非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

この実験の全体的な目標は、蛍光イメージング技術を使用して、不透明なニットチタン核インプラントの微細構造と細胞接着を視覚化することです。この方法は、不透明な足場を使用した組織工学の解析を進めます。この技術の利点の1つは、定義された培養空気を使用して、細胞の生存率と足場上の増殖を追跡できることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、蛍光染色とその後の視覚化が困難であるため、非常に重要です。細孔径などの個々の足場の特性がタイミングに影響を与えたり、足場の蛍光が使用している蛍光色素の選択に影響を与えたりする可能性があります。厚さ6mmまたは7mmの足場を5本まで5本まで5本入れ、1回の洗濯につき20分間、水で3回洗います。

これを室温で穏やかに攪拌しながら行います。次に、同じ条件下で30ミリリットルの1%Triton X-100溶液で足場を洗浄します。その後、さらに2回の水洗いを行います。

次に、試薬グレードの99%アセトン、99%イソプロパノール、および99%エタノールで足場を順次超音波処理します。各超音波処理ステップを1回の超音波処理ごとに5分間2回実行します。次に、足場を水でさらに3回、合計15分間超音波処理します。

足場を糸くずの出ないティッシュに置き、室温で一晩風乾させて仕上げます。翌日、足場を摂氏121度、PSI15で15分間オートクレーブします。クリーニングが機能したことを確認するには、間接蛍光を使用します。

12ウェルプレートの1ウェルに2000マイクロリットルの新しく作った硫黄-ローダミンB染色溶液をロードし、鉗子を使用して足場をそのウェルに移します。次に、RFP LEDキューブフィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を使用して足場のネガ画像を取得し、高倍率で不純物を探します。バイオセーフティキャビネット1を使用して、清潔な足場を24ウェルプレートのウェルに移します。

各ウェルに500マイクロリットルの37°C培地を加え、足場を15分間浸します。その間、培地1ミリリットルあたり500, 000個のAd-GFP感染SEP1細胞を調製します。15分後、足場から培地を完全に吸引し、100マイクロリットルの細胞懸濁液を装着します。

その後、摂氏37度で30分間インキュベートします。短時間のインキュベーション後、さらに500マイクロリットルの培地を追加し、足場を24時間インキュベートします。翌日、培地を交換して非接着性細胞を除去します。

次に、GFP LEDキューブフィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を使用して、細胞の付着と足場への広がりを評価します。生死染色を行うには、まず前回と同様にSEP1細胞を足場にプレートします。24〜48時間後、培地を完全に吸引し、足場をDPBSで室温で5分間洗浄します。

次に、Calcein AM、Hoechst 33342、およびEthidium homodimerを含む培地を使用して細胞を染色します。これら3つの蛍光色素はすべて光感受性であるため、細胞を暗闇に閉じ込めて前進させることが重要です。細胞を蛍光色素と30分間インキュベートして、足場全体に均一に分布させます。

特定の足場の特性が、このインキュベーション時間に影響します。インキュベーション後、ウェルあたり1ミリリットルを使用して細胞をDPBSで3回洗浄します。各洗浄を室温で5分間実行します。

洗浄後すぐに、蛍光顕微鏡を使用して足場を文書化します。細胞の生存率を経時的に測定するには、レサズリン変換測定を使用します。まず、24ウェルプレートに座ったSEP1細胞から培地を完全に吸引し、ウェルあたり500マイクロリットルのDPBSで細胞を洗浄します。

次に、細胞を必要量の滅菌レサズリン作業溶液で覆い、レサズリンのみを含むウェルを1つ含めます。その後、細胞を摂氏37度で約30分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから100マイクロリットルのコンディショニング上清を96マイクロウェルプレートに移し、テキストプロトコルに記載されているようにその蛍光を測定します。

さらに培養するには、ウェルからレサズリンを取り出し、1ミリリットルのDPBSで3回洗浄します。室温で5分間、各洗浄を行います。3回目の洗浄後、細胞の各ウェルに500マイクロリットルの培地を加え、インキュベーションを続けてさらに経時的な測定を行います。

間接蛍光染色を使用して、洗浄プロトコルを最適化するために、洗浄前の不純物を文書化しました。足場上の物質負荷の大幅な減少は、記載された洗浄プロトコルの効率を示しています。関節形成術の治療に使用される連続したインプラントは、細胞材料界面で起こるイベントによって決定されます。

スキャフォールドに24時間接着した後、SEP1細胞が付着しました。次に、蛍光色素を適用して、足場上での一定期間にわたる細胞死と増殖を調べました。生死染色では、死細胞では赤色の蛍光を発し、生細胞では緑色の蛍光を発する青色の核染色が示されました。

さらに、足場上の細胞生存率は、レサズリン変換アッセイを使用して定量化されました。2週間にわたって、足場の有無にかかわらず培養した細胞についてデータを収集しました。この手順を試行する際は、使用している蛍光色素を利用可能なスキャフォールドと顕微鏡に合わせて調整することを忘れないでください。

この手順に続いて、免疫蛍光染色などの他の方法を適用して、タンパク質の存在やシグナル伝達カスケードの活性化を視覚化することができます。この技術の意味は、細胞面と周囲の組織との相互作用が生体内でその機能と耐久性を定義するため、関節形成術の治療にまで及びます。