Name: チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学ぶバイオフィルムの可視化と定量化法。チェンカバーガラスモデルを用いて痰と抗生物質への応答を解析し、細菌バイオフィルムの動態と治療効果を評価する実験手法を習得できます。

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TBは、嚢胞性線維症、カナダからの研究フェローシップを認めています。

研究倫理委員会（REB）は、ヒト被験者から痰サンプルを収集し、保存するために必要なことに注意してください。これらの研究は、病気の子供REBの＃1000019444のために病院によって承認されました。 1.準備CF痰試料<ol><li>嚢胞性線維症の診療所へのルーチンの訪問中に、患者からの痰のサンプルを収集し、氷上に保ちます。 </li><li>処理を受けるために、研究室に、コレクションの最初の一時間以内に氷上に喀痰試料を輸送。 </li></ol> 2.喀痰処理<ol><li>得られた痰試料の体積を記録します。サンプル（ すなわち、2部PBS、1部の試料）の体積を2倍のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。 </li><li>トランスファーピペットでよくサンプルを混ぜます。 1分が完全に混合するための最高の設定にボルテックスのサンプルを。 </li><li>適切な数の1.5ミリリットルのマイクロチューブに小分けし、上記混合物の1ミリリットルをし、5,000×gでスピンダウン4℃で20分間。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、ペレットを捨てます。 </li><li>フィルタは、0.22μmフィルターを通して上清を殺菌し、清潔なマイクロ遠心チューブに集めます。 注：ろ液の無菌性は、LB寒天上にプレーティングし、液体培地に接種することによってテストされています。 </li><li>将来の使用のために-80℃で痰上清を保管してください。 注：複数の患者からの喀痰もろ過以下のプールすることができます。 </li><li>使用前に、所望のメディアに喀痰ろ液1/10 V / V（痰を100μl、メディアの900μl）を希釈します。 注記：ここでは、標準のLB培地（LB）培地を用いました。 </li></ol>バイオフィルム形成のための3チェンカバーガラス法<ol><li>振盪（200rpm）しながら37℃で、所望のメディアの関心を一晩の細菌分離株を成長させます。 注：別の細菌数を使用した、 緑膿菌 、 黄色ブドウ球菌の臨床分離株を含みます、バークホルデリア・セパシア錯体とアクロのxylosoxidans。媒体の選択は、目的の株および条件に依存し、しかしLB培地は、最初の実験のために使用することができます。 </li><li>一晩培養物から、新鮮な培地の4ミリリットル中に文化の40μlのを配置し、約0.5の600nmで（OD 600）での光学密度と文化を得るために、振盪（200rpm）しながら37℃で3-4時間成長-0.6。 </li><li> 10％の喀痰ろ液または（対照として）痰ろ液をせずに所望のメディアで1/5にステップ3.2からの培養を希釈します。痰ろ液の他の濃度を試験することができる（ すなわち、50％または100％）。 </li><li>スライドチャンバーのウェルを播種するために希釈液200μlを使用してください。 </li><li>細菌は振盪せずに37℃で4時間アタッチすることができます。 </li><li> 4時間後、メディアを取り出し、軽く1xの新鮮な培地でバイオフィルムを洗います。 200μlの新鮮な培地と交換してください。 注：バイオフィルム上の痰の効果を研究するために、FRES時間メディアは、痰上清を含める必要があります。 </li><li>バイオフィルムは、顕微鏡検査のための時間になるまで洗浄することなく、メディアごとに12時間を置き換え、振盪せずに37℃で、所望の時間のために成長することを可能にします。 注：バイオフィルムの抗生物質感受性に痰上清の効果を研究するためには、抗生物質は、バイオフィルムの成長の24時間後の培地に添加され、染色およびバイオフィルムの撮影まで培地中で維持されています。 </li></ol> 4.染色バイオフィルムと共焦点顕微鏡<ol><li>所望の成長時間（24〜48時間が最高の作品）に続いて、チャンバーウェルから培地を除去し、静かに無菌PBS300μlで2回チャンバーを洗います。 </li><li>必要なソリューションの各ミリリットルのための（生存率キットで提供される）各色素の1μLを混合することにより、バイオフィルムに対する染色混合物を準備します。水やメディア溶液中の色素を作ります。 注：水は、製造業者によって推奨されています。 </li><li>チャンバ型coverglaの各ウェルに染料混合物の200μLを追加ssは暗所で45分間、室温でインキュベートし、。 </li><li>室から染色混合物を削除し、滅菌PBS300μlで各ウェルを洗浄します。 PBSを削除し、新鮮な水やメディアと交換してください。 </li><li>共焦点顕微鏡を介したバイオフィルムの可視化を進めます。 </li></ol> 5.共焦点顕微鏡を用いてバイオフィルムの可視化<ol><li>すぐに（1時間以内）染色した後、チャンバ内の染色されたバイオフィルムをお読みください。一度に2 8ウェルチャンバーに1を染色することによって、スライドの可視化の遅れを最小限に抑えます。 </li><li>取得のための励起とフィルターのセットのためのレーザーで共焦点顕微鏡を用いて撮影を行います。 注：ここでは、スペクトルボレアリスレーザーとスピニングディスク共焦点システム（緑：491nm、赤：561 nm）と励起のために使用しました。 40分の515と40分の624の発光フィルターセットは、バイオフィルムの生存率キットから汚れを視覚化するために使用されました。 </li><li>カメラと共焦点顕微鏡で25X水対物レンズを用いて画像を撮影します。 </li><li&gt;を使用してZ-スタックバイオフィルムをモデル化します。 （一般的に48時間のバイオフィルムのための30から80ミクロンに及ぶ）、バイオフィルムの最後の合焦フレームに最初の合焦面から出発した画像ごとに0.5から1ミクロンを取ります</li><li>各ウェルから3-5画像を撮影します。 注：このように8よくチャンバーカバーガラスのために、24から40の画像が生成されます。 </li><li>分析のために画像を保存します。 注：画像は、犯罪統計システム18,19を用いて分析するOME-TIFFファイルとして保存する必要があります。バイオフィルムの画像解析の手順については、http://www.comstat.dk/で見つけることができます。画像がインポートされると、そのような各チャネル（赤と緑）の平均厚さは、バイオマスおよび表面被覆率などのパラメータを分析することができます。 </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
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<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
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<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
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<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

