高度な In vivo イメージングのための微細構造イメージングウィンドウに統合された埋め込み型光学系の微細加工

生体適合性材料の3Dレーザープリンティングによって製造された小型チップをリアルタイムで可視化し、埋め込むことで、生きた動物の生物学的プロセスの研究を強化します。

主な課題は、異なる書き込み条件を考慮して、出力や速度などの製造パラメータを微調整し、同じサブセットの両方の表面の微細構造を精度と一貫性で調整することです。正確な結果は、さまざまな生物学的用途のために、大型マイクロレンズを3D微細構造ターゲット領域に直接結合する、革新的な埋め込み型光学イメージングツールを製造するための汎用性の高いプロトコルを確立することです。

製造プロトコルが最適化されたので、チップのイメージング機能の埋め込みとデモンストレーションに取り組んでいます。たとえば、in vivo myo-material 試験の場合です。

【AIインストラクター】まず、フェムト秒近赤外レーザー光源のスイッチを入れます。キネマティックミラーマウントに取り付けられた一連の光学系とミラーを介して顕微鏡の対物レンズに到達するまで、レーザービームの光路を位置合わせします。ミラーを繰り返し回転させて、ビームを近赤外線位置合わせ内で中央に配置します。ピンホールは、後方反射センタリングを使用してレーザービームをサンプルホルダーに垂直に向けます。サンプルをサンプルホルダーに取り付けるには、テープを使用して、2 回に滴下したガラス カバー スリップをサンプル ホルダーに固定し、2 番目の滴を下に向けてします。次に、サンプルホルダーを翻訳ステージに取り付け、サンプルホルダーを手動で取り付けてから、長作動距離顕微鏡対物レンズを光路の端にある専用サポートにサンプルの近くに取り付け、サンプルを対物レンズの中央に配置します。レーザー出力を、CCDカメラソフトウェアでビーム反射を視覚化するのに十分な最小値(約5ミリワット)に設定します。レーザービームを最初のレジストドロップの上面に焦点を合わせます。ドロップの曲線プロファイルに従って、x方向とy方向に沿ってサンプルエッジを見つけます。ソフトウェアを使用して、液滴の中心を絶対零度基準として設定します。ガラスカバースリップの上面とサンプルの中心にあるフォトレジストの最初の液滴の基部との間の界面にレーザービームを集中させます。これを z 軸のゼロ参照として設定します。12 mm のカバー スリップの場合は、負の x 軸方向のエッジ位置に約 3.5 mm 移動し、同じインターフェイスに焦点を合わせます。これをZ方向に沿った絶対零度参照として設定します。正のx軸方向について約3.5ミリメートル同じことを繰り返し、同じインターフェースに焦点を合わせます。次に、サンプルを傾けて、負のx軸と正のx軸の間のz方向の偏差を補正します。y 軸の x 軸に沿って前に示したのと同じ手順を実行します。x軸とy軸の両方でバランスが取れたら、中央位置に戻り、ガラスとレジストの間の界面に焦点を合わせます。フォーカスの新しい z 値を z 軸上のゼロ参照として設定します。赤色LED照明システムのスイッチを入れると、重合プロセスをリアルタイムで監視できます。レーザーをオフにした状態で、ガラスカバースリップの下のz方向に沿って対物レンズを動かし、ガラスの底面とレジストの下部液滴のベースとの間の2番目の界面を見つけます。レーザー出力を 100 ミリワットに上げて、2 光子重合を開始します。単純な参照構造が重合するまでzを大きくして焦点位置を調整します。この初期焦点位置を Z 軸に沿ったゼロ参照として設定します。重合能力を100〜200ミリワットに設定し、マシンコードを並進段階のコンピューター数値制御プログラムとして実行して、目的の3次元構造を製造します。次に、z軸に沿って移動して、上部ガラス表面とフォトレジストの上部液滴の間の最初の界面に戻ります。単純な参照構造を重合して、界面を見つけます。重合の最初の線を z 軸に沿ったゼロ基準として設定します。重合力を15〜20ミリワットの間で調整し、並進ステージの動きをガイドするプログラムを実行します。レーザーをオフにした状態で、x、y、およびz並進軸を無効にし、サンプルホルダーを実験製造セットアップから取り外します。粘着テープを修復し、サンプルをホルダーから取り外します。サンプル現像後、ガラスカバースリップをグランドプレーンから吊り下げたサンプルホルダーに置き、マイクロレンズを下に向けてサンプルを置きます。ガラスカバースリップの表面に対して垂直に向けられたUV光源の下にサンプルを配置します。サンプルを紫外線にさらします。300ミリワットで120秒間設定します。 UV光源をサンプル面の法線位置に対してプラスマイナス45度に傾け、露光手順を繰り返します。ガラスサンプルをSEMカメラの向きに対して45度の角度でホルダーに置きます。ガラスカバースリップの両面に対して取得プロセスを繰り返して、マイクロ足場とマイクロレンズの3次元SEM画像を収集します。提示された手順により、同じデバイスの両方の表面の 3D 微細構造の重合が可能になり、優れた分解能と安定性が確保されます。in vitroイメージングは、マイクロレンズを通して画像化されたマイクロ足場内の細胞の成功した増殖を示し、提案されたデバイスの最終的なアプリケーションの例を表しています。