Name: 非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ 非透明ニットチタンインプラント上の細胞接着と生存率を蛍光イメージングで可視化する手法。組織工学における細胞・材料相互作用の解析と生体適合性評価に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

プロジェクトは、部分的にZentrales Innovationsprogrammミッテルシュタント（ZIM）デBundesministeriumsエリーゼWirtschaftウントエナジー-KF3010902AJ4によって運営されています。公開手数料は、BG外傷病院テュービンゲン、ドイツによってカバーされています。

<ol><li>Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+new+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">What's new in spine surgery.</a> J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).</li>
<li>Adams, M. A., Dolan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+degeneration%3A+evidence+for+two+distinct+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes.</a> J Anat. 221, 497-506 (2012).</li>
<li>Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+degeneration%3A+current+surgical+options%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Disc degeneration: current surgical options.</a> Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).</li>
<li>Lewis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+pulposus+replacement+and+regeneration%2Frepair+technologies%3A+present+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).</li>
<li>Cunningham, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+scientific+considerations+in+total+disc+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Basic scientific considerations in total disc arthroplasty.</a> Spine J. 4, 219-230 (2004).</li>
<li>Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).</li>
<li>Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+behavior+of+a+new+nucleus+prosthesis+made+of+knitted+titanium+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22SAS+J%22%5BJournal%5D)">Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments.</a> SAS J. 1, 125-130 (2007).</li>
<li>Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+design+criteria+for+intervertebral+disc+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering.</a> J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).</li>
<li>Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+titanium+and+its+alloys%5BTitle%5D)+AND+%22JOM%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of titanium and its alloys.</a> JOM. 60, 46-49 (2008).</li>
<li>Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+optimization+in+total+disc+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biomaterial optimization in total disc arthroplasty.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+cytological+profiling+assay+to+measure+diverse+cellular+states%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states.</a> PLoS One. 8, e80999(2013).</li>
<li>Bocker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+single-cell-derived+human+mesenchymal+stem+cell+line+expressing+hTERT+after+lentiviral+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer.</a> J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).</li>
<li>Ehnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta1+inhibits+bone+morphogenic+protein+%28BMP%29-2+and+BMP-7+signaling+via+upregulation+of+Ski-related+novel+protein+N+%28SnoN%29%3A+possible+mechanism+for+the+failure+of+BMP+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy.</a> BMC Med. 10, 101(2012).</li>
<li>Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+SP+%22Optical+Techniques+in+Regenerative+Medicine%22">Optical Techniques in Regenerative Medicine</a>. , CRC Press. (2013).</li>
<li>Vielreicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+a+deep+look%3A+modern+microscopy+technologies+to+optimize+the+design+and+functionality+of+biocompatible+scaffolds+for+tissue+engineering+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine.</a> J R Soc Interface. 10, 20130263(2013).</li>
<li>Curtis, A., Wilkinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Topographical control of cells.</a> Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).</li>
<li>Niu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+of+endothelial+cells+in+bioengineered+blood+vessels%3A+the+impact+of+crosslinking+of+the+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).</li>
<li>Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+orthopaedics%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in orthopaedics.</a> J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).</li>
<li>Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biological+therapy+for+nucleus+pulposus+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration.</a> Osteoarthritis Cartilage. , (2015).</li>
<li>Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</a> (2016).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する利害を持っていないことを宣言します。仕事のいかなる部分も行われていないか、パブリケーションのために検討中であるか、他の場所で公開されているいます。

足場の表面は、それによってインプラントに機能的な耐久性を決定するインビボで周囲組織との相互作用において重要な役割を果たしています。したがって、足場の生体適合性の足場上に播種する細胞を用いたin vitroアッセイ（SCP1細胞株）によって研究されています。 薄く、光学的に透明な足場で良好な性能を発揮顕微鏡技術は十分に生体適合性を研究するための非透過足場に適しています。これは、非透明な足場は有意な歪み15ずに侵入する光を妨げる主な理由です。部分的にこれらの問題を克服するために、我々はこれと共に、様々なフルオロフォアを使用して編まれたチタン製足場中/上の細胞の評価方法を確立します。 チタンワイヤの折り畳み、続いて編成を可能にするために、材料が強い腐食性及び有害物質（潤滑剤、媒染剤、エレクトロと接触しますトレースが足場/上に残っている場合、足場の生体適合性を変えるかもしれない溶液）、-polishing。開発した間接蛍光プロトコル（プロトコル5）の助けを借りて、我々は、骨格構...