本明細書に記載される方法は、外因性生成物の存在下で増殖させた細菌性バイオフィルムの可視化を可能にします。このタイプのシステムを使用する場合に当然のことながら、exoproductsの生産が重要です。例えば、ジチオスレイトール（DTT）は、多くの場合、サンプルを液化するために役立つ人間の唾液サンプルに使用されています。しかし、単独でDTTの効果は、バイオフィルムの発達および生存度を低下させることができる（データは示さず）。このように、すべての条件のための適切なコントロールが必要です。さらに、ヒト痰製品の添加が原因で、各患者の痰がユニークなmicrobiomeを持っているという事実のために、実験に固有の変動を作成します。これを調整するために、我々は、患者の特定の結果を回避するために、プールされた唾液サンプルを使用しています。いずれのモデル系を使用する場合に加えて、適切なメディアの選択が重要です。意図された生物のバイオフィルムの成長のための標準的なメディアは、システムの初期セットアップのために推奨されています。実験の目的は、identをする場合外因性の製品は、バイオフィルム形成に影響を与えているかIFY、適切なバイオフィルム形成を提供して栄養...

細菌バイオフィルムは、互いに結合し、自己分泌マトリックスに包まれている微生物の基です。 1,2古典的には、それらが物理的に流れの条件の下で形成された非生物または生物の表面に付着した細菌を表します。バイオフィルムはまた、試験管内で形成された熱プールまたはペリクルの空気 - 液体界面でのような表面からの静的条件（流れの欠如）および遠位で成長することが示されています。これらのバイオフィルムは、長い環境で認識され、彼らは生物付着、腐食や閉塞が生じ、貯水池内またはパイプで形成することができるよう、産業プロセスへの主要な不利益であるされています。 3,4 彼らはカテーテル関連感染症、嚢胞性線維症の患者では、だけでなく、多数の他の感染症における肺感染症に関与することが示されているようにバイオフィルムは、また、医療現場で重要です。 5,6バイオフィルム感染症の特徴の一つは、デです抗生物質に対する細菌の感受性を折り目と自然免疫系によるクリアランスを損ないます。バイオフィルムベースの感染を伴う7-9で最もよく研究され、臨床的に関連するシナリオが慢性的に緑膿菌バイオフィルムに感染している嚢胞性線維症（CF）の患者に起こります。 緑膿菌は、それが非常に困難治療することを可能にする慢性感染症の確立中に変更の数を受けることができます。 10,11バイオフィルムは、示差的に先天性免疫を活性化し、炎症を駆動することができます。 12-14これらの感染症は、CF患者において増加罹患率および死亡率につながるように、この文脈では、バイオフィルム発達に影響を与えることができる因子を理解することが重要です。 最近の研究は、宿主因子が緑膿菌バイオフィルムの凝集体の形成に重要であることを示唆しています。 15これらのバイオフィルムは、抗生物質および宿主防御機構に対する感受性の低下に貢献しています。 presaの複数形CF肺中に存在する微生物から、このような好中球エラスターゼなどの宿主由来因子、ならびに分泌物のNCEは、大幅にバイオフィルム形成と発展を調節する可能性を秘めています。 16はまた、バイオフィルムは、多数の経路の発現を調節し、炎症を開始するためにホストと対話します。標準的なクリスタルバイオレットアッセイ等のハイスループット方法が、バイオフィルムの処理に関していくつかの情報を提供することができ、これらの因子に応答したバイオフィルムの可視化は、より詳細な情報を提供します。 本稿では、 インビトロでのバイオフィルムの発達を研究するためにCF患者の痰からの係数を使用する方法を記載しています。この方法は、市販のバイオフィルムの生存率キットを使用して痰を含む宿主因子に曝露されたバイオフィルムの迅速な可視化を可能にします。この技術は、視覚的にexogenoの存在下でのバイオフィルムの成長中に発生する変化を同定するために使用され得ます私たちの製品、および様々な条件下でのバイオフィルムの開発の変化を分析するための改良された方法を表しています。

