チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化
2016年12月14日
このプロトコルは、スライドチャンバーモデルを使用して、宿主因子への曝露後のバイオフィルムの発達の可視化を説明しています。このモデルにより、バイオフィルムの現像を直接可視化するだけでなく、コンピュータソフトウェアプログラムを使用してバイオフィルムのパラメータを解析することができます。
この手順の全体的な目標は、喀痰と抗生物質に反応したバイオフィルムの変化を視覚化し、定量化することです。この方法は、研究者が細菌のバイオフィルムに対するさまざまな抗生物質の有効性が喀痰の存在によってどのように影響を受けるかなど、重要な問題を理解するために使用できます。この方法論の主な利点は、さまざまな要因に応じてバイオフィルムに発生する変化を個人が確認できることです。
実験を開始するには、以前に取得した喀痰サンプルの量を記録します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加し、サンプルの2倍の容量を加えます。次に、トランスファーピペットを使用してサンプルを完全に混合します。
サンプルを最高設定で1分間ボルテックスして、完全に混合します。混合物の1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。次に、チューブをスピンダウンします。
遠心分離後、上清を保存し、ペレットを廃棄します。フィルターは、0.22ミクロンのフィルターで上清を滅菌し、清潔な微量遠心チューブに集めます。将来の使用のために、喀痰の上清を摂氏80度で保管します。
40マイクロリットルの培養物を4ミリリットルの新鮮なルリアブロスまたはLB培地に入れ、細菌を増殖させて600ナノメートルで0.55の光学密度の培養物を得る。次に、100マイクロリットルの0.5OD培養物をLBで調製した10%喀痰濾液の400マイクロリットルに希釈します。希釈液の200マイクロリットルを使用して、スライドチャンバーのウェルに播種します。バクテリアを振らずに摂氏37度で4時間付着させます。
4時間後、メディアを取り出し、バイオフィルムを1X fresh LBで優しく洗浄します。残りのメディアを200マイクロリットルの新しいLBと交換します。バイオフィルムを振らずに摂氏37度で成長させます。バイオフィルムが顕微鏡検査の準備ができるまで、12時間ごとに洗浄せずにメディアを交換してください。付着したバクテリアを乱さないように、スライドをやさしく洗うことが非常に重要です。
成長後、チャンバーウェルから培地を取り出し、300マイクロリットルの滅菌PBSで各チャンバーを2回優しく洗浄します。次に、バイオフィルム染色混合物を調製するために、生存率キットに用意されている各色素の1マイクロリットルを必要な溶液の各ミリリットルに加えて、溶液を混合します。最適な色素量と染色時間は、各生物について経験的に決定されます。
200マイクロリットルの染色混合物をチャンバー付きカバーガラスの各ウェルに加えます。カバーガラスをインキュベートします。インキュベーション後、染色混合物をチャンバーから取り出し、各ウェルを300マイクロリットルの滅菌PBSで洗浄します。
PBSを新しいメディアと交換します。最後に、共焦点顕微鏡による可視化を進めます。Burkholderia cepacia complex、またはBCC臨床分離株の代表的な画像は、培地のみまたは10%の喀痰濾液の存在下でチャンバーカバーガラスで48時間成長した後、それらの存在がバイオフィルムの構造を変えることができることを示しています。
画像はComstatソフトウェアで分析され、バイオフィルムの平均厚さ(10%の喀痰で処理した場合に増加した)など、主要なバイオフィルムパラメータを取得しました。バイオフィルムの成長に対するさまざまな要因の影響を理解するために、臨床分離株は培地のみまたは喀痰で増殖させ、抗生物質の有無にかかわらず治療しました。このビデオを見れば、チャンバーカバーガラス上にバイオフィルムを形成および処理する方法、および染色および共焦点分析の準備方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、スライドチャンバーモデルを用いて、痰および抗生物質に応答したバイオフィルム形成の可視化および定量化について解説します。このモデルにより、バイオフィルムの変化を直接観察することが可能となり、コンピューターソフトウェアを用いた詳細な解析が行えます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- バイオフィルム研究
- 抗生物質の有効性
背景
- バイオフィルムは微生物の複雑な共同体です。
- バイオフィルムの抗生物質に対する反応を理解することは、治療戦略において極めて重要です。
- 喀痰は、バイオフィルムに対する抗生物質の有効性に影響を及ぼす可能性があります。
- 本研究は、これらの相互作用を効果的に可視化することを目的としています。
研究目的
- 痰および抗生物質への曝露によるバイオフィルムの変化を可視化する。
- バイオフィルム形成に対する宿主因子の影響を定量化する。
- バイオフィルムに対する抗生物質の有効性についての理解を深める。
使用方法