慢性腰痛は多因子疾患です。椎間板変性疾患に対する低侵襲性治療の選択肢への関心は、1950年代から成長してきました。今日まで、脊柱のマルチセグメントの融合は、最も広く使用されている治療法です。以来、この方法は、多くの場合、影響を受けたセグメント1,2の移動度の制限につながり、関節形成術の時代の探査は、広い関心となりました。総椎間板置換および核置換における重要な進歩は、慢性腰痛1を治療するための良い代替となっています。巨大な進歩にもかかわらず、方法のいずれも臨床的に評価されていません。低剛性核インプラントは、総椎間板置換に有望な代替を表す線維輪が3,4無傷であることを条件とします。しかし、現在市場に存在する核インプラントは、多くの場合、椎体の変化、脱臼、椎間板の垂直高さ損失およびトンなどの合併症に関連付けられています必要に応じて、関連する機械的剛性5の彼が欠如。現在の欠点を克服するために、編みチタンワイヤからなる新規な核移植に成功6開発されています。ユニークなニット構造のために、この新たに開発された足場は、 例えば著名な生体力学的特性、減衰機能、細孔サイズ、積載能力と信頼性7を示しています。この小説核インプラントの生体適合性をテストするために目指して、インプラントの非透明な性質に起因する（光）解析技術に厳しい制限を描きました。 生体適合性を試験するために、細胞-金属相互作用が重要な役割を果たしている8-10。細胞および骨格の間の相互作用は、ホストシステム内のより良いインプラント統合のための安定化、したがって、必要です。しかし、増加内方成長の深さは、足場の機械的特性を変化させる可能性があります。 invesに目指して足場表面は細胞の付着、増殖および分化、またはのための基盤を提供しているかどうかtigate金属は、細胞の生存率に影響を与えるかどうか、それは非透明と不透明の足場に/上の細胞を画像化する一般的な周知の問題のトラブルシューティングを行うことが重要です。この制限を克服するために、いくつかの蛍光に基づく技術を調査しました。企業は生きている細胞、細胞区画、あるいは特定の細胞状態11を可視化する蛍光体の大規模な範囲を提供します。この実験のためのフルオロフォアは、最高の我々の蛍光顕微鏡に適合するために、オンラインツールスペクトル視聴者の助けによって選択しました。 上の細胞の追跡を可能にするためにosteochondro-前駆細胞の1）蛍光（緑色蛍光タンパク質/ GFP）の標識：非透過ニットチタン足場内/上の接着細胞の挙動の分析のための開発戦略は、以下を含み、足場、2）の生存率を測定する（水戸市chondrial細胞の活性）、および3）足場内の細胞 - 細胞および細胞 - 材料相互作用を可視化します。手順は、簡単に他の付着細胞および他の非透明または不透明な足場に転送することができるという利点を有します。さらに、生存率および内部成長パターンが数日間にわたって監視することができ、したがって、足場材料又は細胞の限られた量で使用することができます。 本研究は、細胞生存率を測定し、非透過ニットチタン足場に/上osteochondro-前駆細胞の内部成長パターンを可視化するために私たちの現在のプロトコルの使用の成功を示しています。また、開発されたプロトコルは、足場の不純物を決定するために、洗浄プロトコルを確認するために使用され得ます。