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II チャンバーカバーガラス、#1.5 ホウケイ酸、8 ウェル</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>CFU カウントによる生存率の確認、または接種のためのコロニーの選択</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble software online</td><td></td><td>COMSTATは、バイオフィルム画像を解析するソフトウェアです。利用可能 www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>ミラーズ LB ブロス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12780-052</td><td>一晩のゴウス/バイオフィルム成長のための標準培地</td></tr><tr><td>Millex-GV シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGV013SL</td><td>喀痰スーパーナントのろ過</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (ダルベッコ A)</td> <td>オキソイド</td><td>BR0014G</td><td>培地除去後のバイオフィルムチャンバーの洗浄</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浜松 C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スペクトラルボレアリス</td><td>Qsテクノロジーズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーキン・エルマー・ヴォロシティ</td><td>QSテクノロジーズ株式会社</td><td></td><td>このソフトウェアの手順については、次のURLを参照してください http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

バイオフィルムは、自己分泌マトリックスに包まれた細菌のグループで構成されています。彼らは、工業汚染だけでなく、多くの健康に関連する感染症の発症と持続に重要な役割を果たしています。ヒトの疾患の中で最もよく説明し、研究バイオフィルムの一つは、嚢胞性線維症患者の慢性肺感染症で発生します。ホストのコンテキストでバイオフィルムを研究すると、多くの要因は、バイオフィルム形成と発展に影響を与えることができます。宿主因子はバイオフィルムの形成及び発達に影響を与えることができる方法を同定するために、我々は、痰上清の形で宿主由来因子の存在下でバイオフィルムを成長させるために、静的チェンカバーガラスの方法を使用しました。細菌は、チャンバーに播種し、痰ろ液にさらされています。成長の48時間後に、バイオフィルムは、共焦点顕微鏡および分析の前に商業バイオフィルムの生存率キットで染色されています。画像取得後、バイオフィルムの特性は、異なるソフトウェア・プラットフォームを用いて評価することができます。この方法は、私たちは、抗生物質などの異なる物質の存在下でのバイオフィルムの成長の重要な特性を視覚化することができます。

実験の全体的な設計は、図1に示されています。このプロトコルの使用は、異なる時間（ 例えば、24、48または72時間）増殖させたバイオフィルムの変化を視覚化するための便利な方法を提供します。重要なことには、例えば、痰濾液ような外因性シグナルは、バイオフィルムの発達の変化を視覚化するために添加することができます。 図2に見られるように、10％の痰濾液の存在がバイオフィルム（ 図2A、下のパネル）のアーキテクチャを変更することができます。 16これらの画像は、バイオフィルムの平均厚さ、総バイオマスおよび表面被覆を含む主要なバイオフィルムマトリックスを得るために犯罪統計システムソフトウェアを用いて分析することができます。これは、バイオフィルムの厚さの全体的な増加（ 図2B、および3）に反映されます。プレゼンス喀痰中のバイオフィルムに対する抗生物質の16...

このプロトコルは、スライドチャンバーモデルを使用して、宿主因子への曝露後のバイオフィルムの発達の可視化を説明しています。このモデルにより、バイオフィルムの現像を直接可視化するだけでなく、コンピュータソフトウェアプログラムを使用してバイオフィルムのパラメータを解析することができます。

