高度な In vivo イメージングのための微細構造イメージングウィンドウに統合された埋め込み型光学系の微細加工
April 11th, 2025
このプロトコルは、3Dレーザー印刷を使用した埋め込み型統合イメージングウィンドウの作成について説明しています。このウィンドウは、マイクロレンズとマイクロスキャフォールドを組み合わせたシステムで構成されています。この方法では、生体適合性フォトレジストSZ2080の2光子重合(2PP)を連続的に行い、製造効率と異なるコンポーネント間のアライメントを最適化します。
生体適合性材料の3Dレーザープリンティングによって製造された小型チップをリアルタイムで可視化し、埋め込むことで、生きた動物の生物学的プロセスの研究を強化します。
主な課題は、異なる書き込み条件を考慮して、出力や速度などの製造パラメータを微調整し、同じサブセットの両方の表面の微細構造を精度と一貫性で調整することです。正確な結果は、さまざまな生物学的用途のために、大型マイクロレンズを3D微細構造ターゲット領域に直接結合する、革新的な埋め込み型光学イメージングツールを製造するための汎用性の高いプロトコルを確立することです。
製造プロトコルが最適化されたので、チップのイメージング機能の埋め込みとデモンストレーションに取り組んでいます。たとえば、in vivo myo-material 試験の場合です。
【AIインストラクター】まず、フェムト秒近赤外レーザー光源のスイッチを入れます。キネマティックミラーマウントに取り付けられた一連の光学系とミラーを介して顕微鏡の対物レンズに到達するまで、レーザービームの光路を位置合わせします。ミラーを繰り返し回転させて、ビームを近赤外線位置合わせ内で中央に配置します。ピンホールは、後方反射センタリングを使用してレーザービームをサンプルホルダーに垂直に向けます。サンプルをサンプルホルダーに取り付けるには、テープを使用して、2 回に滴下したガラス カバー スリップをサンプル ホルダーに固定し、2 番目の滴を下に向けてします。次に、サンプルホルダーを翻訳ステージに取り付け、サンプルホルダーを手動で取り付けてから、長作動距離顕微鏡対物レンズを光路の端にある専用サポートにサンプルの近くに取り付け、サンプルを対物レンズの中央に配置します。レーザー出力を、CCDカメラソフトウェアでビーム反射を視覚化するのに十分な最小値(約5ミリワット)に設定します。レーザービームを最初のレジストドロップの上面に焦点を合わせます。ドロップの曲線プロファイルに従って、x方向とy方向に沿ってサンプルエッジを見つけます。ソフトウェアを使用して、液滴の中心を絶対零度基準として設定します。ガラスカバースリップの上面とサンプルの中心にあるフォトレジストの最初の液滴の基部との間の界面にレーザービームを集中させます。これを z 軸のゼロ参照として設定します。12 mm のカバー スリップの場合は、負の x 軸方向のエッジ位置に約 3.5 mm 移動し、同じインターフェイスに焦点を合わせます。これをZ方向に沿った絶対零度参照として設定します。正のx軸方向について約3.5ミリメートル同じことを繰り返し、同じインターフェースに焦点を合わせます。次に、サンプルを傾けて、負のx軸と正のx軸の間のz方向の偏差を補正します。y 軸の x 軸に沿って前に示したのと同じ手順を実行します。x軸とy軸の両方でバランスが取れたら、中央位置に戻り、ガラスとレジストの間の界面に焦点を合わせます。フォーカスの新しい z 値を z 軸上のゼロ参照として設定します。赤色LED照明システムのスイッチを入れると、重合プロセスをリアルタイムで監視できます。レーザーをオフにした状態で、ガラスカバースリップの下のz方向に沿って対物レンズを動かし、ガラスの底面とレジストの下部液滴のベースとの間の2番目の界面を見つけます。レーザー出力を 100 ミリワットに上げて、2 光子重合を開始します。単純な参照構造が重合するまでzを大きくして焦点位置を調整します。この初期焦点位置を Z 軸に沿ったゼロ参照として設定します。重合能力を100〜200ミリワットに設定し、マシンコードを並進段階のコンピューター数値制御プログラムとして実行して、目的の3次元構造を製造します。次に、z軸に沿って移動して、上部ガラス表面とフォトレジストの上部液滴の間の最初の界面に戻ります。単純な参照構造を重合して、界面を見つけます。重合の最初の線を z 軸に沿ったゼロ基準として設定します。重合力を15〜20ミリワットの間で調整し、並進ステージの動きをガイドするプログラムを実行します。レーザーをオフにした状態で、x、y、およびz並進軸を無効にし、サンプルホルダーを実験製造セットアップから取り外します。粘着テープを修復し、サンプルをホルダーから取り外します。サンプル現像後、ガラスカバースリップをグランドプレーンから吊り下げたサンプルホルダーに置き、マイクロレンズを下に向けてサンプルを置きます。ガラスカバースリップの表面に対して垂直に向けられたUV光源の下にサンプルを配置します。サンプルを紫外線にさらします。300ミリワットで120秒間設定します。 UV光源をサンプル面の法線位置に対してプラスマイナス45度に傾け、露光手順を繰り返します。ガラスサンプルをSEMカメラの向きに対して45度の角度でホルダーに置きます。ガラスカバースリップの両面に対して取得プロセスを繰り返して、マイクロ足場とマイクロレンズの3次元SEM画像を収集します。提示された手順により、同じデバイスの両方の表面の 3D 微細構造の重合が可能になり、優れた分解能と安定性が確保されます。in vitroイメージングは、マイクロレンズを通して画像化されたマイクロ足場内の細胞の成功した増殖を示し、提案されたデバイスの最終的なアプリケーションの例を表しています。
概要
このプロトコルは、3Dレーザープリント技術を用いた埋め込み型統合イメージングウィンドウの製造を概説しています。革新的な設計は、マイクロレンズとマイクロスキャフォールドを組み込み、生きた動物の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化することを可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 光学イメージング
背景
- 生物学的研究におけるリアルタイムイメージングは、動的なプロセスを理解するために重要です。
- 3Dレーザープリントは複雑な微細構造の作成において精度を提供します。
- 生体適合性材料は埋め込み型デバイスに不可欠です。
- 二光子重合（2PP）は微細構造の製造における重要な技術です。
研究の目的
- 光学イメージングツールを作成するための多目的プロトコルを開発すること。
- 生体内の生物学的プロセスの視覚化を向上させること。
- 効率性と精度を向上させるための製造パラメータを最適化すること。
使用された方法
- 2PPのためのフェムト秒近赤外レーザーの利用。
- 精密なレーザーターゲティングのための光学コンポーネントの位置合わせ。
- 生体適合性フォトレジストの段階的重合。
- LED照明を用いた重合プロセスのリアルタイムモニタリング。
主な結果
- 高解像度の3D微細構造の成功的な製造。
- マイクロスキャフォールド内の細胞成長のin vitroイメージングのデモンストレーション。
- 光学コンポーネントの統合のための信頼性の高いプロトコルの確立。
- 埋め込みデバイスのイメージング能力の検証。
結論
- 開発されたイメージングウィンドウは生物学的研究を大幅に前進させることができます。
- 最適化された製造技術は再現性と精度を確保します。