<table><tbody><tr><td>6/24/48ウェルプレート、T25/ T75培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>*</td><td></td></tr><tr><td>* 24ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>CELLSTAR 662 160</td><td></td></tr><tr><td>* 48ウェルプレート</td><td>Corning Incorporated USA</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>* 6ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>* T25</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>* T75</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>658 175</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、プルム &ge; 99.0%</td><td>Carl Roth</td><td>3738.4</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan-2&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>Thermo Scientific</td><td>safe 2020</td><td></td></tr><tr><td>Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM)</td><td>Sigma</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubtator</td><td>Binder, Tuttlingen, Germany</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>フィルターユニット (0.22 &micro;m)</td><td>ミリポア、IRL</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810 R および 5417 R</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、NY</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルフォキシド (DMSO)</td><td>カール・ロス</td><td>4720.2</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'CaなしのPBS &Mg</td><td>Sigma</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 99%</td><td>&nbsp;SAV液体製品。GmBH</td><td>475956</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムホモダイマー</td><td>Sigma</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 蛍光イメージングシステム</td><td>Life technologies</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ニットチタン核インプラント</td><td>バックco&KG、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタミンによるMEMアルファ修飾 ヌクレオシドなし</td><td>シグマ</td><td>E15-832</td><td></td></tr><tr><td>オメガマイクロプレートリーダー</td><td>BMGラボテック、ドイツ</td><td>FLUOstar オメガ</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>レサズリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>199303-1G</td><td></td></tr><tr><td>スルフォロダミンBナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>S1402-1G</td><td></td></tr><tr><td>試験管回転子</td><td>Labinco B.V.,オランダ</td><td>モデル LD-76</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (ヒドロキシメチル) アミノメサン</td><td>カール・ロス</td><td>AE15.1</td><td></td></tr><tr><td>トリトン</td><td>カール・ロス</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.5%</td><td>カール・ロス</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>シグマ</td><td>L11-004</td><td></td></tr></tbody></table>

非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

椎間板変性症と椎間板ヘルニアは、腰痛の主な原因の一つです。細胞外マトリックスの枯渇は、髄核(NP)の押し出しで最高潮に達し、椎間板の破壊につながります。現在利用可能な外科的治療は痛みを軽減しますが、脊椎の機械的機能を回復させるものではありません。脊椎の機械的特徴を維持するために、椎間板または核の全置換は広く関心を集めました。しかし、この関節形成術の時代は、既存の製品がいずれも臨床的に評価されていないため、まだ未成熟な状態にあります。
この研究は、ニットチタンワイヤーで作られた新しい核インプラントの生体適合性をテストすることを目的としています。すべての機械的な利点にもかかわらず、この材料には、結果として得られるインプラントが不透明であるため、従来の光学分析には限界があります。ここでは、足場上の骨軟骨前駆細胞のin vitroでの可視化、追跡、および生存率試験を説明する戦略を紹介します。このプロトコルは、洗浄プロトコルの効率を視覚化するだけでなく、これらおよび他の不透明な足場の生体適合性を調査するために使用できます。さらに、このプロトコルは、細胞の接着パターン、ならびに足場上/足場内の細胞生存率および増殖速度を示すために使用できます。このin vitro生体適合性試験アッセイは、不透明および不透明な足場における細胞材料相互作用を分析するための適切なツールを提供します。

予備的な結果は、記載の新規核インプラントだけでなく、良好な減衰特性を持っているだけでなく、SCP-1細胞を用いた生体適合性であることを示しました。インプラントの製造プロセスの間、それは強い腐食性及び有害物質（潤滑剤、媒染剤、電解研磨液）に接触します。間接蛍光染色技術の助けを借りて、我々は残りの不純物を可視化し、その結果、足場の物質負荷の有意な減少を示した洗浄プロトコルを最適化することができた。 図3は、確立された洗浄プロトコルの効率を示す図 。 関節形成術の処置のために使用インプラントの成功は、細胞材料界面で起こる事象によって決定される。プロトコル部6重要なトランスで説明したように、図4は 、めっきの24時間後に、足場に付着した細胞を示しますSCP-1細胞のフェクション効率は、我々は、足場（ 図2参照 ）の画像間葉系間...

ここでは、非透明なチタン足場に細胞生存率を検出するだけでなく、足場不純物の見え隠れを検出するためのフルオロフォアベースのイメージング技術を提示します。このプロトコルは、非透明の足場上のイメージング細胞 - 細胞または細胞 - 金属相互作用の欠点をトラブルシューティングします。

