チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

この手順の全体的な目標は、喀痰と抗生物質に反応したバイオフィルムの変化を視覚化し、定量化することです。この方法は、研究者が細菌のバイオフィルムに対するさまざまな抗生物質の有効性が喀痰の存在によってどのように影響を受けるかなど、重要な問題を理解するために使用できます。この方法論の主な利点は、さまざまな要因に応じてバイオフィルムに発生する変化を個人が確認できることです。

実験を開始するには、以前に取得した喀痰サンプルの量を記録します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加し、サンプルの2倍の容量を加えます。次に、トランスファーピペットを使用してサンプルを完全に混合します。

サンプルを最高設定で1分間ボルテックスして、完全に混合します。混合物の1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。次に、チューブをスピンダウンします。

遠心分離後、上清を保存し、ペレットを廃棄します。フィルターは、0.22ミクロンのフィルターで上清を滅菌し、清潔な微量遠心チューブに集めます。将来の使用のために、喀痰の上清を摂氏80度で保管します。

40マイクロリットルの培養物を4ミリリットルの新鮮なルリアブロスまたはLB培地に入れ、細菌を増殖させて600ナノメートルで0.55の光学密度の培養物を得る。次に、100マイクロリットルの0.5OD培養物をLBで調製した10%喀痰濾液の400マイクロリットルに希釈します。希釈液の200マイクロリットルを使用して、スライドチャンバーのウェルに播種します。バクテリアを振らずに摂氏37度で4時間付着させます。

4時間後、メディアを取り出し、バイオフィルムを1X fresh LBで優しく洗浄します。残りのメディアを200マイクロリットルの新しいLBと交換します。バイオフィルムを振らずに摂氏37度で成長させます。バイオフィルムが顕微鏡検査の準備ができるまで、12時間ごとに洗浄せずにメディアを交換してください。付着したバクテリアを乱さないように、スライドをやさしく洗うことが非常に重要です。

成長後、チャンバーウェルから培地を取り出し、300マイクロリットルの滅菌PBSで各チャンバーを2回優しく洗浄します。次に、バイオフィルム染色混合物を調製するために、生存率キットに用意されている各色素の1マイクロリットルを必要な溶液の各ミリリットルに加えて、溶液を混合します。最適な色素量と染色時間は、各生物について経験的に決定されます。

200マイクロリットルの染色混合物をチャンバー付きカバーガラスの各ウェルに加えます。カバーガラスをインキュベートします。インキュベーション後、染色混合物をチャンバーから取り出し、各ウェルを300マイクロリットルの滅菌PBSで洗浄します。

PBSを新しいメディアと交換します。最後に、共焦点顕微鏡による可視化を進めます。Burkholderia cepacia complex、またはBCC臨床分離株の代表的な画像は、培地のみまたは10%の喀痰濾液の存在下でチャンバーカバーガラスで48時間成長した後、それらの存在がバイオフィルムの構造を変えることができることを示しています。

画像はComstatソフトウェアで分析され、バイオフィルムの平均厚さ(10%の喀痰で処理した場合に増加した)など、主要なバイオフィルムパラメータを取得しました。バイオフィルムの成長に対するさまざまな要因の影響を理解するために、臨床分離株は培地のみまたは喀痰で増殖させ、抗生物質の有無にかかわらず治療しました。このビデオを見れば、チャンバーカバーガラス上にバイオフィルムを形成および処理する方法、および染色および共焦点分析の準備方法について十分に理解できるはずです。