I-金星は蛍光照明を用いて、細胞（または同様に標識ニューロン）を発現する識別そして、適切なフィルターキューブ。 </li><li>フォーカスや実験計画に応じて、蛍光または非蛍光細胞を標的とします。 </li><li>細胞体に近づくために、最大感度のためのハンドホイールを使用しています。ピペットチップが近接しているいったん正圧に起因して、細胞体膜の小さな凹みが見えるようになります。 </li><li>正圧を解放し、高抵抗シール（1月20日GΩ）を得るために、細胞膜を吸引するためのわずかな負圧を適用します。細胞膜を破壊し、全細胞構成を確立するために短く穏やかな吸引を適用します。 </li><li>実験中に常にアクセス抵抗を監視します。 注：のみ（R 入力の≤3％を、実験の過程にわたって変化&lt;20％）を小さく、安定したアクセス性を示すニューロン含む分析にを。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

VNOは、情報化学物質を検出する化学感覚構造です。今日まで、鋤鼻受容体の大多数は、ほんの数の受容体 - リガンド対が同定されているようにdeorphanizedされていません。このうち、V1rb2は、特にMHCペプチドSYFPEITHI 48とSEIDLILGY 58によって活性化されることが、男性特有のフェロモンESP1 57と同様にV2r1bとV2rf2によって活性化されることが、男性の尿フェロモン2-ヘプタノン30、V2rp5によって活性化されることが説明されましたそれぞれ。受容体 - リガンドの関係やシグナル伝達を理解するための前提条件は、ネイティブ環境で定義されたVSN集団の生物物理学的特性の知識です。パッシブとアクティブな膜特性、電位依存性イオンコンダクタンスと活動電位放電パターンは、受容体の神経細胞が刺激を化学感覚に応答する手段と範囲を定義します。電気生理学的急性組織スライスでの録音や、特に、人ル細胞パッチクランプ記録は、非常に詳細でこれらの特性を分析するための優れた方法を提供します。 <p class="jove_conte...

ほとんどの動物は、それらの周囲と対話するために、それらの化学的感覚に大きく依存しています。嗅覚は、適切な交配パートナーを見つけ、食品を評価する、捕食者を回避し、配置するための重要な役割を果たしています。主嗅上皮1,2、Grueneberg神経節3,4、マゼーラ5,6の中隔臓器と鋤鼻器官：ほとんどの哺乳動物では、嗅覚系は、少なくとも4つの解剖学的および機能的に異なる周辺のサブシステムから構成されています。 VNOは、ID、性別、社会的地位や性的な状態7-10についての情報を伝える化学手がかりを検出するのに重要な役割を果たしているアクセサリーの嗅覚システム（AOS）、の末梢感覚構造を含みます。 VNOは、右口蓋上記の鼻中隔の基部に位置しています。マウスでは、軟骨カプセル11-13で囲まれた二国間の盲終わる管です。臓器は、三日月形の内側の感覚epitheの両方で構成されVSNをを保有し、側面上の非感覚一部のlium。両方の上皮との間の狭い鋤鼻ダクト14を介して鼻腔に接続された粘液で満たされた内腔に位置しています。非感覚組織の大きな横方向の血管は負圧15,16を介してVNO腔にそのようなペプチドまたは小型タンパク質のような比較的大きい、主に非揮発性の分子の進入を容易にするために、血管ポンピング機構を提供します。 VNOの構造部品は、出生時に存在し、臓器は、まもなく思春期17の前に大人のサイズに達します。しかし、齧歯類のAOSはすでに少年で機能しているかどうか18-20を議論することが課題です。 VSNを、それらの上皮場所とそれらが発現する受容体のタイプの両方によって区別されます。 VSNをは無髄軸索内腔に向かって突出しており、微絨毛の樹状ノブで終わる単一の先端樹状突起を持つバイポーラ形態を示します。 VSNの斧アドオン束生の、背尾側端での軟骨カプセルを残す中隔に沿って上昇し、副嗅球（AOB）21,22に篩板やプロジェクトを渡し鋤鼻神経を形成します。鋤鼻感覚上皮は2層で構成されています：頂端層が腔側に近い位置に配置し、V1R-とFPR-RS-発現ニューロンの1タイプではなく、すべての両方を保有されています。これらのニューロンは、AOB 23-25 ​​の前部にGタンパク質αサブユニットGのαi2とプロジェクトを共発現します。感覚ニューロンは、GαOと一緒に、より基底層特急V2RsまたはFPR-RS1に位置し、AOB 26-28の後部領域への軸索を送ります。 鋤鼻ニューロンはおそらく、尿、唾液などの各種体液中に分泌し、涙液されているという小さな情報化学物質29-33（V1Rs）またはタンパク質化合物34-38（V2Rs）によって活性化される37,39-41 </sup&gt; その場での実験でのVSNもホルミル化ペプチドおよび種々の抗菌剤/炎症結合化合物25,42によって活性化されることが示されています。また、異種FPR-RSタンパク質が（参照43を参照）同種または腐った食物源25で病気のための検出器としての潜在的な役割を示し、免疫系において発現のFPRでアゴニストスペクトルを共有して表明しました。 特定のVSN集団における受容体 - リガンドの関係および下流のシグナル伝達カスケードを理解するための基本的には、ネイティブ環境での基本的な生物物理学的特性の詳細な評価です。過去には、細胞内シグナル伝達の解析が大幅に蛍光マーカータンパク質30,44-49を共発現することによってニューロンの定義された人口をマークする遺伝子改変動物の恩恵を受けています。このプロトコルでは、蛍光マーカー（FPR-RS3-I-ビーナス）と共にFPR-RS3を発現するトランスジェニックマウス系統が使用されます。このアプローチは、急性冠状VNOの組織切片内の単一ニューロンのパッチクランプ記録を用いて光学的に識別可能な細胞集団の電気生理学的分析を行うために、そのような遺伝的に改変されたマウス系統を使用する方法を例示します。感覚刺激と薬理学的薬剤のための空気圧駆動式マルチバレル灌流システムは、録音時に、迅速な可逆焦点神経刺激または阻害することができます。スライス標本における全細胞記録は固有の特性、電圧活性化コンダクタンス、ならびに細胞のネイティブな環境での活動電位放電パターンの詳細な分析を可能にします。