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

本手順の目的は、痰および抗菌薬に反応して生じるバイオフィルムの変化を可視化し、定量することです。この手法を用いることで、細菌バイオフィルムに対するさまざまな抗菌薬の有効性が、痰の存在によってどのように影響を受けるかといった重要な課題を解明することが可能です。本手法の主な利点は、さまざまな要因に反応してバイオフィルムに起こる変化を視覚的に確認できる点にあります。実験を開始する前に、あらかじめ採取した喀痰サンプルの量を確認し、記録します。サンプルの2倍量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。次に、トランスファーピペットを用いてサンプルを十分に混合します。最高設定で1分間ボルテックスし、試料を完全に混合させます。混合液1 mLを1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに分注し、その後、チューブをスピンダウンさせます。遠心分離後、上清を回収し、ペレットを廃棄します。上清を0.22 micronフィルターでろ過滅菌し、清潔なマイクロ遠心チューブに回収します。回収した痰の上清は、今後の使用に備えて80 degrees Celsiusで保存します。あらかじめ調製した培養液40 µLを、4 mLの新鮮なLuria broth（またはLB培地）に加え、600 nmにおける光学密度（OD）が0.55になるまで細菌を培養します。次に、OD 0.5の培養液100 µLを、LBで調製した10%喀痰ろ過液400 µLで希釈します。この希釈液200 µLを用いて、スライドチャンバーのウェルに播種します。37 °Cで4時間、振盪せずに細菌を接着させます。4時間後、培地を除去し、バイオフィルムを1Xの新鮮なLBで緩やかに洗浄します。残りの培地を200 µLの新鮮なLBに交換します。バイオフィルムを37 °Cで振とうせずに培養します。顕微鏡観察の準備が整うまで、洗浄せずに12時間ごとに培地を交換してください。付着している細菌を剥離させないよう、スライドを緩やかに洗浄することが非常に重要です。培養後、チャンバーウェルから培地を除去し、各チャンバーを300 µLの滅菌PBSで2回静かに洗浄します。次に、バイオフィルム染色液を調製するため、必要量1 mLあたりの溶液に、生存率判定キットに含まれる各染料を1 µLずつ加え、混合します。染料の最適量および染色時間は、各微生物に対して経験的に決定します。染色混合液200 µLをチャンバー付きカバーガラスの各ウェルに加えます。カバーガラスをインキュベートします。インキュベート後、チャンバーから染色混合液を除去し、各ウェルを300 µLの滅菌PBSで洗浄します。PBSを新鮮な培地で置換します。最後に、共焦点顕微鏡を用いて視覚化を行います。培地のみ、または10%の喀痰ろ過液が存在する条件下で、チャンバー付きカバーガラス内で48時間培養したBurkholderia cepacia complex（BCC）臨床分離株の代表的な画像から、喀痰ろ過液の存在がバイオフィルムの構造を変化させ得ることが示されています。画像はComstatソフトウェアで解析し、主要なバイオフィルムパラメータを算出しました。その結果、10% sputumで処理した際にバイオフィルムの平均厚が増加しました。さまざまな要因がバイオフィルムの増殖に及ぼす影響を評価するため、臨床分離株を培地のみ、またはsputum添加培地で培養し、それぞれ抗生物質による処理を行うか行わないかの条件で比較しました。このビデオを視聴することで、チャンバー付きカバーガラス上でのバイオフィルムの形成と処理、および染色と共焦点解析に向けた準備方法について十分に理解できるはずです。

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本論文では、成長の異なる方法を説明します...

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

この記事では、8ウェルチャンバースライドの中で成長細菌バイオフィルムの形成と可視化のための手順を説明します...

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

出典: Beaudoin, T. ほか。チャンバー付きカバーグラスモデルを用いた、バイオフィルム発生に対する喀痰の影響の可視化。 J. Vis.

in vitro細菌バイオフィルム形成のためのチャンバー付きカバーグラス法

出典: Beaudoin, T. ほか。 チャンバー付きカバーグラスモデルを用いた、バイオフィルム発生に対する喀痰の影響の可視化。 J. Vis. Exp. (2016年)このビデオでは、患者由来の嚢胞性線維症痰が細菌バイオフィルム形成にどのように影響するかを評価する in vitro...

嚢胞性線維症患者の痰を濾過した細菌バイオフィルムの共焦点イメージング

多孔質媒体を模倣したマイクロ流体デバイスでのバイオフィルム形成の研究のためのプロトコルが議論されています。マイクロ流体デバイスは、一連のマイクロピラーで構成されており、このデバイスではPseudomonas...

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

この研究は、バイオフィルム阻害剤とそのBacillus...

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

粘液は、嚢胞性線維症の気道を差し込ま（CF）の患者は、微生物病原体が繁栄するための理想的な環境です。原稿は、彼らが病気を引き起こし、どのように化学的条件の変化は、微生物のダイナミクスを駆動することができ模倣環境でCF肺microbiomeを研究するための新規な方法を説明します。...

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ...

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

アセンブリ操作について述べる、流下しながらリアルタイムで画像菌バイオ フィルム形成に設計フロー装置のクリーニングします。我々...

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。...

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

学ぶバイオフィルムの可視化と定量化法。チェンカバーガラスモデルを用いて痰と抗生物質への応答を解析し、細菌バイオフィルムの動態と治療効果を評価する実験手法を習得できます。

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

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