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

この実験の全体的な目的は、蛍光イメージング技術を用いて、不透明な編み込みチタン核インプラントの微細構造およびその上の細胞接着を可視化することです。この手法は、不透明なスキャホールドを用いた組織工学の解析を前進させるものです。この技術の利点の一つは、規定の培養条件下で、スキャホールド上の細胞生存率および増殖を追跡できることです。蛍光染色およびその後の可視化は困難であるため、本手法を視覚的に実演することが不可欠です。孔径などの個々のスキャフォールドの特性がタイミングに影響する場合があるほか、スキャフォールド自体の蛍光が使用する蛍光色素の選択に影響を与える可能性があります。厚さ6～7 mmのスキャフォールドを最大5個まで50 mLチューブに入れ、1回20分間の水洗を3回行います。室温で緩やかに攪拌しながら行ってください。次に、同じ条件下で、30 mLの1% Triton X-100溶液でスキャフォールドを洗浄します。その後、さらに2回、水で洗浄してください。次に、スカフォールドを試薬グレードの99%acetone、99%isopropanol、および99%ethanolの順で順次超音波洗浄します。各超音波洗浄ステップを、1回5分間で2回ずつ行います。その後、スカフォールドを水中でさらに3回、計15分間超音波洗浄します。最後に、スキャフォールドを糸くずの出ないティッシュの上に置き、室温で一晩的に風乾させます。翌日、121 °C、15 PSIで15分間、スキャフォールドをオートクレーブで滅菌します。洗浄が適切に行われたかを確認するため、間接蛍光法を用います。12ウェルプレートの1ウェルに、調製したばかりの硫黄-Rhodamine B染色液を2000 microliters分分注し、ピンセットを用いてスキャフォールドをそのウェルに移動させます。次に、RFP LEDキューブフィルターセットを装着した蛍光顕微鏡を用いてスキャフォールドのネガティブ画像を撮影し、高倍率で不純物がないかを確認します。安全キャビネット内で、清浄なスキャフォールドを24ウェルプレートのウェルに移動させます。各ウェルに37 °Cに温めた培地を500 µL加え、スキャフォールドを15分間浸漬させます。その間に、培地1 mLあたり500,000個のAd-GFP感染SEP1細胞を調製します。15分後、スキャフォールドから培地を完全に吸引し、100 µLの細胞懸濁液を播種します。次に、37 °Cで30分間インキュベートします。短時間のインキュベーション後、さらに500 µLの培養液を加え、スキャフォールドを24時間インキュベートします。翌日、培養液を交換して、非接着細胞を除去します。次に、GFP LEDキューブフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用いて、スキャフォールド上での細胞の接着および伸展性を評価します。生死染色を行うには、まず前述と同様にSEP1細胞をスキャフォールド上に播種します。24〜48時間後、培地を完全に吸引し、室温で5分間DPBSを用いてスキャフォールドを洗浄します。次に、Calcein AM、Hoechst 33342、およびEthidium homodimerを含む培地を用いて細胞を染色します。これら3つの蛍光色素はすべて光に敏感であるため、以降の工程では細胞を遮光状態で保持することが極めて重要です。蛍光色素とともに細胞を30分間インキュベートし、スキャフォールド全体に均一に分布させます。足場の具体的な特性によって、このインキュベーション時間は変動します。インキュベーション後、1ウェルあたり1 mLのDPBSを用いて、細胞を3回洗浄します。各洗浄は室温で5分間行います。洗浄後直ちに、蛍光顕微鏡を用いてスキャホールドを記録します。経時的な細胞生存率を測定するには、レサズリン変換測定を用います。まず、24ウェルプレートに播種したSEP1細胞から培地を完全に吸引し、1ウェルあたり500 µLのDPBSで細胞を洗浄します。次に、必要な量の滅菌済みレサズリン作業溶液を細胞に加え、レサズリンのみを入れたウェルを1つ設けます。その後、細胞を37°Cで約30分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから100 µLの調整済み上清を96ウェルプレートに移し、テキストプロトコルに従って蛍光を測定します。さらに培養を続けるには、ウェルからレサズリンを除去し、1 mLのDPBSで3回洗浄します。各洗浄は室温で5分間行います。3回目の洗浄後、各細胞ウェルに500 µLの培地を加え、さらにタイムコース測定を行うため、インキュベーションを継続します。間接蛍光染色を用いて、洗浄プロトコルを最適化するために洗浄前の不純物を記録しました。足場上の物質負荷が大幅に減少したことは、記述した洗浄プロトコルの効率性を示しています。人工関節置換術に使用される後続のインプラントは、細胞と材料の界面で起こる事象によって決定されます。スキャフォールドへの24時間の接着後、SEP1細胞が付着した。次いで、スキャフォールド上での細胞死および増殖を一定期間にわたって検討するため、蛍光色素を適用した。ライブ・デッド染色の結果、核が青色に染色され、死細胞は赤色蛍光を、生存細胞は緑色蛍光を示した。さらに、レザズリン変換アッセイを用いて、スキャフォールド上の細胞生存率を定量しました。2週間にわたり、スキャフォールドあり、またはなしの条件下で培養した細胞のデータを収集しました。この手順を行う際は、使用するフルオロフォアを、利用可能なスキャフォールドおよび顕微鏡に合わせて調整することが重要です。本手順に続き、免疫蛍光染色などの他の手法を適用することで、タンパク質の存在やシグナル伝達カスケードの活性化を可視化することができます。この技術の意義は、in vivoにおいて細胞が周囲の組織とどのように相互作用するかがその機能と耐久性を決定するため、人工関節置換術などの治療法へと広がります。