- 喀痰サンプルの採取。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）による喀痰の希釈。
- 均質化のためのサンプルの混合。
- スライドチャンバーモデルを用いたバイオフィルム形成の可視化。
主な結果
- 抗生物質に反応するバイオフィルムの変化を直接的に可視化する。
- バイオフィルムのパラメータを定量的に分析する。
- 喀痰とバイオフィルム反応の相互作用に関する知見を得る。
- 異なる抗生物質の有効性を実証する。
結論
- スライドチャンバーモデルは、バイオフィルムのダイナミクスを研究するのに有効である。
- 喀痰などの宿主因子は、バイオフィルムの挙動に大きく影響する。
- この手法は、将来的な抗菌薬治療戦略に有用な知見を提供し得る。
よくある質問
産業界における重要性
宿主由来の喀痰および抗生物質が存在する条件下でのバイオフィルム形成の定量的可視化は、抗感染症薬の創薬およびトランスレーショナルモデルの忠実性における極めて重要な課題を解決します。このアプローチは、宿主因子が抗生物質の有効性とバイオフィルムの構造をどのように調節するかを明らかにすることで、メカニズム的なリスク低減を可能にし、初期段階のターゲット検証やスクリーニング戦略に有用な情報を提供します。本手法は、感染症研究開発におけるポートフォリオ決定に対する予測精度を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 宿主因子がバイオフィルムの耐性に及ぼす影響に関する治療仮説の検証を可能にします。
- 疾患に関連するマトリックス内での抗生物質に対するバイオフィルムの反応を定量化し、生物学的なリスク低減をサポートします。
- 規定の条件下でバイオフィルムの生存率と構造を測定することにより、機能的なターゲットバリデーションを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 臨床的に関連する因子の存在下で、後続の化合物スクリーニングに向けたバリデート済みバイオフィルムシステムを調製します。
- 再現性を確保し、実験群間で定量的な比較を行うために、アッセイ条件を標準化します。
- 信頼性の高い化合物評価のため、バイオフィルムの厚さや生存率などの堅牢で定量的なアウトプットを生成します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitro バイオフィルムモデルを疾患に関連する宿主環境に適合させ、トランスレーショナルな連続性を向上させます。
- 複雑な生物学的マトリックスにおける抗菌薬の性能を明らかにすることで、リスク調整された進展を支援します。
- 宿主・病原体・薬物の相互作用に関するメカニズム的な洞察を提供し、予測的なリスク低減を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このチャンバー付きカバーガラスモデルは、宿主模倣バイオフィルムシステムにおいて抗生物質の有効性を仮説に基づいて検証することを可能にし、基礎研究から前臨床試験への移行プロセスへと統合されます。
- 探索生物学： バイオフィルム形成における宿主因子の影響に関する仮説検証および経路の解明をサポートします。
- スクリーニング： バイオフィルム環境における化合物の優先順位付けのため、再現性と定量性のあるリードアウトを提供します。
- 分析： 条件間比較のための画像ベースの測定および統計的出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患関連のマトリックスを組み込むことで、in vitroでの知見を前臨床モデルへと橋渡しします。
- 企業での再利用： 抗バイオフィルム戦略を繰り返し評価するための、標準化され適応可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 抗感染症薬の研究開発における予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値： バイオフィルムアッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値： コンテキストに依存する薬剤有効性を明らかにすることで、go/no-go判断と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 宿主模倣システムにおける性能に基づいた、リスク調整後の候補物質の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- バイオフィルム培養、共焦点顕微鏡観察、および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- チャンバー付きカバーグラスシステム、生存率染色キット、およびComstatなどの解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- サンプル調製およびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 異なる細菌種やホスト由来のマトリックスに合わせて適応させる必要がある場合があります。
- 生物種ごとの染色およびイメージングパラメータの経験的な最適化に依存します。