<table><tbody><tr><td><ストロング>ケミカルズ</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース(低ゲル化温度)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP(Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸(EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>手術器具および消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大きなペトリ皿、90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>の斬首、VNOカプセルの解剖</td></tr>小さな<tr><td>ペトリ皿、VNO解剖用の35 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>蓋、アガロースに埋め込むための皿</td></tr><tr><td>シャープな大型外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツールの</td><td></td><td>斬首、下顎の除去</td></tr><tr><td>強力な骨ハサミ</td><td>ファインサイエンスツールの</td><td></td><td>切断切歯</td></tr><tr><td>中鉗子、デュモンピンセット #2</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td>皮膚と口蓋の除去</td></tr><tr><td>マイクロスプリングハサミ、8.5 cm、湾曲、7 mmブレード&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td>ズが<td>VNOを切り取る&nbsp;</td></tr><tr><td>2組の細かい鉗子、デュモンピンセット#5</td><td>軟骨カプセルからVNOを解剖する</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td></tr><tr><td>小さなステンレス鋼のへら</td><td>アガロースブロックと組織スライスを扱う</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td></tr><tr><td>アガロースブロックをピラミッド型に切断</td>する<td>外科用メス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</strong<></td><td>strong>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.50 mm / 内径0.86 mm)</td><td>サイエンス製品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ、励起:BP 450-490、抑制:LP 515</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ランプ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレートマグネチックスターラー</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td><td>成重</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター装置&nbsp;</td><td>ルイグス &ノイマン</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー 縦型2段</td><td>成重</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスコープ</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>ノイズエリミネーター 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>灌流システム 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter five easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Storage jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber&nbsp;</td><td>ルイグス &ノイマン</td><td>スライスミニチャンバー</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>ウィルキンソンソードGmbH</td><td>ウィルキンソンソードクラシック</td><td></td></tr><tr><td>酸素化スライス貯蔵チャンバー; 代替の商業チャンバーは、例えば、BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) またはプレチャンバー (BSC-PC;ワーナーインスツルメンツ)</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の実体顕微鏡</td>ライ<td>カマイクロシステム</td><td>ズS4E</td><td></td></tr><tr><td>トリガーインターフェース&nbsp;</td><td>HEKA エレクトロニック</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス&nbsp;</td><td>メマート</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