imaging-cell-viability-on-non-transparent-scaffolds-using-example

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

エレクトロ足場は、組織工学アプリケーションのためのポストプロダクションを処理することができます。ここでは、複雑な足場を回転するためのメソッドを（連続した回転で）記述し、厚い足場（マルチレイヤーによる熱を使用するか、水蒸気アニール）を行うために、無菌性（無菌製造又は殺菌のポストプロダクション）を達成するために、適切な生体力学的特性を達成するために。...

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

このビデオでは、それらの機能を改善し、細胞移動を制御するために多孔性金属インプラントのための改質技術を実証する。技術は、3Dおよび基底膜の製造は2-Dにおける細胞移動を制御する模倣における細胞移動を制御するための細孔勾配の発達が挙げられる。また、血液タンパク質の分析を介して生体内インプラント統合を監視するためのHPLCベースの方法が記載されている。...

毛穴グラデーション、高分子電解質とその間接的モニタリングの金属インプラントのマルチスケール変更<em生体内で&gt;</em

血管新生は、正常組織工学におけるアプローチの鍵となります。したがって、信頼性の高い技術は、組織構築物における血管網の発達を評価するために必要とされる。ここでは、可視化し、 生体内で血管新生を定量化するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提示する。...

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

動物の屠殺まで、インビボでのエンドツーエンドの吻合およびリアルタイムデジタル評価を用いて、ヒツジの頸動脈への組織工学的船（TEVS）の間の位置に配置するためのステップバイステップのプロトコル。...

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

設計されたマイクロチャネルを持つ骨のようなテンプレートを作成するための段階的な一般的なプロセスが提示されます。テンプレートの高い吸収能力と保持能力は、マイクロチャネルを介した毛細管現象によって実証されます。...

骨様テンプレートでのマイクロチャネルによって独特の毛細管現象は大骨欠損の回復のために細胞の動員を強化することができます

生体活性で機械的に信頼性の高い金属足場は、多孔質Tiの製造のための動的凍結鋳造とTi足場のコーティングと緻密化の2つのプロセスからなる方法で製造されています。緻密化プロセスはシンプルで効果的であり、機能的に等級付けされた足場の製造に適用できます。...

バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

ここに提示される、血管および他の管状構造のティッシュ工学のために適した中空足場の1ステップの製造のための簡単な使用、コア/シェル、三次元バイオプリンティングの組み立てである。...

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

この論文では、神経芽腫細胞株を以前に説明した3次元コラーゲンベースの足場に播種し、所定の時間枠で細胞増殖を維持し、さまざまな実験目的を満たすために適応可能な、いくつかの細胞増殖および細胞挙動分析およびダウンストリームアプリケーション用の足場を回収するために必要な手順をリストしています。...

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

本研究では、植物由来の生体材料の脱細胞化、物性評価、イメージング、 in vivo...

骨組織工学のための脱細胞化リンゴ由来の足場( In Vitro および In Vivo)

このプロトコルは、3Dレーザー印刷を使用した埋め込み型統合イメージングウィンドウの作成について説明しています。このウィンドウは、マイクロレンズとマイクロスキャフォールドを組み合わせたシステムで構成されています。この方法では、生体適合性フォトレジストSZ2080の2光子重合(2PP)を連続的に行い、製造効率と異なるコンポーネント間のアライメントを最適化します。...

高度な In vivo イメージングのための微細構造イメージングウィンドウに統合された埋め込み型光学系の微細加工

学ぶ 非透明ニットチタンインプラント上の細胞接着と生存率を蛍光イメージングで可視化する手法。組織工学における細胞・材料相互作用の解析と生体適合性評価に応用可能です。

非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

さらに動画を探す