- このプロトコルは生きた動物研究における将来の応用のための基礎となります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Implantable microstructured imaging windows with integrated optics enable real-time, high-resolution visualization of biological processes in living animal models, directly supporting advanced biomaterials and drug testing. This capability enhances predictive confidence in preclinical research by allowing quantitative, longitudinal assessment of immune responses and tissue integration. The streamlined fabrication protocol increases reproducibility and scalability, positioning the technology as a reusable platform for translational R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct, in vivo quantification of immune and tissue responses to candidate biomaterials.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time imaging of biological interactions at the implant interface.
- Facilitates functional validation of targets and pathways in physiologically relevant settings.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for evaluating biomaterial and drug effects in animal models.
- Delivers quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
- Streamlines assay development by integrating micro-scaffolds and optics in a single implantable device.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant in vivo models for translational biomarker discovery and validation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting longitudinal studies in the same animal.
- Reduces biological risk by providing robust, real-time data on implant performance and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This microfabrication protocol fits within the continuum from early discovery through preclinical validation, enabling seamless integration of advanced imaging into biomaterials and drug testing workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of biological responses in vivo.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible devices for standardized evaluation of candidate materials or compounds.
- Analytics: Generates quantitative imaging data for robust statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and risk-adjusted advancement decisions based on in vivo performance.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse preclinical applications across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in preclinical studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in implantable device fabrication.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content, real-time data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomaterial and drug candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon polymerization and microfabrication techniques.
- Needs access to femtosecond laser systems, UV curing infrastructure, and advanced imaging platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization of fabrication and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different animal models or tissue targets.
- Structural and optical performance must be validated for each new application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:05
Alignment, Sample Mounting, and Tilt Compensation for Two-Photon Polymerization of Microstructures
3:55
Micro-Scaffolds 2PP on the Lower Photoresist Drop and Microlenses 2PP on the Upper Photoresist Drop
5:24
Sample Development, UV Irradiation, and Morphological Characterization
6:43
Representative Results