ほとんどの哺乳類では、鋤鼻器官（VNO）は異種および同種の社会的手がかりを検出する化学感覚構造です。鋤鼻感覚ニューロン(VSN)は、少なくとも3つの異なる化学受容器遺伝子ファミリーから特定のタイプのGタンパク質共役受容体(GPCR)を発現し、化学感覚の手がかりを高感度かつ特異的に検出することができます。これらのファミリーは、V1rおよびV2r遺伝子ファミリー、ならびに推定化学受容体遺伝子のホルミルペプチド受容体(FPR)関連配列(Fpr-rs)ファミリーを含む。鋤鼻受容体-リガンド相互作用と下流シグナル伝達の生理機能を理解するためには、VSNの各特定のクラスに固有の生物物理学的特性を特定することが不可欠です。
ここで説明する生理学的アプローチは、トランスジェニックマウス系統（Fpr-rs3-i-Venus）を使用して、定義された感覚ニューロン集団の同定と詳細な分析を可能にします。しかしながら、このプロトコルの使用は、この特定の系統に限定されず、したがって、他の遺伝子組み換え系統または野生型動物に容易に拡張することができる。

定義された細胞集団の生物物理学的および生理学的特性への洞察を得るために、我々は、マウスVNO（ - 2 図1）の急性冠状組織切片を行います。切開後、切片は、いくつかの時間氷冷酸素化細胞外溶液（S 2）に保つことができます。記録のセットアップでは、新鮮な酸素化溶液（ 図2D）との一定の交換は、実験を通して、組織の生存率を保証します。ここでは、トランスジェニックマウスモデル（FPR-RS3-I-金星）を採用します。この株の共発現でのVSN FPR-RS3と蛍光マーカータンパク質、感覚ニューロンの定義された人口の光学的識別を可能にするFPR-RS遺伝子ファミリーの原型メンバー（ 図3）。電気生理学的記録は、単一細胞レベルでの詳細な分析のための手段を提供します。例えば、電位依存性電流の分析は、電圧クランプで行われますモード（ 図4A - B）。</stron...

ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

本手順の全体的な目的は、マウスの鋤鼻器（きびき）から作製した急性組織切片において、特定の感覚ニューロン集団の単一細胞電気生理学的解析を行うことです。この手法は、化学物質検出のメカニズムなど、化学受容分野における重要な課題の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、急性組織切片内の感覚ニューロンから記録を行うことで、これらの細胞を本来の環境下で調査できる点にあります。この手順を開始するには、動物を犠牲にした後、大きな外科用ハサミを口腔内に挿入して下顎を取り出します。その際、両側の下顎骨と筋肉を個別に切断してください。次に、切歯にアクセスしやすくするため、中型ピンセットを用いて上顎と鼻先周囲の皮膚を除去します。その後、骨剪刀を使用して、切歯の大部分を吻側に向かって45度の角度で切断し、鼻腔からVNOカプセルを取り出しやすくします。VNOカプセルの先端への損傷を防ぐため、歯根を切断しないでください。その後、中型鉗子で硬口蓋の吻側部を掴み、平坦な角度で慎重に一気に剥離します。鼻腔を氷冷した溶液S2で繰り返し洗浄します。次に、マイクロスプリングシザーを使用して、鋤骨の先端と顎の間の骨流出部を切断します。ハサミの先端を、曲面がVNOとは反対側を向くように挿入します。そして、VNOカプセルの外側で、左右両方の骨を慎重に少しずつ切断します。VNOカプセルを取り出すには、鋤骨（じこつ）の後端を切断し、中型鉗子を用いて鋤骨を鼻腔から慎重に持ち上げます。直ちにVNOを、氷冷ジェルパック上の実体顕微鏡下にある小型シャーレに移し、以降の解剖手順を行います。次に、組織の乾燥を防ぐため、少量の氷冷S2でVNOを洗浄します。その後、中鉗子で鋤骨の後方を把持し、VNOの軟組織を包む軟骨莢を分離します。そのために、両側のVNOの間の裂け目が見えるように、カプセルを背面から見える位置に配置します。微細鑷子の先端を使用して、後方の篩骨をピンで固定したまま、両側の軟骨VNOカプセルを中心骨から分離させます。以前に篩骨に付着していた内側の軟骨壁が除去されていることを確認してください。VNO周囲の軟骨を除去する際は、軟骨被膜の縁のみを鉗子で把持してください。また、繊細な感覚上皮を損傷しないよう十分注意してください。残りの軟骨を除去するには、VNOを反転させて側面の湾曲した部分をディッシュの底に向け、片側の軟骨を鉗子でしっかりと固定してください。次に、組織と軟骨の間の接続を緩めるため、2本目の精密ピンセットを軟骨とVNOの間に非常に浅い角度で背面から慎重に挿入します。感覚上皮を損傷させないよう、VNOの尾端を持って、軟骨からゆっくりと剥離させます。VNOがカプセルから切り離されたら、残っている小さな軟骨片をすべて取り除きます。軟骨片が残っていると、スライス工程中に組織が周囲のアガロースから剥離してしまうためです。次に、組織の損傷を防ぐため、最初に解剖したVNOに氷冷したS2を少量滴下します。VNOを包埋させるために、2つの小型ペトリ皿の縁まで溶融したS3を満たします。その後、各VNOをアガロースに浸し、表面の細胞外液の膜や気泡を取り除くため、水平方向に数回往復させます。VNOを垂直に配置し、吻側端が皿の底を向くようにします。続いて、両方のディッシュをゲルアイスパックの上に置き、アガロースが凝固するまで待ちます。アガロースの凝固が始まった後は、VNOの向きを変えないでください。向きを変えると、組織が周囲のアガロースから剥離してしまいます。この手順では、小さなスパチュラを使用して、小型ディッシュからアガロースブロックを大型ペトリ皿の蓋に移し、アガロースを上下反転させて、VNOの吻側端が上を向くようにします。次に、外科用メスを用いてブロックをピラミッド状に切り出します。この際、包埋された組織を損傷させないよう注意してください。その後、瞬間接着剤を使用して、ピラミッド状のブロックをビブラトーム試料プレートの中心に固定します。接着剤が完全に乾くまで、約1分間待ちます。試料を150から200 µmの厚さにスライスします。実体顕微鏡下でスライスの形態を簡潔に確認してください。その後、使用するまですべてのスライスを酸素供給チャンバーに移します。このステップでは、VNOスライスをイメージングチャンバーに転送し、厚さ0.1 mmの合成繊維で固定したステンレス製アンカーを用いてスライスの位置を固定します。合成繊維で組織スライスを覆わないようにしてください。次に、イメージングチャンバーを記録装置に移し、室温で酸素飽和S2液をスライスに連続灌流させます。吸引キャピラリーを溶液の表面まで調整し、浴液が常に交換されるようにします。次に、8連マルチバレル灌流ペンシルを、血管を含むVNO切片の非感覚部位の直上かつ近接した位置に調整します。その後、150 millimolar 塩化カリウムを満たしたL字型アガルスブリッジを用いて、参照電極と浴液を接続します。続いて、パッチピペットにピペット溶液S4を満たします。コーティングを削り取らないように注意しながら、ヘッドステージに接続された塩化銀コーティング電極の上にピペットをセットし、しっかりと固定します。次に、バスに導入する前にパッチピペットにわずかな正圧をかけます。ピペットの抵抗値をモニタリングし、4 MΩから10 MΩの間にあることを確認してください。赤外線最適化DICを用いて、CCDカメラでVNOスライスを可視化し、蛍光照明と適切なフィルターキューブを使用して、FPR-rs3 i-Venusを発現している細胞または同様に標識されたニューロンを特定します。感度を最大にするため、ハンドルを用いて細胞体に近づけます。正圧により、ピペット先端が近接すると細胞体膜に小さなへこみが現れます。次に、正圧を解除し、わずかな負圧をかけて細胞膜を吸い込み、1〜20gΩの高抵抗シールを形成します。その後、短く緩やかな吸引を行い、細胞膜を破壊してホールセル構成を確立します。この図では、冠状のVNO組織切片の共焦点画像により、鋤鼻感覚上皮における蛍光FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンの分布が示されています。FPR-rs3 Tau Venus陽性ニューロンは、管腔側の境界にノブ状の構造で終わる単一の頂端樹状突起を有しています。そして、ここにVSN細胞体から行われたホールセルパッチクランプ記録を示します。ここでは、FPR-rs3陽性VSNにおけるTTX感受性高速活性化ナトリウム電流のホールセルパッチクランプ記録の代表的なトレースを示しています。対照条件下での電圧ステップ記録により、電位依存的な速い一過性の内向き電流が認められます。1 µMのTTX処理により、この電流は著しく減少します。ここに示すデジタル減算波形は、TTX感受性の電位依存性ナトリウム電流を示しています。代表的なカレントクランプ記録波形は、段階的な正および負の電流注入によって誘発された脱分極、過分極、および一連の活動電位を示しています。習熟すれば、両側のVNOにおける摘出および組織切片作成の全工程を約1時間で完了させることができます。本手順の後、より大規模なニューロン集団を解析してスループットを向上させるために、細胞外ルースパッチ記録やカルシウムイメージングなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、口側鋤鼻器官から急性組織切片を作製する方法、および鋤鼻感覚ニューロンから単一細胞電気生理学的記録を行う方法について十分に理解することができます。

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Research

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Neuroscience

神経科学

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プリザーブド解剖組織と無傷マウスの鼻腔組織を準備するための効果的なマニュアル脱骨方法

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単核懸濁液のためのマウス嗅覚上皮の迅速な解剖と解離

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